CC BY
36
УДК 575.174.015.3:636.5
Влияние различных рационов кормления
на ассоциацию полиморфизма в гене MSTN и роста живой массы у молодняка петушков пушкинской породы
Митрофанова Ольга Викторовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики e-mail: mo1969@mail.ru
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства -ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
Дементьева Наталия Викторовна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики e-mail: dementevan@mail.ru
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства -ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
Аннотация. Проанализировано влияние различных рационов кормления на скорость роста петушков пушкинской породы в зависимости от генотипа по замене rs313744840 в гене миостатина. У петушков, выращенных на бройлерном корме (n = 52), наибольшими привесам отличались гетерозиготы AG, которые начали достоверно (p<0,05) отличаться от своих сверстников с 14 дня жизни. У петушков, выращенных на кормах для молодняка несушек (n=46), преимуществом в росте обладали гомозиготы АА, но различия между группами оказались недостоверными. При сравнении особей с гетерозиготным генотипом AG по замене rs313744840 в гене MSTN петушки, выращиваемые на бройлерных кормах, достоверно превосходили по показателям живой массы своих сверстников практически в течение всего периода наблюдения.
Ключевые слова: петушки, пушкинская порода, живая масса, миостатин, ПЦР-ПДРФ, полиморфизм, ДНК.
Изучение полиморфизма генов, влияющих на рост и развитие сельскохозяйственной птицы, является важным направлением современной генетики. Мясо кур составляет существенную долю в ежедневном рационе современного человека, поскольку является источников необходимых белков, аминокислот, микроэлементов и витаминов.
В последнее время актуальны исследования, направленные на поиск взаимосвязей между полиморфизмами отдельных генов, отвечающих за развитие мышечной и костной массы, и продуктивными характеристиками кур.
Ген миостатина у высших позвоночных способствует выработке одноименного белка, который, в свою очередь, оказывает отрицательное влияние на развитие мускулатуры [1]. Если путь от гена MSTN к мышцам блокируется, происходит их усиленный рост. Мутации, приводящие к изменениям последовательности ДНК в различных участках гена MSTN, встречаются у ряда животных. У высших позвоночных MSTN тканеспецифичен, его синтез происходит в скелетных мышцах, на которые он и оказывает биологические эффекты [2, 3].
Нуклеотидная последовательность гена миостатина полностью прочитана, а также известно, что этот ген включает в себя три экзона и два интрона [4]. Сейчас особое внимание уделяется обнаружению однонуклеотидных замен (SNP) в смысловых участках миостатинового гена, для того чтобы выявить их ассоциации с признаками продуктивности [5, 6].
Целью нашей работы было определить ассоциацию типа кормления со скоростью роста петушков пушкинской породы в зависимости от генотипа по замене rs313744840 в гене миостатина.
Материал и методы исследования
В качестве материала для исследования послужила ДНК, которая была выделена в крови петушков фенольным методом с использованием протеиназы К.
Каждый цыпленок при рождении был помечен индивидуальной меткой. В зависимости от типа кормления были сформированы 2 группы птицы. Первая (n = 52) выращивалась на корме, предназначенном для откорма бройлерного молодняка (корм ПК-5, производство Тосненского комбикормового завода) до возраста 63 дня. Вторая группа (n=46) росла на корме для молодняка кур-несушек (ПК-4, производство ТККЗ). И тот и другой комбикорм являются полнорационными кормами. В корме ПК-5 отмечено повышенное содержание протеина (до 20%) и обменной энергии (до 310 ккал в 100 г корма).
Для определения живой массы петушков взвешивали на весах марки «Госметр». Птица, выращиваемая на кормах для бройлеров, взвешивалась при рождении, в 7, 14, 21, 34, 40, 49, 56, 63 и 70 дней. Птица, выращиваемая на кормах для кур-несушек, взвешивалась при рождении, в 7, 14, 21, 34, 40, 49, 56, 63 и 90 дней.
