CC BY
9
21. Meggs IV. J., Cahill-Morasco R., Shih R. D. et al. // Ibid. - 1997. - Vol. 35, N 2. - P. 163-166.
22. Moore D., House /., Dixon A. // Brit. med. J. - 1993. -Vol. 306, N 6891. - P. 1527-1529.
23. Scopinaro F. // Clin. nucl. Med. — 1996. - Vol. 21, N 10. - P. 783-785.
24. Zuo-Hiang He, Medrano R., Hays J. T. et al. // Circulation. - 1997. - Vol. 95, N 7. - P. 1799-1805.
Поступила 22.10.9S
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1999 УДК 615.322.03:547.284.3.0991.015.4.076.9
10. А. Рахманин, С. Е. Фоменко, Н. Ф. Кушнерова, Т. Н. Гордейчук, М. В. Фокин
ВЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА КОРРДА-К НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ АЦЕТОНОМ
Тихоокеанский океанологический институт ДВО РАН, Владивосток; НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва
В последнее время отмечается повышенный интерес к изучению воздействия органических растворителей (ОР) на организм человека. Социально-экологическая сущность этой проблемы определяется широким использованием ОР, в частности ацетона, как в разнообразных отраслях промышленности, так и в быту, в связи с чем они занимают ведущее место среди вредных веществ, загрязняющих окружающую среду. Кроме того, в последнее время ацетон и другие летучие вещества становятся популярными среди некоторой категории лиц для достижения наркотического эффекта. Хроническое и массивное острое вдыхание паров ОР ведет к развитию неврологических, гематологических и других нарушений, проявляющихся в виде астеновегетативного, астеноневротического синдромов, вегетососудистой дисфункции [12]. В литературе накопилось уже много сведений о случаях острых и хронических отравлений ацетоном и содержащих его лакокрасочными материалами [2, 14, 21]. К ранним и достоверным признакам хронического воздействия ацетона следует отнести накопление кетоновых тел в крови и моче, активация ПОЛ, нарушение морфофункционального состояния эритроцитов и прежде всего их антиоксидант-ной защиты, признаки дисфункции печени [9, 10, 19, 24]. Однако механизм токсического действия ацетона на организм полностью еще не выяснен. Например, требует тщательного исследования состояние липидного и углеводного обмена печени, которая является основным барьером, нейтрализующим ксенобиотики в организме животных и человека. Потенциальная опасность, исходящая отданного обширного класса ОР, которые способны даже при ингаляционном воздействии вызывать столь значительные функциональные и неврологические нарушения в организме, настоятельно требует поиска нетрадиционных подходов профилактики и, безусловно, терапии токсических эффектов.
В результате многолетних экспериментальных исследований нами был выделен растительный препарат Коррда—К, проявляющий высокий гепа-топротекторный эффект при интоксикации этанолом [8, 13]. По химическому составу данный препарат представляет собой сложную композицию различных биологически активных веществ с преобладанием флавоноидов, которые, как было показано, и обусловливают гепато- и мембранопротек-торные свойства препарата, его протонофорную активность, способность влиять на характер течения окислительно-восстановительных реакций в
организме. В связи с этим представляет интерес изучить профилактическое влияние препарата Коррда—К на метаболические реакции печени крыс в условиях хронического ингаляционного воздействия ацетона. В задачу наших исследований входило изучение некоторых показателей углеводного и липидного обмена, характеризующих состояние печени интоксицированных животных.
Эксперимент проведен на беспородных белых крысах-самцах массой от 180 до 200 г, содержащихся на стандартном рационе питания. Препарат Коррда—К представляет собой спиртовой экстракт, выделенный из гребней винограда в процессе реперколяции. Готовый экстракт упаривали на водяной бане до 1/3 объема для удаления этанола, затем доводили дистиллированной водой до исходного объема. Полученный нативный экстракт животным вводили перорально в дозе 0,2 мл на 100 г массы ежедневно в течение 2 нед. Затем животных помещали в специальные затравочные камеры в условиях относительной влажности воздуха 40— 60% при концентрации ацетона 200 мг/м3 сроком на 3 нед. Контролем служили животные, содержащиеся в стандартных условиях вивария. Таким образом, в ходе эксперимента были выделены следующие группы животных по 5 крыс в каждой: 1-я — контроль, 2-я — ингаляция парами ацетона в течение 3 нед, 3-я — профилактическое введение препарата Коррда—К в течение 2 нед с последующей ингаляцией парами ацетона в течение 3 нед.
