CC BY
40
УДК 636.52/.58:575
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА КУР УКРАИНСКОЙ СЕЛЕКЦИИ МЯСОЯИЧНОГО НАПРАВЛЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ
С. В. РУДАЯ, О. А. КАТЕРИНИЧ, С. Н. ПАНЬКОВА, С. В. РЯБИНИН
Государственная опытная станция птицеводства Национальной академии аграрных наук Украины, с. Борки, Украина, 63421
(Поступила в редакцию 19.01.2018)
В статье анализируется генетическая структура мясо-яичных кур заводской линии Г2 породы Плимутрок белый с использованием ДНК-маркеров. Установлено, что локусы PRL, GH, SNP MST2109 и SNP MST22244 полиморфны у данной популяции кур. Определили, что по всем изученным локусам популяция кур находится в состоянии генетического равновесия.
Ключевые слова: генетическая структура, полиморфизм, ДНК, генотип, аллель, гете-розиготность.
The genetic structure of meat-egg hens of the factory line G2 of the Plymutrok white breed using DNA markers is analyzed in the article. It was been established that the loci PRL, GH, SNP MST2109 and SNP MST22244 are polymorphic in this population of hens. It was determined that the population of hens in all studied loci is in a state of genetic equilibrium.
Key words: genetic structure, polymorphism, DNA, genotype, allele, heterozygosis.
Введение. В современном животноводстве наряду с классическими методами селекции, основанными преимущественно на оценке и отборе особей по фенотипу, быстрыми темпами разрабатываются и внедряются методы геномной селекции, которые основаны на оценке по генотипу. В птицеводстве это особенно актуально в связи с быстрой сменой поколений, что дает возможность птицеводам получить эффект селекции значительно быстрее при ведении отбора по генам-кандидатам выбранных признаков, что и определяет актуальность выполненной работы.
Анализ источников. За последние годы с использованием молекулярных маркеров в животноводстве был достигнут большой прогресс в вопросах генетики. Молекулярно-генетические методы, основанные на полиморфизме ДНК, определили свое ключевое место среди других методов молекулярной генетики не только в животноводстве, но и в птицеводстве.
Основой для проведения маркер ассоциированной селекции (MAS) является изучение генов-кандидатов, определение их влияния на фенотипи-ческие проявления, интересующие исследователя [1].
Целью современной селекции в птицеводстве является создание высокопродуктивных пород и линий. В связи с этим различными методами исследуются генотипы пород и линий птицы для выявления высокоспецифичных маркеров яйценоскости и мясных качеств. Выявление этих мо-
лекулярно-генетических маркеров позволит проводить селекцию птицы на принципиально новых началах, потенциально резко усилит интенсивность селекции и обеспечит максимально эффективное раскрытие ее продуктивного потенциала [2]. К числу наиболее перспективных генов-кандидатов относятся: гормон роста (GH), рецептор гормона роста (GHR), трансформирующий фактор роста Р3 (TGF-03), пролактин (PRL), инсули-ноподобный фактор роста (IGF), миостатин и др. (MSTN) [3-7].
Гормон роста (соматотропный гормон, СТГ, соматотропин, соматро-пин) - по химической структуре относится к пептидным гормонам. Синтезируется соматотропными клетками передней доли гипофиза - аденоги-пофизом. У птиц ген гормона роста является одним из важнейших генов-кандидатов, который непосредственно влияет на продуктивность - живая масса, яйценоскость, масса яиц и т .д. [4]. Эффективность действия гормона роста напрямую зависит от его рецептора (GHR) - трансмембранного белка. Активация рецептора гормона роста приводит как к изменениям в экспрессии генов-мишеней, так и к воздействию на основные метаболические пути организма птицы. Существует четкая корреляция между уровнем экспрессии гена гормона роста и живой массой птицы [3].
Пролактин - один из важнейших гормонов, регулирующих активность репродуктивной системы у птицы. Он относится к пептидным гормонам, синтезируется лактотрофными клетками аденогипофиза. У птиц принимает непосредственное участие в регуляции проявления насиживания и интенсивности яйценоскости [8, 9]. Миостатин (MSTN), известный также как фактор-8 роста и дифференцировки (GDF-8), оказывает влияние на массу скелетных мышц посредством ее негативного регулирования. Факторы роста важны для регулирования разнообразия клеточных процессов. Термин «фактор роста» часто используется равноценно с терминами «ци-токины» и «гормоны». Однако, в отличие от гормонов, факторы роста секретируются локально и имеют ограниченную область действия, тогда как гормоны переносятся кровотоком и имеют эффект на отдаленные ткани организма. У кур ген миостатина состоит из трех экзонов и двух ин-тронов. В различных участках этого гена были найдены однонуклеотид-ные замены (SNP), отличающиеся по частоте встречаемости у различных популяций кур. Установлена взаимосвязь хозяйственно полезных признаков и отдельных замещений [7]. В будущем данные маркеры позволят проводить отбор птицы для дальнейшего разведения с целью закрепления желаемых генотипов.