Определение генотипов по замене rs313744840 в гене миостатина проводили методом полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией. Для проведения ПЦР использовали праймеры следующего состава: прямой 5'-aac-caa-tcg-tcg-gtt-ttg-ac-3> и обратный 5>-cgt-tct-ctg-tgg-gct-gac-ta-3> [5]. С их помощью ам-плифицировали один участок экзона 1 миостатинового гена (AF346599). Продукты амплификации подвергали обработке ферментом рестрикции HpalI, разрезающим ДНК в определенной точке в положении rs313744840. В этом месте гена миостатина происходит однонуклеотидная замена G/A.
ПЦР осужествляли на амплификаторе «BioRad» (США) с использованием ре-
акционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl pH 8,6, 2,5 мМ MgCl2, 16,6 мМ NH4OH, 0,125 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров, 50-100 нг геномной ДНК и 2,5 ед Taq-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск). Общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Весь процесс включал в себя 35 циклов, состоящих из повторяющихся этапов денатурации ДНК (30 сек, 94°С), отжига праймеров (30 сек, 60°С) и элонгации (30 сек, 72°С).
Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в горизонтальном 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в течение 1 часа при рабочем напряжении 7,5 В/см в ТВЕ буфере (45 мМ трис-борат, 1 мМ ЭДТА). В качестве маркера, который определяет длину полученных в ходе реакции фрагментов ДНК на геле, использовали pUC19/MspI (Thermo Fisher Scientific). Сигнал фотографировали в системе гель-документации фирмы Кодак.
Средние показатели живой массы по группам птицы, а также достоверность разницы между группами определялась с помощью программы SigmaPlot.
Результаты исследования
У петушков, выращенных на бройлерном корме, наибольшими привесам отличались гетерозиготы AG по замене rs313744840 в гене MSTN (табл. 1). Причем они начали достоверно (p<0,05) отличаться от своих сверстников с генотипами AA и GG уже с 14-дневного возраста. Значительные отличия наблюдались между гетерозиготами AG и гомозиготами GG к возрасту 63 дней.
Достоверные отличия отмечены и между петушками AG и гомозиготами АА, хотя в этом случае преимущество гетерозигот не было выражено так ярко.
Таблица 1. Живая масса в разные периоды жизни петушков пушкинской породы, выращенных на кормах для бройлеров, в зависимости от генотипа по замене rs313744840 в гене миостатина (1,2 - группы, разница между которыми достоверна, p<0,05)
Возраст Живая масса (г) в зависимости от генотипа по rs313744840 в гене MSTN P
цыпленка АА (n = 13) AG (n = 30) GG (n=9)
Первые сутки 40,627±0,985 40,797±1,015 41,063±0,720 0,539
7 дней 68,907±1,7992 70,200±1,3291,2 61,956±2,1411 0,013
14 дней 127,000±4,5412 128,014±2,8221,2 109,563±3,8731 0,009
21 день 221,679±7,2582 226,257±5,1621,2 190,667±6,6551 0,004
28 дней 335,143±10,2622 345,855±7,9341,2 291,389±8,8511 0,003
34 дня 480,500±13,1882 492,323±9,2841,2 417,222±13,7141 <0,001
40 дней 665,929±16,3262 670,484±11,4941,2 586,500±21,2491 0,003
49 дней 928,571±22,2602 937,452±14,6511,2 812,111±27,1131 <0,001
56 дней 1064,077±23,5862 1048,815±19,5701,2 923,667±33,3531 0,003
Возраст Живая масса (г) в зависимости от генотипа по ^313744840 в гене MSTN р
цыпленка АА (п = 13) AG (п = 30) GG (п=9)
63 дня 1272,583±25,8572 1241,692±23,1051,2 1116,125±38,5471 0,008
70 дней 1387,667±39,7932 1389,760±36,2591,2 1151,125±56,2691 0,003
У петушков, выращенных на обычном корме, гомозиготы АА превосходили сверстников по живой массе до возраста 56 дней (различия не достоверны) (табл. 2). В этот период «лучшими» по живой массе оказались гетерозиготы AG (среднее значение по группе составило 1067,444±31,055г). Они же и сохранили преимущество в живой массе до конца периода наблюдений, хотя от сверстников с генотипом GG практически не отличались.
