CC BY
47УДК 579.86:582.282.23
DOI: 10.24412/1999-6780-2020-4-35-37
ВЛИЯНИЕ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА ЭНТЕРОКОККОВ НА ОБРАЗОВАНИЕ ГИФАЛЬНОЙ ФОРМЫ
CÁNDIDA ALBICANS
Александрова H.A. (старший преподаватель)1, Заславская М.И. (профессор кафедры), Игнатова Н.И. (доцент), Махрова Т.В. (доцент), Лукова O.A. (старший преподаватель)
Приволжский исследовательский медицинский университет, Нижний Новгород, Россия
Установлено, что продукты метаболизма энтерококков способны подавлять гифообразование Candida albicans. Антигифалъная активность бактериальных метаболитов носит штамм-специфический характер. Лактат, являющийся одним из компонентов продуктов метаболизма энтерококков, не оказывает существенного влияния на гифообразование С. albicans. Способность Enterococcus spp. к синтезу бактериоцинов не коррелирует с антигифалъной активностью штаммов.
Ключевые слова: Candida, гифы, энтерококки, микробный антагонизм, антигифальная активность
INFLUENCE OF ENTEROCOCCAL METABOLISM PRODUCTS ON THE HYPHAL FORM GENERATION OF
CANDIDA ALBICANS
Alexandrova N.A. (senior lecturer), Zaslavskaya M.I. (professor of the department), Ignatova N.I. (associate professor), Makhrova T.V. (associate professor), Lukova O.A. (senior lecturer)
Privolzhsky Research Medical University, Nizhny Novgorod, Russia
It was shown that the enterococcal metabolic products are able to inhibit hyphae formation of Candida albicans. Anti-hyphal activity of bacterial metabolites depends on the strain. Lactate, which is one of the components of enterococcal metabolism products, does not significantly affect the hyphae formation of C. albicans. The bacteriocin synthesis ability of Enterococcus spp. does not correlate with the anti-hyphal activity of the strains.
Key words: Candida, hyphae, enterococci, microbial antagonism, anti-hyphal activity
'Александрова Наталья Александровна, e-mail: natalyuskova@rambler.ru
ВВЕДЕНИЕ
Грибы рода Candida - наиболее распространенные возбудители оппортунистических грибковых инфекций [1-3], присутствующие в составе многих микробиоценозов тела человека и, прежде всего, слизистых оболочек, кожи и кишечника. Наиболее часто возбудителем кандидоза слизистых оболочек является Candida albicans [3-5]. Среди основных факторов патогенности С. albicans можно выделить способность к морфологической трансформации «дрожжевая форма - мицелиальная форма». Гифы часто рассматривают как более вирулентную форму Candida. Переход дрожжеподобных клеток в гифы способствует инвазии микромицетов в ткани хозяина [3]. Известно, что некоторые представители нормальной микробиоты могут оказывать влияние на процесс гифообразования Candida [6]. Понимание механизмов антикандидозной стратегии бактерий микробиома чрезвычайно важно для создания условий, способных сдерживать кандидоносительство и препятствовать развитию клинически выраженного кандидоза у человека.
Цель нашей работы — изучение влияния продуктов метаболизма энтерококков на формирование гифальной формы С. albicans.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали штаммы из музея кафедры эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава РФ: Candida albicans 601, Enterococcus faecalis (штаммы 179-2, 208, 651, 682, 2482, 4276, 4304, 4306, 4314), Enterococcusfaecium (штаммы L3, 173-5).
Для получения экзогенных энтерококковых метаболитов бактерии культивировали в триптиказо-соевом бульоне (ТСБ) (HiMedia) в течение 48 часов при 37 °С. Стерильный фильтрат бульонной культуры энтерококков, содержащий метаболиты, получали путем отделения от бактериальных клеток с помощью бактериальных фильтров CellTricks с диаметром пор 100 мкм (Partee, Germany).
