CC BY
29
6. Хохрин С.Н., Волкова И.И. Синдром метаболической усталости кур-несушек в период интенсивной яйцекладки //Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета.- 2014. -№35. - С.88-93.
7. Царенко П.П. Оценка качества яиц по биофизическим показателям //Повышение качества продуктов птицеводства. - М.: Колос - 1983. - С.120-123.
8. Пристач Н.В., Пристач Л.Н. Эффективность применения солей янтарной кислоты в кормлении птицы // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2012 .- № 26. -С. 121-125.
УДК 575.116.4:575.2 Канд. биол. наук Н.В. ДЕМЕНТЬЕВА
(ФГБНУ ВНИИГРЖ, [email protected]) Канд. биол. наук О.В. МИТРОФАНОВА (ФГБНУ ВНИИГРЖ, [email protected]) Канд. с.-х. наук С.А. ШАБАНОВА (СПбГАУ, [email protected])
ПОЛИМОРФИЗМ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ГЕНЕ GDF-8 У КУР ГЕНОФОНДНЫХ ПОРОД
вБР-8, ПЦР-ПДРФ, куры, полиморфизм,
Исследования особенностей генетической гетерогенности пород и популяций кур на основе полиморфизма ДНК стали особенно популярны в последнее десятилетие [1, 2, 8]. Все чаще появляются работы, направленные на поиск однонуклеотидных замен (8КР) в кодирующей части отдельных генов с целью обнаружения их сцепления с хозяйственно-полезными признаками. Это связано с тем, что скорость роста очень важна в птицеводстве из-за ее высокой экономической ценности. Поэтому большой интерес наблюдается и к изучению гена миостатина [6, 8, 9].
Белок миостатин известный также как фактор-8 роста и дифференцировки (GDF-8) оказывает влияние на массу скелетных мышц посредством ее негативного регулирования [5]. Он относится к группе трансформирующих Р-факторов роста (TGF-P). Впервые ген миостатина MSTN обнаружили у мышей [3], а затем - у крупного рогатого скота в качестве гена, ответственного за двойную мускулатуру [4].
У кур ген MSTN состоит из трех экзонов и двух интронов. Первый, второй и третий экзоны содержат 373, 374 и 1567 пар нуклеотидов соответственно. В различных участках этого гена были найдены однонуклеотидные замены, отличающиеся по частоте встречаемости у различных популяций кур [7].
Основная цель настоящей работы - проанализировать ДНК кур у ряда генофондных пород ФГУП «Генофонд» на наличие однонуклеотидных замен в гене миостатина, определить частоты встречаемости различных генотипов и аллелей. В случае обнаружения полиморфизма по 8КР можно использовать этот аллель в дальнейшей работе для поиска связей с хозяйственно-полезными признаками.
Материалом для работы послужила ДНК, выделенная из крови кур и петухов ФГУП «Генофонд».
Для анализа были взяты породы кур различного направления продуктивности: яичного, мясо-яичного и мясного.
Птица яичного направления продуктивности представлена русской белой породой, популяцией русской белоснежной ВНИИГРЖ (п=8).
Породы мясо-яичного типа представлены пушкинской (п=163), юрловской голосистой (п=273) и узбекской бойцовой (п=12) генофондными популяциями птицы.
Мясное направление продуктивности представлено двумя декоративными «тяжелыми» породами брама (п=12) и кохинхин (п=12), а также промышленной линией корнишей.
Кровь отбирали из подкрыльцовой вены в микропробирку, содержащую в качестве антикоагулянта 1 каплю 200 мМ ЭДТА. До использования образцы хранили в холодильнике при -20оС.
ДНК выделяли по стандартной методике, с использованием протеиназы К («Сибэнзим», Новосибирск) и фенола.
Для типирования были выбраны две пары праймеров: MSTpr (прямой 5'-AAC-CAA-TCG-TCG-GTT-TTG-AC-3 ', обратный 5'-CGT-TCT-CTG-TGG-GCT-GAC-TA-3') и MSTexi (прямой 5'-TAG-TCA-GCC-CAC-AGA-GAA-CG-3', обратный 5'-CGA-AAG-CAG-CAG-GGT-TGT-TA-3 '). С их помощью амплифицировали два участка экзона 1 миостатинового гена (AF346599). Продукты амплификации обрабатывали с помощью рестриктаз HpalI и HinPII (Thermo). В результате были найдены две однонуклеотидные замены (SNP). Это замена G/A в положении 2109 и замена G/C в положении 2244 миостатинового гена.
Для осуществления полимеразной цепной реакции готовили смесь из следующих компонентов: 67 тМ трис -HCl pH 8,6, 2,5 mM MgCl2, 16,6 mM NHOH, 0,125 мМ каждого из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,5 мкМ праймера, 50-100 нг геномной ДНК и 2,5 ед Taq-полимеразы ("Сибэнзим", Новосибирск). Общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл.