К возрасту 90 дней петушки с генотипом АА (п = 7) существенно отстали от сверстников. Средняя живая масса особей этой группы составила 1509,000±48,022 г. Гетерозиготы AG (п = 18) в этом возрасте весили в среднем 1631,889±53,539 г, а гомозиготы GG (п=17) - 1629,824±60,847 г. Наблюдаемые различия не достоверны. Группы с разными генотипами отличаются разнообразием по живой массе, о чем говорит большое значение стандартной ошибки.
Таблица 2. Живая масса в разные периоды жизни петушков пушкинской породы, выращенных на кормах для несушек, в зависимости от генотипа по замене ^313744840 в гене миостатина
Признак Живая масса (г) в зависимости от генотипа по ^313744840 в гене MSTN 0,794
АА (п = 7) AG (п = 21) GG (п = 18)
Первые сутки 41,929±0,222 41,919±0,525 43,426±2,604
7 дней 69,2000±4,302 66,167±1,474 65,379±1,660 0,537
14 дней 123,143±7,526 118,286±3,878 115,833±3,690 0,639
21 день 218,250±14,224 213,810±7,074 210,553±7,039 0,867
28 дней 332,357±13,650 319,925±9,579 323,632±9,853 0,800
34 дня 467,500±16,049 447,643±12,740 459,105±13,792 0,680
40 дней 631,143±15,670 604,286±16,751 622,684±15,971 0,584
49 дней 884,167±24,504 866,429±22,262 881,474±19,920 0,845
56 дней 1006,857±15,893 1067,444±31,055 1064,278±29,109 0,490
63 дня 1228,143±31,943 1309,889±43,032 1306,118±48,174 0,561
90 дней 1509,000±48,022 1631,889±53,539 1629,824±60,847 0,434
При сравнении петушков с гетерозиготным генотипом AG по замене гб313744840
в гене MSTN, выращенных на разном типе корма можно отметить, что петушки, выращиваемые на бройлерных кормах, достоверно превосходили по показателям живой массы своих сверстников практически в течение всего периода наблюдения (табл. 3).
Таблица 3. Сравнительный анализ динамики роста живой массы у петушков пушкинской породы с генотипом АG по замене ^313744840 в гене МБТЫ, выращенных на различных кормах
Возраст цыпленка Живая масса (г) петушков с генотипом АG по ^313744840 в гене MSTN Значение ^критерия Стьюдента
выращенных на корме для молодняка кур-несушек (п=30) выращенных на корме для бройлеров (п=21)
Первые сутки 40,797±1,015 41,919±0,525 0,98
7 дней 70,200±1,329 66,167±1,474 2,03(р<0,05)
14 дней 128,014±2,822 118,286±3,878 2,03(р<0,05)
21 день 226,257±5,162 213,810±7,074 1,42
28 дней 345,855±7,934 319,925±9,579 2,08 (р<0,05)
34 дня 492,323±9,284 447,643±12,740 2,83 (р<0,05)
40 дней 670,484±11,494 604,286±16,751 3, 26 (р<0,05)
49 дней 937,452±14,651 866,429±22,262 2,66 (р<0,05)
56 дней 1048,815±19,570 1067,444±31,055 0,51
Влияние кормления на рост и развитие молодняка различных видов животных, в том числе и сельскохозяйственной птицы, сложно переоценить. При несбалансированном или недостаточном кормлении организм просто не получит необходимый строительный материал для формирования органов и тканей. И, кроме того, не будет раскрыт генетический потенциал животного.