Экстракт общих липидов из ткани печени готовили по методу J. Folch и соавт. [16]. Силикагель и пластинки для микротонкослойной хроматографии готовили, как описано V. I. Svetachev, V. Е. Vasko-vsky [23]. В качестве разделяющей системы использовали смеси растворителей, описанные G. Rouser и соавт. [22]. Идентификацию фосфолипидных фракций на хроматограммах проводили по методу Т. Кейтс [5], G. Rouser и соавт. [22], V. Е. Vaskovsky и соавт. [25]. Результаты выражали в процентах от суммарного содержания фосфолипидов. Хромато-графическое распределение нейтральных липидов и их количественное определение проводили методом одномерной тонкослойной хроматографии в системе растворителей, описанных G. S. Amenta [15]. Идентификацию пятен нейтральных липидов осуществляли с помощью стандартных препаратов. Стандарты и пробы после хроматографирования обнаруживали с помощью паров йода. Результаты выражали в процентах от суммы всех фракций. Для определения жирно-кислотного состава липиды
Изменение содержания глюкозы в крови и НАД+ в печени крыс при аспирации ацетона на фоне профилактического введения препарата Коррда—К (М ± т)
Группа животных
Глюкоза, ммоль/г НАД+. мкмоль/г
1-я (контроль)
2-я (ацетон)
3-я (Коррда—К + ацетон)
5,62 ± 0,16 4,42 ± 0,12** 5,72 ±0,12
0,356 ± 0,016 0,207 ± 0,013* 0,398 ± 0,031
Примечание. Одна звездочка — достоверные различия с контролем — р < 0.01, две звездочки — р < 0,001.
подвергали метанолизу с хлористым ацетилом [5]. Эфиры жирных кислот анализировали на хроматографе "8Ытас1ги" с пламенно-ионизационным детектором. Жирные кислоты идентифицировали путем сравнения как удерживаемых объемов в исследуемой смеси [1], так и стандартных препаратов метиловых эфиров жирных кислот (С14—¿24). Глюкозу крови определяли с помощью стандартных наборов реактивов "Биотес" фирмы "Лахема". Концентрацию никотинамидных коферментов НАД4 в ткани печени определяли по методу КНп^епЬещ [20].
Ингаляция парами ацетона в течение 3 нед сопровождалась достоверным снижением содержания глюкозы в крови экспериментальных животных (см. таблицу) на 22% (4,42 ± 0,12 ммоль/л против 5,62 ±0,16 ммоль/л в контроле, р < 0,001). Полученные изменения можно рассматривать как типичную реакцию организма на токсический стресс, сопровождающийся истощением запасов гликогена в печени.
Известно, что ацетон метаболизируется главным образом в печени. Метаболизм ацетона происходит путем восстановления его в изопропанол [4] или через окисление в ацетат и формиат с разрывом углеводородной цепи [18]. И хотя принято считать, что в физиологических условиях восстановление альдегидов и кетонов, катализируемое алкогольдегидрогеназой (АДГ), протекает в десятки раз быстрее, чем их окисление, по-видимому, оба пути имеют место в организме. В связи с этим мы изучали содержание окисленной формы пири-диндинуклеотида (НАД+), который является ко-ферментом АДГ.
Так, после ингаляционного воздействия ацетона содержание НАД+ снизилось на 42% (0,207 ± 0,013 мкмоль/г по сравнению с 0,356 ± 0,016 мкмоль/г в контроле, р < 0,001), что свидетельствует о массивном окислении ацетона на данном этапе. Аналогичная закономерность отмечается при острой эта-нольной интоксикации, сопровождающейся накоплением НАДН и соответственно блокированием каскадов окислительно-восстановительных реакций цикла Кребса [11].
