CC BY
26УДК 611.671:616.594.171.2:579.8
ВЗАИМООТНОШЕНИЯ CANDIDA С
ЭНТЕРОКОККАМИ НА УРОВНЕ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА
Александрова Н.А. (аспирант кафедры)*, Заславская М.И. (профессор кафедры)
Нижегородская государственная медицинская академия (кафедра микробиологии и иммунологии), Нижний Новгород, Россия
© Александрова Н.А., Заславская М.И., 2016
Выявлена обратная корреляция между количеством Candida и энтерококков в вагинальном содержимом у женщин. Зависимость между титрами Candida и лактобактерий в том же биотопе не обнаружена. Было установлено, что продукты метаболизма энтерококков подавляют колонизацию Candida albicans в вагинальной полости у крыс с вагинальным кандидозом.
Ключевые слова: вагинальный кандидоз, Candida, лактобацил-лы, энтерококки
INTERRELATION OF CANDIDA WITH ENTEROCOCCI IN VAGINAL BIOTOPE
Alexandrova N.A. (postgraduate student of the chair), Zaslavskaya M.I. (professor of the chair)
Nizhny Novgorod State Medical Academy (Chair of microbiology and immunology), Nizhny Novgorod, Russia
© Alexandrova N.A., Zaslavskaya M.I., 2016
An inverse correlation between the number of Candida and enterococci in the vaginal content of women has been revealed. The correlation between the titers of Candida and lactobacilli in the same biotope was not detected. It was found that the products of metabolism of enterococci inhibit colonization of Candida albicans in the vaginal cavity of rats with vaginal candidosis. Key words: Candida, enterococci, lactobacilli, vaginal candidosis
ВВЕДЕНИЕ
Среди оппортунистических микозов, вызываемых грибами рода Candida, постоянно отмечают высокий уровень вагинального кандидоза у женщин детородного возраста [1, 2]. Известно, что на присутствие Candida на слизистых оболочках может оказывать влияние качественный и количественный состав микробиоты [3]. По данным научной литературы, доминирующими представителями вагинальной микро-биоты являются лактобациллы, способные подавлять рост оппортунистических патогенов [4]. К минорным представителям микробиоты влагалища относят представителей родов Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Ureaplasma, семейства Enterobacteriaceae и пр. [2, 5], однако их вклад в обеспечение колонизационной резистентности слизистой оболочки влагалища менее изучен. Известно, что энтерококки, являющиеся представителями нормальной вагинальной микробио-ты и способные выделять бактериоцины, подавляющие рост различных микроорганизмов, используют в производстве пробиотических препаратов [6]. Эта способность энтерококков активно противостоять
* Контактное лицо: Александрова Наталья Александровна, e-mail: natalyuskova@rambler.ru
другим микроорганизмам в биоценозе послужила стимулом для исследования взаимоотношения Candida с бактериями рода Enterococcus на уровне вагинального биотопа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали вагинальное содержимое у женщин (18-35 лет), проходящих амбулаторное обследование на базе гинекологического отделения ООО «Клиника современных технологий «Садко»». Полученный материал засевали на плотные среды Сабуро и «энтерококк агар» по методу Дригальского (0,1 мл и 0,05 мл вагинального содержимого соответственно), а также на жидкую среду MRS (deMan, Rogosa and Sharpe), куда вносили в пробирку по 0,5 мл из разведений (10-3 и 105) нативного (10-1) материала. Посевы инкубировали (37 °С, 48 ч), после чего подсчитывали количество выросших колоний Candida и энтерококков. Вычисляли количество КОЕ в 1 мл нативного материала по формуле: x=ax10n+1, где x - количество микроорганизмов в 1 мл нативного материала, a - количество выросших колоний, n - степень разведения. Для определения титра (степень обсемененности) лактобацилл в вагинальном содержимом оценивали наличие роста бактерий в пробирках с MRS с различным разведением нативно-го материала (10-3 и 10-5), для чего из осадка бульонных культур готовили мазки, которые окрашивали по методу Грама. В статистическом корреляционном анализе участвовали лишь те образцы вагинального содержимого, которые соответствовали критериям: 1) наличие Candida; 2) наличие энтерококков; 3) наличие Candida и энтерококков. Видовую идентификацию микромицетов проводили на HiChrome агаре (Индия), энтерококков - с помощью наборов для биохимической идентификации Эн-коккус тест (Erba Lachema, Чехия) согласно инструкции фирмы-производителя.
Моделировали вагинальный кандидоз на белых беспородных крысах-самках (30 особей). Чистую культуру C. albicans штамм 601 получали на агаре Сабуро (37 °С, 24 ч). В работе использовали чистую культуру E. faecium L-3 (штамм предоставлен ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург), выращенную на мясо-пептонном агаре (МПА) (37 °С, 24 ч), и супернатант бульонной культуры (среда ТСБ / триптонно-соевый бульон/; 37 °С, 24 ч) того же штамма. В вагинальную полость крыс вводили 0,2 мл суспензии Candida (109 кл/мл) [7].