Candida культивировали на агаре Сабуро (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск, Россия) 24 ч при 37 °С. После чего готовили суспензию клеток в дрожжевой форме 107 КОЕ/мл в забуференном физиологическом растворе (ЗФР). Для получения гифальной формы 0,05 мл стандартизованной клеточной суспензии С. albicans (107 КОЕ/мл в ЗФР) вносили в микропробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл с коническим дном и приливали 0,7 мл среды DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium, ПанЭко, Россия).
Для изучения влияния метаболитов энтерококков на образование гиф микромицетами в пробирки с грибами добавляли по 0,5 мл фильтрата бульонной культуры бактерий. В контроле использовали рав-
ный объем стерильного ТСБ. Пробирки инкубировали в течение 48 ч при 37 °С, после чего измеряли объем, занимаемый образовавшимися гифами Candida.
В ряде экспериментов для оценки влияния молочной кислоты, содержащейся в продуктах метаболизма энтерококков, в ТСБ добавляли химически чистый лактат, доводя рН до значения 6,0, что соответствовало показателю кислотности супернатанта двухсуточной бульонной культуры энтерококков. Для измерения рН среды применяли индикаторные полоски Hydrion® Brilliant рН dip stiks (Micro Essential Laboratory, USA).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе экспериментов было показано, что продукты метаболизма всех исследуемых штаммов энтерококков способны угнетать образование гифаль-ной формы С. albicans (Рис., табл.). При этом выраженность антигифального эффекта зависела от характеристик штамма бактерий. Наибольшим эффектом обладали метаболиты Е. faecium L3, Е. faecalis 179-2 и Е. faecalis 208. При воздействии продуктов метаболизма этих штаммов на суспензию грибов объем, занимаемый гифами микромицетов, был ниже, чем в контроле в 25,73±16,21, 10,97±3,35 и 10,6±6,35 раз соответственно (р<0,05).
Рис. Способность к гифообразованию у С. albicans штамм 601 при культивировании (48 ч, 37 °С) in vitro. Окраска карболовым фуксином.
а) контроль (без метаболитов энтерококков) - доминирование гифальной формы;
б) эксперимент (с метаболитами Е. faecium L3) - доминирование дрожжевой формы.
Известно, что энтерококки являются молочнокислыми бактериями, и в состав их метаболитов входит лактат. Мы предположили, что антигифаль-ная активность метаболитов энтерококков может быть обусловлена высокой концентрацией молочной кислоты. Для проверки нашей гипотезы использовали стерильную питательную среду с добавлением лактата. В ходе экспериментов установлено, что присутствие молочной кислоты в питательной среде не влияло на образование гиф С. albicans: объем гифальной массы в опытных образцах не отличался от контроля (р> 0,05).
Таблица
Гифообразование Candida albicans 601 через 48 часов экс-
позиции с метаболитами энтерококков, (М±т)
Метаболиты штаммов энтерококков Объем, занимаемый гифами С. albicans (мл3) Кратность снижения объема, занимаемого гифами С. albicans относительно контроля (количество раз)
контроль (без метаболитов 0,43+0,09 1
энтерококков)
£ ^аеаит 1.3 0,04±0,03* 25,73±15,06*
£ ^аеаит 173-5 0,28±0,06* 1,50+0,17*
£ faecaЧs 2482 0,21 ±0,05* 2,13+0,35*
£ faecaЧs 682 0,08±0,04* 6,88±2,50*
£. /веса/га 651 0,12±0,05* 3,86±0,72*
£ fаecаЧs 179-2 0,05±0,02* 10,97±3,35*
£ fаecаlis 4304 0,12±0,06* 7,15+3,80*
£ ГаесаИв 4276 0,26±0,03* 1,69±0,39*
£ ГаесаИв 4306 0,08±0,06* 6,91 ±2,37*
£ ^аеса/Уэ 4314 0,16±0,02* 2,75±0,15*
£ ГаесаИв 208 0,16±0,04* 10,6±6,35*
* - статистически значимые отличия по сравнению с контролем (р< 0,05)
Подавление формирования мицелия у С. albicans могло быть связано с наличием в энтерокок-ковых метаболитах биологически активных веществ, обладающих либо ферментативной активностью, либо действующих как бактериоцины. Из данных, полученных нами ранее [7], известно, что Е. faecalis 179-2, Е. faecium 173-5 и Е. faecalis 4276 не имеют генов, кодирующих известные в настоящее время бактериоцины, однако все вышеуказанные штаммы имели выраженную антигифальную активность. Понимание механизмов антикандидозной стратегии бактерий микробиома чрезвычайно важно для создания условий, способных сдерживать кандидоноси-тельство и препятствовать развитию клинически выраженного кандидоза у человека.