При исследовании содержания фракций нейтральных липидов печени животных, интоксици-рованных ацетоном (см. рисунок), отмечалось достоверное увеличение уровня холестерина (ХС) на 12% (15,18 ± 0,5% против 13,5 ± 0,23% в контроле, р < 0,05). Повышенное содержание свободного ХС в печени может происходить за счет избыточного накопления ацетата, образующегося при окислении ацетона. Данный факт отмечал V. С. (лаушо [18] при перфузии изолированной печени меченным по углероду ацетоном. В фракционном составе фосфоли-
пидов печени крыс, находившихся под воздействием паров ацетона, наблюдалось снижение уровня основного структурного компонента мембран фос-фатидилхолина (ФХ) на 10% (39,5 ± 0,62% против 43,9 ± 1,07% в контроле, р < 0,05). Отмечалось также повышение уровня лизофракций фосфоли-пидов — лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и лизо-фосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) в среднем на 28— 32%, причем увеличение содержания последнего являлось достоверным (3,29 ± 0,28% против 2,49 ± 0,22% в контроле, р < 0,05).
Изучение жирно-кислотного состава липидов печени крыс показало, что доминирующими во всех группах являлись пальмитиновая (16:0), стеариновая (18:0), олеиновая (18:1), линолевая (18:2), арахидоновая (20:4) кислоты. Суммарное содержание этих кислот колебалось от 82 до 90%. У животных 2-й группы, подвергнутых аспирации парами
40
во
20
Ю
О
-Ю
-20
-ОО 40
во
го
ю
о
-ю
-го во во
40
го о -го
-40
-во
ГЪ._1
I I
!' чи 1
I
ХС СЖК ТАГ эжк эхе
Па
н <4
п
ж
г
г
н Б
ЛФХ ФХ ЛФЭ ФЭ СМ ФИ ФС ДФГ
-чг
-Ц
I V ^ ***
**
|_|Г
рН в
м-о 16:0 13: / 18:0 18'I 18-2 18-3 20'4 22:6
Изменение липидного состава (% от контроля) в печени крыс при аспирации парами ацетона на фоне профилактического введения растительного препарата Коррда-К.
А — нейтральные лнпиды: ХС — холестерин, СЖК — свободные жирные кислоты, ТАГ — триацилглицерины, ЭЖК — эфиры жирных кислот, ЭХС — эфиры холестерина. Б — фосфолипилы: ЛФХ — лизофосфати-дилхолин, ФХ — фосфатидилхолин, ЛФЭ — лизофосфагилилэтанола-мин, ФЭ — фосфатидилэтаноламин, СМ — сфингомислин, ФИ — фос-фатидилинозит, ФС — фосфатидилссрин, ДФГ — дифосфатидилпшцс-рин. В — жирные кислоты: 14:0 — миристиновая кислота. 16:0 — пальмитиновая кислота, 15:1 —пальмитолеиновая кислота. 18:0 — стеариновая кислота, 18:1 — олеиновая кислота. 18:2 — линолевая кислота, 18:3 — линоленовая кислота, 20:4 — арахидоновая кислота, 22:6 — докозагексае-новая кислота; а — ацетон, б — ацетон + Коррла—К. Одна звездочка — р < 0,05, две — р < 0,01, три — р < 0,001.
ацетона, в содержании насыщенных жирных кислот липидов печени отмечалось достоверное снижение стеариновой (18:0) на 25% (11,26 ± 1,14 против 15,0 ± 0,45% в контроле, р < 0,05), тогда как количество миристиновой (14:0) и пентадекаено-вой (15:0) кислот имело тенденцию к увеличению. Обращает на себя внимание значительное повышение количества мононенасыщенных жирных кислот. Так, содержание пальмитолеиновой кислоты (16:1) повысилось на 57% (6,9 ± 1,01% против 4,4 ± 0,29% в контроле, р < 0,05), а эйкозаеновой (20:1) — почти в 3 раза (0,32 ± 0,08% против 0,13 ± 0,03% в контроле, р < 0,05). Отмечается тенденция к повышению уровня олеиновой (18:1) и гептадекаеновой (17:1) кислот. Среди других идентифицированных кислот определенный интерес представляют другие полиненасыщенные жирные кислоты — линолевая (18:2), арахидоновая (20:4) и докозагексаеновая (22:6). Функциональная значимость этих соединений определяется их высокой ненасыщенностыо и преимущественной локализацией в липидах различных мембранных структур. Кроме того, линолевая и арахидоновая кислоты являются предшественниками ряда биологически активных веществ, таких как простагландины и про-стациклины.