Цель работы - проанализировать популяцию кур заводской линии Г2 породы Плимутрок белый на наличие полиморфизма в гене пролактина, гормона роста и по однонуклеотидным заменам в гене миостатина с помощью ПЦР-ПДРФ (Полимеразная Цепная Реакция -Полиморфизм Длинны Рестрикционных Фрагментов, PCR-RLFP).
Материал и методика исследований. Для проведения исследований были использованы куры украинской селекции - заводская линия Г2 породы Плимутрок белый мясояичного направления продуктивности, которая содержится на экспериментальной ферме «Сохранение отечественного генофонда птицы» Государственной опытной станции птицеводства НААН. ДНК выделяли из образцов крови, которые отбирали из гребня с помощью скарификатора на стерильную фильтровальную бумагу. Для предотвращения контаминации каждый образец подсушивали, маркировали и индивидуально упаковывали. Для выделения ДНК использовали коммерческий набор реагентов «NeoPrep100 DNA» (Неоген, Украина). Выделение необходимой для анализа ДНК оценивали с помощью электрофореза в 0,7 % агарозном геле (CSL-AG100, «Cleaver Scientific», Великобритания) при 200 V в течение 5 мин.
Изучали генетическую структуру по полиморфизму генов пролактина (PRL), гормона роста (GH), а так же по двум однонуклеотидным заменам гена миостатина в положении 2109 (MST2109) и 2244 (MST2244). Для определения каждого типа маркера использовали специфические пары праймеров (табл. 1).
Таблица 1. Структура праймеров
Праймер Структура
24 ВР (PRL) forward 5'-TTTAATATTGGTGGGTGAAGAGACA-3' reverse 5'-ATGCCACTGATCCTCGAAAACTC-3'
GH1 forward 5 '-ATCCCCAGGCAAACATCCTC-3' reverse 5'-CCTCGACATCCAGCTCACAT-3'
MSTpr forward 5'-ААССААTCGTCGGTTTTGAC -3' reverse 5'-CGTTCTCTGTGGGCTGACTA-3'
MSTexl forward 5'-TAGTCAGCCCACAGAGAACG-3' reverse 5'-CGAAAGCAGCAGGGTTGTTA-3'
Для проведения ПЦР использовали набор реагентов GenePak PCR Core (Неоген, Украина). Реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» используя определенные программы для каждого типа маркера (табл. 2). Таблица 2. Программы амплификации для проведения ПЦР
ОадщПЦР Отжиг Элонгация
Праймры 35 никлое
24 BP (PRL) 94°C (5 м) 94°C (30 с) 54°C (30 с) 72°C (30 с) 72°C (5 м)
MSTpr, MSTexl 94°C (5 м) 94°C (30 с) 60°C (30 с) 72°C (30 с) 72°C (5 м)
GH1 31 цикл
95°C (4 м) 94°C (1 м) 55°C (45 с) 72°C (1 м) 72°C (10 м)
Конечный объем реакционной смеси составил 20 мкл, концентрация праймеров - 0,2 мкМ.
После амплификации проводили рестрикцию с использованием рест-риктаз согласно протокола производителя (табл. 3).
Праймеры Рестриктаза Сайт рестрикции
GH1 MspI C/CGG
MSTpr HpaII G/A
MSTed HinPII G/C
Полученные продукты амплификации или рестрикции разделяли в 1,5 % агарозном геле при напряжении 150 V в течение 40-60 мин. Визуализацию проводили с использованием бромистого этидия в ультрафиолетовом свете. Размер фрагментов ДНК на геле определяли с использованием маркеров молекулярных масс М-50, М-100. Частоту встречаемости генотипов, аллелей, гетерозиготность и генетическое равновесие рассчитывали согласно принятым методикам [10].