Реакцию проводили на амплификаторе «Biorad» (США). Использовали режим, состоящий из 35 циклов: 30 сек - 94оС, 30 сек - 60оС, 30 сек - 72оС. Для рестрикции в пробирку добавляли 0,5 мкл необходимой рестриктазы HpaII, HinPII (Thermo, Литва), перемешивали и ставили на инкубацию на 3 часа при 37°C.
Для электрофореза использовали 1,5% агарозные гели, содержащие флуоресцентный краситель бромистый этидий и ТВЕ-буфер (45 мМ трис-борат, 1 мМ ЭДТА). Смесь после рестрикции вносили в кармашки геля. Электрофорез проводили в течение 1 часа при рабочем напряжении 150 В.
В качестве маркера, позволяющего оценить длину фрагментов ДНК на геле, использовали pUC/MspI (Fermentas, Литва). Сигнал флуоресценции фотографировали в системе гель-документации фирмы Кодак.
На рис. 1 и 2 представлены картины распределения фрагментов ДНК после проведения рестрикции и электрофореза. Здесь можно четко различить отдельные генотипы.
Рис. 1. Детекция MST2109 с помощью PCR-RFLP в миостатиновом гене у кур
M СС CGj G2G 2 G -J'-'i ^ 2-'CG.¿ С G^ С G2 G2G2 С G 2 M
Рис. 2. Детекция MST2244 с помощью PCR-RFLP в миостатиновом гене у кур
Праймеры MSTpr позволяют амплифицировать фрагмент длиной 297 пар оснований. При наличии сайта узнавания для рестриктазы Нра11 гомозиготный генотип GlGl будет определяться
наличием двух фрагментов - 260 и 37 п.н. В случае если особь является носителем гетерозиготного генотипа О1Л, наблюдается следующая картина распределения фрагментов: 297, 260 и 37 п.н. Генотип АА соответствовал амплификату. Фрагмент 37 пар нуклеотидов из-за небольшой длины практически незаметен на геле. В качестве маркера длин фрагментов нами был взят Рие19/М8р1.
Пара праймеров MSTex1 позволяла получить амплификат в 320 п.н. После обработки рестриктазой НтР1 гетерозиготы СО2 отличались наличием трех фрагментов (320, 203 и 117 п. н.), гомозиготы СС имели фрагменты 203 и 117 п. н., а у особей с генотипом О2О2 не наблюдалось сайта для рестрикции.
В табл. 1 представлены частоты аллелей и генотипов по замене MST2109. Видно, что у юрловских и пушкинских кур наблюдается существенное преобладание О1О1 генотипов. Следовательно, при анализе частот встречаемости аллелей мы наблюдали преимущество аллеля 01 (частота встречаемости 0,89 и 0,93 соответственно). Аллель А у представителей этих пород встречается редко.
Таблица 1. Частоты аллелей и генотипов по замене MST 2109, выявленных в миостатиновом гене у кур различных пород ФГУП «Генофонд» с помощью праймеров MSTpr (Hpa)
Порода Число голов,n Частоты генотипов Частоты аллелей
G1G1 AG1 AA G1 A
Пушкинская 139 0,81 0,16 0,03 0,89 0,11
Юрловская 163 0,88 0,09 0,03 0,93 0,07
Брама 12 0,50 0,42 0,08 0,71 0,29
Узбекская 12 0,75 0,25 0 0,87 0,13
Кохинхин 12 0,33 0,67 0 0,67 0,33
Русская белая 8 1 0 0 1 0
Промышленная линия кур породы корниш 140 0,08 0,57 0,35 0,37 0,63
Поскольку проанализировано по данной замене было достаточно большое поголовье кур (139 пушкинских и 163 юрловских), можно говорить о направленном отборе на яичную продуктивность, которому подвергались эти породы в ходе селекции.
Также генотип О1О1 преобладал и у кур узбекской породы. Но из-за небольшого числа проанализированных особей делать выводы относительно реального распределения аллелей 01 и А в этой породе было бы преждевременным.
У кур русской белой полиморфизма по данному не наблюдалось. Все
проанализированные особи имели генотип О1О1. Эта порода выведена на основе белых леггорнов, отличающихся высоким генетическим сходством в силу их промышленного использования. Вероятность того, что в ходе жесткого отбора один из аллелей (в данном случае аллель А) был элиминирован из популяции, очень велика. Увеличение размера выборки позволит выявить реальную картину распределения аллелей в этой породе. Скорее всего, эта замена не может быть использована для изучения русских белых кур из-за низкой информативности ее для этой популяции.
Низкий полиморфизм отмечается у русских белых кур и по другой замене MST2244 (табл. 2). Лишь одна особь имела гетерозиготный генотип CG2, большинство же оказались гомозиготами СС.