Ингаляция парами ацетона сопровождалась достоверным снижением содержания докозагек-саеновой кислоты (22:6) в 2 раза (1,67 ± 0,25% против 3,33 ± 0,28% в контроле, р < 0,01) и тенденцией к уменьшению уровня арахидоновой и линоле-вой кислот. Одновременно возросло содержание докозатетраеновой кислоты (22:4) в 3 раза (0,62 ±0,1% по сравнению с 0,23 ± 0,03% в контроле, р < 0,05).
Анализ полученных данных показывает, что в липидах ткани печени интоксицированных ацетоном животных, происходит существенное изменение жирно-кислотного состава, которое приводит к заметному снижению ненасыщенности жирных кислот. Так, индекс ненасыщенности липидов снижался у животных, помещенных в пары ацетона, до 129, тогда как в контроле он составлял 140. Индекс ненасыщенности представляет собой величину, по возможности полно учитывающую количество двойных связей в жирно-кислотных цепях липидов |17]. Снижение ненасыщенности жирных кислот липидов существенно влияет на функциональные свойства биологических мембран, повышая ее "жесткость" и снижая проницаемость [3, 6]. Это согласуется с выявленными нами изменениями содержания жирно-кислотного состава и фракционного состава липидов ткани печени под действием ацетона (снижение уровня ФХ, увеличение концентрации ЛФХ, ЛФЭ и ХС).
У животных 3-й группы аспирация парами ацетона на фоне предварительного введения препарата Коррда—К сопровождалась нормализацией содержания глюкозы в крови и достоверным его повышением (на 30%) по сравнению с крысами 2-й группы, интоксицированными ацетоном и не получавшими профилактически препарат. При исследовании концентрации кофермента НАД+ у этих животных выявлено соответствие ее контрольному уровню. В то же время эта величина превышала на 88% {р < 0,001) аналогичный показатель у крыс 2-й группы. Полученные результаты
объясняются протонофорной способностью полифенолов, входящих в состав препарата. Известно, что они могут включаться в качестве переносчиков электронов в электронно-транспортную цепь [7, 11]. Эта способность позволяет освобождать восстановленные никотинамидные коферменты от протонов, нормализуя тем самым окислительно-восстановительный потенциал клетки.
При изучении фракционного состава нейтральных липидов печени крыс 3-й группы отмечалось достоверное повышение эфиров холестерина (ЭХС) на 29% (15,33 ± 0,89% против 11,92 ± 0,18% в контроле, /»<0,01). Статистически достоверно снизился уровень триацилглицеринов (ТАГ) на 26% (20,24 ± 1,12% против 27,74 ± 2,12% в контроле, р < 0,05). Аналогичная направленность изменений нейтральных липидов отмечалась и при сравнении с таковыми показателям у животных 2-й группы. Среди фосфолипидных фракций несколько повысилось содержание ФХ по сравнению с аналогичным показателем у животных после аспирации ацетона. Количество лизофракций фосфо-липидов сохранялось на уровне контроля. Однако при сравнении со 2-й группой их количество уменьшилось на 28—30% (р < 0,01). Следует отметить тенденцию к увеличению дифосфатидилгли-церина (ДФГ) на 7—15% по сравнению с 1-й и 2-й группами. Количественное содержание остальных фракций фосфолипидов находилось на уровне контроля.