Результаты исследований и их обсуждение. В результате проведенных исследований установили, что все изученные локусы полиморфны в подопытной группе кур. Частоты аллелей, генотипов, а так же гетерозиготность и генетическое равновесие у кур заводской линии Г2 породы Плимутрок белый представлены в табл. 4.
Таблица 4. Генетическая структура кур заводской линии Г2 породы Плимутрок белый по разным типам молекулярных маркеров (п=84)
Ген Генотипы Частота геноти-пов Аллели Частота аллелей х2 He Ho
А/А 0,15 А 0,387
В/В 0,14
GH С/С 0,02 В 0,417 2,54 0,64 0,68
А/В 0,33
А/С 0,13 С 0,196
В/С 0,21
I/I 0,05 I 0,16
PRL D/D 0,73 D 0,84 2,19 0,27 0,23
I/D 0,23
MST 2109 GjGj 0,88 Gj 0,935
GjA 0,11 A 0,065 1,3 0,12 0,11
AA 0,01
MST 2244 CC 0,012 C 0,125
cg2 0,22 G2 0,875 0,1 0,22 0,23
gg 0,762
Анализ распределения частоты аллелей в подопытной группе кур указывает на особенности генетической структуры по изученным локусам и имеет такой вид многогранника, который образовался по частоте аллелей изученных локусов (рис. 1). Так, анализируя мутацию indel 24 п.н., в положении 358 промотора гена пролактина наблюдаем три генотипа. Это гомозиготы, несущие инсерцию (вставку) I/I (длинна фрагмента 387 п.н.), гомозиготы по делеции D/D (330 п.н.) и гетерозиготы I/D (387 п.н. и 330
п.н.). Высокая частота встречаемости генотипа D/D (0,73) и практически полное отсутствие генотипа I/I (0,05) по данному локусу встречается у кур с мясным типом продуктивности [11]. Это отразилось на смещении частот аллелей в сторону аллеля D (0,84), который преобладал над частотой ал-леля I (0,l6). Полиморфизм гена гормона роста изучали за Mspl-полиморфизмом в первом интроне. Размер амплифицированного фрагмента - 776 п.н. Анализируя частоты распределения генотипов по локусу гена гормона роста, наблюдаем шесть генотипов: A/A имеет фрагменты размером 539 и 237 п.н., B/B - 392, 237 и l47 п.н., C/C - 267, 237, l47 и l25 п.н., A/B - 539, 392, 237 и l47 п.н., A/C - 539, 267, 237, l47 и l25 п.н., B/C - 392, 267, 237, l47 и l25 п.н. Определили явное преобладание гетерозигот А/В (0,33), что отразилось на высокой частоте аллелей А (0,387) и В (0,4l7), частота аллеля С была на уровне 0,l96. Преобладание гетерозигот А/В по данному локусу встречается у кур с повышенной яичной продуктивностью [12].
Транзиция гуанина в аденин (G/A) в положении -2l09 гена миостатина стала причиной потери сайта рестрикции для MspI, что привело к возникновению аллеля А. Гомозиготы типа G1/G1 имели фрагменты размером 260 п.н. и 37 п.н. В свою очередь гомозиготы A/A имели фрагмент ДНК размером 297 п.н., что соответствует молекулярной массе амплифицированного участка. А вот гетерозиготы G1/A, имели все три фрагмента размером 297, 260 и 37 п.н. Проанализировав подопытную группу кур по замене MST2lO9, наблюдали существенное преобладание особей с генотипом G1/G1 (частота 0,88), что указывает на значительные расхождения изученных аллелей. Так, алель А у птицы опытной группы встречался очень редко (0,065), тогда как частота аллеля G} была на уровне 0,935.
По второй замене в миостатиновом гене (MST2244) после оброботки эндонуклеазой HinPII происходит транзиция гуанина в цитозин (G/С). Получили гомозиготы С/С с фрагментом ДНК размером 203 п.н. и ll7 п.н., гетерозиготы dG2, - 320, 203 и ll7 п.н., а вот G2G2 не расщепляются ферментом, поэтому имели фрагмент размером 320 п.н., который соответствует молекулярной массе амплифицированного участка. По SNP MST2244 установили значительное преобладание гомозиготних особей по аллелю G2 (частота аллеля 0,875), по аллелю С обнаружили лишь одну гомозиготную особь.
Уровень наблюдаемой гетерозиготности (Но) и ожидаемой (Не) по всем изученным локусам достоверно не различался.