Пушкинская порода кур является породой мясо-яичного направления продуктивности. Курочки этой породы - хорошие несушки, а достаточное количество мяса можно получить и от курочек, и от петушков. Это делает представителей пушкинской породы привлекательными для птицеводов-любителей [7]. Комбинированная продуктивность и высокое генетическое разнообразие позволили использовать эту птицу как модельный объект для научных исследований [8].
Работа гена миостатина MSTN обусловливает формирование мышечной массы у высших позвоночных животных и птиц. Продуктом гена является белок миоста-тин, который подавляет рост мышечной массы в организме, а также обусловливает дифференцировку мышц. Он выступает в качестве негативного регулятора массы скелетных мышц и действует по принципу обратной связи. С увеличением массы мышц возрастает и секреция миостатина, что тормозит дальнейший рост мускулатуры [1].
Спонтанные мутации, которые приводят к уменьшению количества миостатина и/или подавляют его функции, обнаружены как у человека, так и у сельскохозяйственных животных и птиц. К настоящему времени выявлено множество
однонуклеотидных замен в гене MSTN, влияющих на скорость роста, показатели воспроизводства, а также состав мяса и его качество [4, 9]. В различных породах овец, свиней, собак и кур определены мутации в некодирующих регуляторных областях, что влияет на уровень экспрессии MSTN, а, следовательно, на рост и объём мышечной массы [10-12]. Изучалось влияние SNP в этом гене на живую массу в различных условиях выращивания и смертность цыплят [5].
Взаимосвязь между живой массой кур и петухов различных пород и заменой A>G в положении rs313744840 в гене миостатина наблюдалась и ранее [6, 9]. Показано, что особи, несущие аллель А по этой замене, обладали повышенной скоростью роста.
В проведенном исследовании среди петушков, выращенных на бройлерных кормах, преимуществом в росте обладали гетерозиготные особи с генотипом AG (см. табл. 1). В случае, когда молодняк рос на кормах для несушек, петушки с генотипом АА превосходили по живой массе сверстников (см. табл. 2). Можно предположить, что у гетерозигот AG по изучаемой замене есть значительный потенциал для роста, который не всегда может быть реализован в полной мере на кормах для молодняка кур-несушек. В то же время гетерозиготы по замене rs313744840 в гене MSTN, выращенные на кормах для бройлеров превосходили своих сверстников, выращенных на обычном корме (см. табл. 3).
Данное исследование выполнено при финансовой поддержке ФАНО России в рамках ГЗ АААА-А18-118021590138-1 с использованием популяций кур из биоресурсной коллекции ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург - Пушкин).
Выводы
У петушков, выращенных на бройлерном корме, наибольшими привесам отличались гетерозиготы AG. Причем они начали достоверно (p<0,05) отличаться от своих сверстников с генотипом GG уже с 14-дневного возраста.
У петушков, выращенных на корме для выращивания несушек, гомозиготы АА превосходили сверстников по живой массе до возраста 56 дней (различия не достоверны).
Среди петушков старше 56 дней, выращенных на обычном корме, «лучшими» по живой массе оказались гетерозиготы AG (среднее значение по группе составило 1067,444±31,055г). Они же и сохранили преимущество в живой массе до конца периода наблюдений, хотя от сверстников с генотипом GG практически не отличались.
К возрасту 90 дней петушки с генотипом АА (n = 7) существенно отстали от сверстников. Средняя живая масса особей этой группы составила 1509,000±48,022 г. Гетерозиготы AG (n = 21) в этом возрасте весили в среднем 1631,889±53,539 г, а гомозиготы GG (n=18) - 1629,824±60,847 г. Наблюдаемые различия не достоверны. Группы с разными генотипами отличаются разнообразием по живой массе, о чем говорит большое значение стандартной ошибки.
У петушков быстрее росли особи с гетерозиготным генотипом AG по замене rs313744840 в гене MSTN. При этом петушки, выращиваемые на бройлерных кормах, достоверно превосходили по показателям живой массы своих сверстников практически в течение всего периода наблюдения.
Использование корма с повышенным содержанием протеина и обменной энергии позволяет реализовать генетический потенциал птицы.