В жирно-кислотном спектре под влиянием растительного препарата в печени крыс, интоксицированных ацетоном, отмечалось снижение содержания короткоцепочных жирных кислот: миристиновой (14:0) на 52% (р < 0,05) и пальмитиновой (16:0) на 16% (р < 0,05) по сравнению с животными 2-й группы. Почти в 2 раза увеличилось содержание стеариновой кислоты (18:0), что составляло 20,78 ± 0,47% против 11,26 ± 1,14% во 2-й группе (р < 0,001). Достоверно снизилось содержание мононенасыщенных жирных кислот: пальмитолеиновой (16:1) почти в 3 раза и олеиновой (18:1) на 40% (2,75 ± 0,25 и 14,0 ± 0,34% соответственно по сравнению с 6,9 ± 1,01 и 23,14 ± 1,52% во 2-й группе, р < 0,01). Следует отметить существенное повышение уровня полиненасыщенных арахидоновой (20:4) и докозагексаеновой (22:6) кислот под действием экстракта в среднем на 60—90% (20,62 ± 0,32 и 3,2 ± 0,38% против 12,68 ± 1,62 и 1,67 ± 0,25% во 2-й группе, р < 0,05-0,01). В связи с изменением количественного соотношения жирных кислот отмечалось увеличение индекса ненасыщенности до 156, тогда как у животных 2-й группы он составлял 129.
Анализируя полученные результаты, можно констатировать, что растительный препарат Коррда—К оказывает выраженное гепато- и мембрано-протекторное действие при ингаляционном воздействии ацетона. Оно проявлялось в нормализации содержания глюкозы в крови, окисленной формы НАД+ и снижении уровня ХС в ткани печени. Действие препарата сопровождалось восстановлением реакций введения ненасыщенных связей в жирные кислоты, что было нарушено при интоксикации ацетоном. Под влиянием препарата отмечалась активация реакций каскада арахидоновой кислоты, обусловленная включением окислен-
ных никотинамидных коферментов в реакции элонгации и десатурации полиненасыщенных жирных кислот, подавляемых ксенобиотиком. Включение реакций синтеза полиненасыщенных жирных кислот сопровождается снижением уровня ТАГ. По-видимому, липогенез направлен преимущественно в сторону синтеза фосфолипидов с использованием образовавшихся полиненасыщенных жирных кислот. Подтверждением этого предположения является повышение содержания ФХ и ФС, а также увеличение этерифицирующей функции печени, что проявлялось в возрастании уровня ЭХС под действием препарата. Профилактическое введение препарата накануне ацетоновой интоксикации также положительно сказалось на функциональных свойствах мембран гепатоцитов. Это привело к снижению плотности мембраны, восстановлению ее проницаемости, о чем свидетельствуют увеличение уровня ФХ, тенденция к нормализации лизоф-ракций фосфолипидов, снижение концентрации ХС и насыщенных жирных кислот липидов в ткани печени.
Таким образом, полученные данные позволили предположить, что введение растительного препарата Коррда—К сопровождается сохранением структурной организации мембран гепатоцитов, нормализацией липидного и некоторых сторон углеводного обмена, разбалансированных ингаляционным воздействием ацетона.
Литература
1. Берчфилд Г., Сторрс Э. Газовая хроматография в биохимии. — М., 1964.
2. Бурдеиный А. Ф., Тотрова Н. Г., Краснопольская И. И. // Актуальные проблемы наркологии: Биологические основы, клиника, диагностика, терапия, профилактика: Тезисы докладов обл. научн.-практ. конф. - Харьков, 1987. — С. 95-97.
3. Вельтищев 10. Е.. Юрьева Э. А., Воздвиженская Е. С. II Вопр. мед. химии. — 1987. — № 2. — С. 2—9.
4. Головенко Н. Я., Карасева Т. Л. Сравнительная биохимия чужеродных соединений. — Киев, 1983.
5. Кейтс Т. Техника липидологии. — М., 1976.
6. Кожокару А. Ф., Фомкина М. Г., Чертшцев В. В. и др. // Свойства флавоноидов и их функции в метаболизме растительной клетки. — Пушино, 1986. — С. 47-76.
7. Корф И. И., Мещерякова В. А., Самсонов М. А. и др. // Вопр. мед. химии. — 1987. - № 3. — С. 73-74.