Замечено, что при увеличении времени культивирования Candida с метаболитами энтерококков до 5 суток антигифальный эффект нивелировался: на этом этапе эксперимента объем гифальной массы в опытных образцах не отличался от контроля
(р>0,05). Это могло быть связано с биодеградацией действующих веществ в субстрате в течение данного периода времени. Таким образом, воздействие экзогенных продуктов метаболизма энтерококков на грибы замедляет образование гифальных элементов у микромицетов, но не отменяет полностью способность к формированию гиф С. albicans.
ВЫВОДЫ
1. Экзогенные продукты метаболизма всех исследуемых штаммов энтерококков способны подав-
лять формирование мицелиальной формы С. albicans.
2. Молочная кислота, синтезируемая энтерококками, не оказывает существенного влияния на гифо-образование С. albicans.
3. Ингибирование образования гиф у С. albicans в присутствии метаболитов энтерококков, вероятнее всего, связано с действием бактериальных экзофер-ментов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Silva-Rocha W.P., de Brito Lemos V.L., Ferreira M.R.A., et al. Effect of the crude extract of Eugenia uniflora in morphogenesis and secretion of hydrolytic enzymes in Candida albicans from the oral cavity of kidney transplant recipients. BMC Complement Altern. Med. 2015; 15: 6. doi: 10.1186/sl2906-015-0522-x
2. Li К, Jiao P., Li Y., Gong Y., Chen X., Sun S. The synergistic antifungal effect and potential mechanism of d-penicillamine combined with fluconazole against Candida albicans. Front Microbiol. 2019; 10: 2853. doi: 10.3389/fmicb.2019.02853.
3. Vila Т., Sultan A.S., Montelongo-Jauregui I)., Jabra-Rizk M.A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. J. Fungi (Basel). 2020; 16; 6(1): 15. doi: 10.3390/jof6010015
4. Marinho S.A., Teixeira A.B., Santos O.S., et al. Identification of Candida spp. by phenotypic tests and PCR. Braz. J. Microbiol. 2010; 41 (2): 286-294. doi: 10.1590/S1517-83822010000200004
5. Пестрикова Т.Ю., Юрасоеа E.A., Котельникова A.B. Вульвовагинальный кандидоз: современный взгляд на проблему. РМЖ. Мать и дитя. 2017; 25 (26): 1965-1970. [Pestrikova T.Yu., Yurasova Е.А., Kotelnikova A.V. Vulvovaginal candidiasis: a modern view of the problem. The mother and child. 2017; 25 (26): 1965-1970 (In Russ)].
6. Barbosa J. O., Rossoni R.D., Godinho Vilela S.F., et al. Streptococcus mutans can modulate biofilm formation and attenuate the virulence of Candida albicans. PLoS One. 2016; 11 (3): e0150457. doi: 10.1371/journal.pone.0150457
7. Заславская М.И., Александрова H.A., Лукова O.A. и др. Влияние продуктов метаболизма энтерококков на адгезию Candida albicans (Berkhout) к буккальным эпителиоцитам in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2016; 18 (3): 55-59. [Zaslavskaya M.L., Alexandrova N.A., lukova O.A., et al. Effect of enterococcal metabolic products on the adhesion of Candida albicans (Berkhout) to buccal epithelial cells in vitro. Problems in Medical Mycology. 2016; 18 (3): 55-59 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала 07.10.2020 Рецензент: Т. С. Богомолова