Список литературы:
1. Lee S. J. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol., 2004, vol.20, pp. 61-86.
2. Yang S., Li X., Liu X., Ding X., Xin X., Jin C., Zhang S., Li G., Guo H.. Parallel comparative proteomics and phosphoproteomics reveal that cattle myostatin regulates phosphorylation of key enzymes in glycogen metabolism and glycolysis pathway. Oncotarget, 2018, vol.9, no. 13, pp. 11352-11370.
3. Wang H., Gu X., Li W., Zhang X., Cui L., Li Y., Zhang Y., Zhao B., Li K.. CARP, a myostatin-downregulated gene in CFM cells, is a novel essential positive regulator of myogenesis. International Journal of Biological Sciences, 2014, vol.10, no. 3, pp. 309320.
4. Baron E.E., Wenceslau A.A., Alvares L.E., Nones K., Ruy D.C., Schmidt G.S., Zanella E.L., Coutinho L.L., Ledur M.C. High level of polymorphism in the myostatin chicken gene. Proc. 7th World Congr. Genet. Appl. Livest. Prod. Montpellier, France, 2002, pp. 19-23.
5. Bhattacharya T. K., Chatterjee R. N. Polymorphism of the myostatin gene and its association with growth traits in chicken. Poultry Science, 2013, vol. 92, no.4, pp. 910-915.
6. Mitrofanova O. V., Dement'eva N. V., Krutikova A. A., Yurchenko O. P., Vakhrameev A. B., Terletskiy V.P. Association of polymorphic variants in MSTN, PRL, and DRD2 genes with intensity of young animal growth in Pushkin breed chickens. Cytology and Genetics, 2017, vol. 51, no. 3, pp. 179-184.
7. Юрченко, О.П. Гетерогенный подбор при разведении пушкинской породы кур / О.П. Юрченко, А.В. Макарова, А.Б. Вахрамеев // Генетика и разведение животных. - 2017. - № 3. - С. 51-57.
8. Дементьева, Н.В. Полиморфизм однонуклеотидных замен в гене GDF-8 у кур генофондных пород / Н.В. Дементьева, О.В. Митрофанова, С.А. Шабанова // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2015. - № 38. - С. 59-62.
9. Dementyeva N. V., Mitrofanova O. V., Tyshchenko V. I., Terletskiy V. P., Yakovlev A. F.. The rate of weight gain and productivity of a chicken broiler cross with various polymorphic types of the myostatin gene. Russian Journal of Genetics: Applied Research, 2017, vol.7, no. 1, pp. 1-5.
10. Hu W., Chen S., Zhang R., Yushuang L. Single nucleotide polymorphisms in the upstream regulatory region alter the expression of myostatin. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal., 2013, vol. 49, pp. 417-423.
11. Wang J., Zhou H., Hu J., Li S., Luo Y. Two single nucleotide polymorphisms in the promoter of the ovine myostatin gene (MSTN) and their effect on growth and carcass muscle traits in New Zealand Romney sheep. J Anim Breed Genet., 2016, vol.133, no 3, pp. 219-226.
12. Mosher D.S., Quignon P., Bustamante C.D., Sutter N.B., Mellersh C.S., Parker H.G., Ostrander E.A. A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs. PLoS Genet., 2007, vol.3, no.5, pp. 79.
References:
1. Lee S. J. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol., 2004, vol.20, pp. 61-86.
2. Yang S., Li X., Liu X., Ding X., Xin X., Jin C., Zhang S., Li G., Guo H.. Parallel comparative proteomics and phosphoproteomics reveal that cattle myostatin regulates phosphorylation of key enzymes in glycogen metabolism and glycolysis pathway. Oncotarget, 2018, vol.9, no. 13, pp. 11352-11370.
3. Wang H., Gu X., Li W., Zhang X., Cui L., Li Y., Zhang Y., Zhao B., Li K.. CARP, a myostatin-downregulated gene in CFM cells, is a novel essential positive regulator of myogenesis. International Journal of Biological Sciences, 2014, vol.10, no. 3, pp. 309320.