8. Кушнерова Н. Ф., Фоменко С. Е., Положенцева М. И., Буланов А. А. // Там же. — 1995. - № 2. -С. 20-23.
9. Мазнева Г. И. // Авиакосмическая медицина: Тезисы докладов 4-й Всесоюз. конф. по космической биологии. - М.; Калуга, 1979. - Ч. 2. — С. 102-103.
10. Музафаров Е. Н., Кожокару А. М. // Всесоюзный симпозиум по фенольным соединениям, 5-й: Тезисы докладов. — Таллинн, 1987. — С. 56—58.
11. Рахманин Ю. А., Фоменко С. Е., Кушнерова Н. Ф. // Гиг. и сан. - 1995. - № 3. - С. 39-42.
12. Тарасова Л. А., Сорокина И. С., Лобанова Е. А. и др. // Мед. труда и пром. экол. — 1997. — № 3. — С. 6-9.
13. Фоменко С. Е. Влияние этанола на функциональное состояние печени и его коррекция растительными препаратами: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Владивосток, 1995.
14. Шпагина Л. А., Лосева М. И., Сухаревская Т. М. и др. // Мед. труда и пром. экол. — 1994. — С. 17—20.
15. Amenta J. S. // J. Lipid Res. - 1964. - Vol. 5. -P. 270-272.
16. Folch G., Less M., Sloane Stanley G. H. // J. biol. Chem. - 1957. - Vol. 226. - P. 497-509.
17. Galli C., White H. В., Paoletti R. // J. Neurochem. — 1970. - Vol. 17. - P. 347-375.
IS. Gavino V. C., Somma J., Pailbert L. et al. // J. biol. Chem. - 1987. - Vol. 262. - P. 6735-6740.
19. Ingvar L., Gun N., Gunilla H. et al. // Occup. envi-ronm. Med. - 1994. - Vol. 57, N 5. - P. 347-353.
20. Klingenberg M. 11 Methods of Enzymatic Analysis. — New York, 1963. - P. 528-538.
21. Masakatsu S., Junko K., Masanobu H. // J. Toxicol, clin. Toxicol. - 1989. - Vol. 27. - P. 99-162.
22. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. // Lipid Chromatographic Analysis. — New York, 1967. — Vol. 1. — P. 376-378.
23. Svetachev V. I., Vaskovsky V. E. // J. Chromatogr. — 1972. - Vol. 67. - P. 376-378.
24. Tzuu-Huei V., Jen Ning Т., Jr-Min J. et al. // Arch. Toxicol. - 1991. - Vol. 65, N 1. - P. 45-51.
25. Vaskovsky E. A., Latishev N. E. // Chromatography. — 1975. - Vol. 115. - P. 246-249.
Поступила 14.01.99
Summary. The paper deals with the study of the preventive effect of the plant drug Korrda-K on lipid and carbohydrate metabolism in the liver of the rat exposed to acetone inhalation. The agent was found to have hepatic and membranous protective effects. On exposure to acetone, Korrda-K promotes the normalization of blood glucose levels and other biochemical parameters. The magnitude of changes in the composition of lipids and fatty acids suggests that the preventive use of the agent favours the preservation of the membrane structure of hepatocytes changed by acetone.
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1999 УДК 614.72:547.53]-07
Д. Ф. Шакиров, Р. Р. Фархутдинов, Т. Р. Зулькарнаев
СОСТОЯНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА И МИКРОСОМАЛЬНЫХ МОНООКСИГЕНАЗ У ЖИВОТНЫХ ПРИ ИНГАЛЯЦИОННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ 1,2,4-ТРИМЕТИЛ БЕНЗОЛА
Башкирский государственный медицинский университет, Уфа
Проблема охраны окружающей среды приобрела в настоящее время огромное значение вследствие антропогенного загрязнения ее, в основном химическими соединениями, количество которых постоянно увеличивается за счет выбросов промышленных предприятий. В воздушной среде про-
мышленно развитых городов постоянно имеются загрязняющие вещества различного происхождения. В связи с этим особую актуальность приобретает исследование негативного действия химических факторов, в частности ароматических углеводородов, на функциональные системы организма.