Анализ фактического и теоретического распределений особей разных генотипов во всех изученных локусах выявил отсутствие нарушения генетического равновесия (критерий х2= от 0,l до 2,54), что указывает на от-
сутствие активных формообразующих процессов у подопытной группы птицы._
GH А
Рис. Генетическая структура кур заводской линии Г2 породы Плимутрок белый по частоте аллелей ДНК-маркеров
Поскольку в ходе работы была проанализирована незначительная популяция кур, то полученные данные не отражают общую картину полиморфизма в группе по изученным локусам, а относятся лишь к данной выборке птицы.
Заключение. Анализ генетической изменчивости у кур заводской линии Г2 породы Плимутрок белый показал высокий уровень полиморфизма особей, что дает возможность использовать ДНК-маркеры для повышения эффективности селекционной работы и планирования структуры стада.
1. Установлено, что при высоком уровене полиморфизма локуса про-лактина, преобладают гомозиготные особи по аллелю D (0,84).
2. Установлено триаллельную систему A/0, B/0, С/0 по локусу гормона роста. Выявили преобладание гетерозиготных особей А/В (0,33).
3. По SNP MST2109 обнаружили существенное преобладание гомози-готних особей по аллелю G1 (0,935), а по SNP MST2244 значительное преобладание гомозиготних особей по аллелю G2 (0,875).
4. Установили, что опытная популяция кур находится в состоянии генетического равновесия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Fulton J.E. Molecular genetics in a modern poultry breeding organization / J.E. Fulton // World's poultry science journal. - 2008. - Vol. 64. - P. 171 - 176.
2. Teneva A. Molecular markers in animal genome analysis / A. Teneva // Biotechnology in Animal Husbandry. - 2009. - 25. - P. 1267 - 1284.
3. Enayati B. Genomic growth hormone, growth hormone receptor and transforming growth factor P-3 gene polymorphism in breeder hens of Mazandaran native fowls / B. Enayati, G. Rahimi-Mianji // African Journal of Biotechnology. - 2009. - Vol. 8 (14). - P. 3154 - 3159.
4. Porter T.E. Identification of the chicken growth hormone-releasing hormone receptor (GHRH-R) mRNA and gene: regulation of anterior pituitary GHRH-R mRNA levels by homologous and heterologous hormones / T.E. Porter, L.E. Ellestad, A. Fay // Endocrinology. - 2006. - V. 147(5). - P. 2535 - 2543.
5. Li H. Chicken quantitative trait loci for growth and body composition associated with transforming growth factor-P genes / H. Li, N. Deeb, H. Zhou // Poultry Science. - 2003. - V. 82. - P. 347 - 356.
6. Li H. F. Polymorphism in NPY and IGF-I genes associate with reproductive traits in Wenchang chicken / H. F. Li, W. Q. Zhu, K. W. Chen // African Journal of Biotechnology. - 2009. - V. 8 (19). - P. 4744 - 4748.
7. Связь генотипов по однонуклеотидным заменам в гене миостатина с показателями живой массы у кур Юрловской голосистой породы / О. В. Митрофанова, Н. В. Дементьева, В. И. Тыщенко и др. // Генетика и разведение животных. - 2015. - № 1. - С. 39-42.
8. Jiang R.-S. Association of polymorphisms for prolactin and prolactin receptor genes with broody traits in chickens / R.-S. Jiang, G.-Y. Xu, X.-Q. Zhang // Poultry Science. - 2005. - V. 84. -P. 839 - 845.
9. Liang Y. Polymorphisms of 5' flanking region of chicken prolactin gene / Y. Liang, J. Cui, G. Yang // Domestic Animal Endocrinology. - 2006. - V. 30. - P. 1 -16.
10. Генетична щентифжащя i паспортизащя порщ i лшш птищ / О. П. Подстрешний, О.
B. Терещенко, Т. Е. Ткачик [та ш.] // (Методичш рекомендаций Бiрки, 2009. - 76 с.
11. Митрофанова, О. В. Полиморфизм в промоторе гена пролактина и его ассоциация с направлением продуктивности у кур / О. В. Митрофанова, Н. В. Дементьева, А. А. Крутикова // Научный журнал КубГАУ. - 2015. - № 111 (07).
12. Кулибаба, Р. А. Полиморфизм генов гормона роста, рецептора гормона роста, про-лактина и рецептора пролактина в связи с яичной продуктивностью у кур породы полтавская глинистая / Р. А. Кулибаба // Сельскохозяйственная биология. - 2015. - Том 50 (№2). -
C. 198 - 207.