4. Baron E.E., Wenceslau A.A., Alvares L.E., Nones K., Ruy D.C., Schmidt G.S., Zanella E.L., Coutinho L.L., Ledur M.C. High level of polymorphism in the myostatin chicken gene. Proc. 7th World Congr. Genet. Appl. Livest. Prod. Montpellier, France, 2002, pp. 19-23.
5. Bhattacharya T. K., Chatterjee R. N. Polymorphism of the myostatin gene and its association with growth traits in chicken. Poultry Science, 2013, vol. 92, no.4, pp. 910-915.
6. Mitrofanova O. V., Dement'eva N. V., Krutikova A. A., Yurchenko O. P., Vakhrameev A. B., Terletskiy V.P. Association of polymorphic variants in MSTN, PRL, and DRD2 genes with intensity of young animal growth in Pushkin breed chickens. Cytology and Genetics, 2017, vol. 51, no. 3, pp. 179-184.
7. Yurchenko O.P., Makarova A.V., Vakhrameev A.B. Heterogeneous selection in the process of breeding chickens of Pushkin breed. Genetika i razvedenie zhivotnykh [Genetics and Breeding of Animals], 2017, no. 3, pp. 51-57 (in Russian).
8. Dementeva N.V., Mitrofanova O.V. , Shabanova S.A. Polymorphism of single nucleotide substitutions in GDF-8 gene of gene pool chicken breeds. Izvestiya Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Proceedings of the St. Petersburg State Agrarian University], 2015, no. 38, pp. 59-62 (in Russian).
9. Dementeva N. V., Mitrofanova O. V., Tyshchenko V. I., Terletskiy V. P., Yakovlev A. F.. The rate of weight gain and productivity of a chicken broiler cross with various polymorphic types of the myostatin gene. Russian Journal of Genetics: Applied Research, 2017, vol.7, no. 1, pp. 1-5.
10. Hu W., Chen S., Zhang R., Yushuang L. Single nucleotide polymorphisms in the upstream regulatory region alter the expression of myostatin. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal., 2013, vol. 49, pp. 417-423.
11. Wang J., Zhou H., Hu J., Li S., Luo Y. Two single nucleotide polymorphisms in the promoter of the ovine myostatin gene (MSTN) and their effect on growth and carcass muscle traits in New Zealand Romney sheep. J Anim Breed Genet., 2016, vol.133, no 3, pp. 219-226.
12. Mosher D.S., Quignon P., Bustamante C.D., Sutter N.B., Mellersh C.S., Parker H.G., Ostrander E.A. A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs. PLoS Genet., 2007, vol.3, no.5, pp. 79.
Influence of various diets on association of polymorphism in MSTN gene and live weight increase in young cockerels of pushkin breed
Mitrofanova Olga Viktorovna, Candidate of Sciences (Biology), senior researcher of Laboratory of Molecular Genetics
e-mail: mo1969@mail.ru
Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding — Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry
Dement'eva Nataliya Viktorovna, leading researcher of Laboratory of Molecular Genetics
e-mail: dementevan@mail.ru
Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding — Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry
Abstract. The effect of different diets on the growth rate of Pushkin breed cockerels depending on the genotype in substitution of rs313744840 in the myostatin gene has been analyzed. In cockerels grown on feed for broilers (n = 52) the AG heterozygotes have had the biggest weigh gain, which began to differ significantly (p <0.05) from their peers from the 14th day of life. In cockerels grown on feed for young laying hens (n = 46) the AA homozygotes have had an advantage in growth, but the difference between the groups has proved to be unreliable. Individuals grown on feeds for broilers with the heterozygous AG genotype in substitution of rs313744840 in the parsley MSTN gene have exceeded the live weight of their peers practically during the entire observation period.
Keywords: cockerels, Pushkin breed, live weight, myostatin, PCR-RFLP, polymorphism, DNA.