У кур мясного направления продуктивности, таких как брама и кохинхин, частота встречаемости аллеля А по замене MST2109 значительно выше - 0,29 и 0,33 соответственно. Частота аллеля С (MST2244) у кур породы брама составила 0,70 и кур породы кохинхин - 0,67.
Анализ частот встречаемости различных генотипов у пушкинских и юрловских кур по замене MST2244 показал значительное преобладание гомозигот СС - 0,76 и 0,78 соответственно. Притом, что частота встречаемости генотипов G2G2 в обеих породах очень низка, наблюдается преобладание аллеля С.
Таблица 2. Частоты аллелей и генотипов по замене MST2244, выявленных в миостатиновом гене у кур различных пород ФГУП «Генофонд» с помощью праймеров MSTex1 (Ншр)
Порода Число голов,n Частоты генотипов Частоты аллелей
CC CG2 G2G2 C G2
Пушкинская 144 0,76 0,21 0,03 0,87 0,13
Юрловская 273 0,78 0,21 0,01 0,88 0,12
Брама 12 0,58 0,25 0,17 0,70 0,30
Узбекская 12 0,58 0,42 0 0,79 0,21
Кохинхин 12 0,33 0,67 0 0,67 0,33
Русская белая 8 0,88 0,12 0 0,94 0,06
Промышленная линия кур породы корниш 140 0,06 0,48 0,46 0.31 0,69
В случае с кохинхином и узбекской бойцовой по данной замене проанализировано небольшое число особей, среди которых совсем не было обнаружено гомозигот G2G2. В то же время количество гетерозигот оказалось достаточно большим - 0,42 у кур узбекской породы и 0,67 - у кур породы кохинхин. Частота аллеля G (MST2244) у кур породы брама также была выше, чем у яичных пород, и составила 0,30.
Промышленная линия породы корниш прошла жесткий отбор по живой массе, поэтому генотипы, имеющие низкие показатели по мясной продуктивности, малочисленны. Частота встречаемости аллеля G - 0,37 (MST2109), С - 0,31 (MST2244).
Отбор «ценных» генотипов позволяет повысить интенсивность размножения животных с желательными качествами и сохранить генофондный материал. Исследование генотипа животных значительно ускоряет генетический прогресс и увеличивает точность селекционной работы, поскольку позволяет вести непосредственную оценку генотипа по состоянию генов и отдельных последовательностей ДНК.
Таким образом, можно отметить, что при анализе частот распределения однонуклеотидных замен в гене миостатина у кур генофондных пород наблюдается значительный полиморфизм. Это позволяет использовать в дальнейшем данные замены для характеристики различных популяций кур, а также для поиска взаимосвязей между SNP и хозяйственно-полезными признаками. Актуальность подобных работ в птицеводстве особенно велика, поскольку у птицы наблюдается быстрая смена поколений.
Литература
1. Митрофанова О.В., Тыщенко В.И., Дементьева Н.В. и др. Исследование особенностей генетической гетерогенности пород и экспериментальных популяций кур на основе полиморфизма ДНК // Доклады РАСХН. - 2007. - №6. - С.36-38.
2. Яковлев А.Ф., Терлецкий В.П., Сэксте Э.А. и др. Влияние гена гормона роста на хозяйственные признаки птицы // Птицеводство. - 2013. - №1. - С.2-4.
3. Mc Pherron A.C., Lawler A.M. and Lee S.J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member // Nature.- 1997. - V.387. - P.83-90.
4. Kambadur R., Sharma M., Smith T.P.L. and Bass J.J. Mutations in myostatin (GDF8) in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle // Genome Res. -1997. -7. -P.910-915.
5. Mc Croskery S., Thomas M., Maxwell L., Sharma M. and Kambadur R. Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal // J.Cell. Biol. - 2003. -V.162. - P. 1135-1147.
6. Ye X., Brown S.R., Nones K., Coutinho L.L., Dekkers J.C. and Lamont S.J. Associations of myostatin gene polymorphisms with performance and mortality traits in broiler chickens // Genet. Sel. Evol. - 2007. - V.39. -P.73-89.
7. Zhang G., Ding F.,Wang J.,Dai G.,Xie K.,Zang L.,Wang W. and Zhou S.h. Polymorphism in exons of the myostatin gene and its relationship with body weight traits in the Bian chicken // Biochem. Genet. - 2011. -V.49. - P.9-19.
8. Zandi S., Zamani P .,Mardani K. Myostatin Gene Polymorphism and Its Association with Production Traits in Western Azerbaijan Native Chickens // Iranian Journal of Applied Animal Science - 2013. - V.3. - P.611-615.
9. Thomas M., Langley B., Berry C., Sharma M., Kirk S., Bass J., Kambadur R. Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275. -P.40235-40243.