Через 2 суток после заражения крыс грибами животным вводили в вагинальную полость 0,1 мл очищенного центрифугированием супернатанта бульонной культуры E. faecium L-3 (группа животных № 1) или суспензию живых энтерококков (109 кл/мл) (группа животных № 2). Внутривагинальное введение энтерококков осуществляли ежедневно на протяжении 7 дней. В контрольной группе животных (группа №3) для интравагинального введения применяли стерильный бульон ТСБ. Каждые 2 суток выполняли забор содержимого вагины тампоном в пробирку с 1 мл стерильного ЗФР. Материал ресуспендировали, затем 0,1 мл суспензии засевали на агар Сабуро. Посевы инкубировали (37 °С, 24 ч) и производили подсчет выросших колоний C. albicans на чашках Петри.
Взаимосвязь параметров оценивали методом корреляционного анализа, определяя коэффициент ран-
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ, 2016, Т.18, №4
говой корреляции Спирмена (rs). Силу корреляционной связи выявляли по значению rs: ниже 0,3 считали слабой, от 0,3 до 0,7 - средней и от 0,7 до 1,0 - сильной.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Был проведен микробиологический анализ содержимого влагалища, полученного от 552 женщин детородного возраста с дисбиозом влагалища различной этиологии. Для исследования были отобраны 399 вагинальных образцов, в которых выявляли Candida spp. и/или энтерококки. В клиническом материале от 205 женщин (51%) были обнаружены Candida spp. в разных титрах: 108 образцов имели концентрацию до 104 КОЕ/мл, 72 - свыше 104 и до 105 КОЕ/мл, 25 - свыше 105 КОЕ/мл. При этом из 95% образцов была выделена C. albicans. Энтерококки выявили у 235 женщин (59%): в 50 случаях - в пределах нормы (до 103 КОЕ/мл), в 128 -от 103 КОЕ/мл до 105 КОЕ/мл, в 57 - свыше 105 КОЕ/мл.
При анализе вагинального содержимого отмечали, что в отсутствие энтерококков, в 52% случаев количество Candida spp. было до 104 КОЕ/мл, а в 48% - превышало это значение (из них в 7% - выше 106 КОЕ/мл) (табл. 1).
Таблица 1
Средний процент встречаемости Candida в вагинальном содержимом у женщин при различных титрах энтерококков
титр Candida ТИТр N.. Enterococcus spp. отсутствие Candida до 104 КОЕ/ мл 10 4 - 105 КОЕ/мл 106 КОЕ/мл и выше
отсутствие энтерококков - 52»% 41% 7%
до 103 КОЕ/мл (норма) 79% 13»% 8% -
свыше 103 КОЕ/мл 89% 6% 5% -
При наличии в вагинальном содержимом энтерококков в норме (до 103 КОЕ/мл) у 79% женщин микромицеты отсутствовали, у 13% - не превышали 104 КОЕ/мл и только у 8% - были >104 КОЕ/мл и до 106 КОЕ/мл.
При повышении количества энтерококков свыше
103 КОЕ/мл у 89% пациенток грибы отсутствовали, что было несколько выше, чем при нормальной концентрации энтерококков в том же биотопе, у 6% - концентрация Candida не превышала 104 и у 5% - была выше
104 КОЕ/мл.
Обратная зависимость между количеством микро-мицетов и энтерококков в вагинальном содержимом показана на рисунке 1. Видно, что при повышении титра энтерококков количество Candida стремилось к нулю.
Был проведен корреляционный анализ полученных данных для выборок с распределением, отличным от нормального, методом Спирмена. Коэффициент корреляции по Спирмену (rs) составил -0,66, что говорит об обратной зависимости и средней силе корреляционной связи между популяциями энтерококков и Candida.
Таким образом, полученные результаты служат показателем антагонистических взаимоотношений между энтерококками и грибами, что проявляется в подавлении размножения последних на фоне нормальной или повышенной концентрации энтерококков во влагалище у женщин детородного возраста.
2СООО зато топ
Титр энтерококков (КОЕ/мл)
Рис. 1. Зависимость титра Candida от содержания энтерококков в вагинальном содержимом у женщин.
Мы также провели дополнительные исследования взаимоотношений Candida и энтерококков с лакто-бактериями, поскольку последние являются доминирующей микробиотой влагалища [5, 8]. Известно, что количество лактобактерий во влагалище здоровых женщин лабильно и изменяется под влиянием различных факторов. Так, на титр лактобацилл оказывают влияние гормональный статус женщины, день менструального цикла, климатические условия проживания, уровень личной гигиены, спектр условно-патогенной биоты во влагалище и пр. [9].
У пациенток определяли титр лактобацилл в вагинальном содержимом. За норму считали количество не ниже 105 КОЕ/мл [10]. Наблюдали отсутствие какой-либо корреляции между концентрациями (титрами) Candida и лактобактерий в вагинальном содержимом: rs = 0,16 (Рис. 2).
Рис. 2. Зависимость титра Candida от содержания лактобацилл в вагинальном содержимом у женщин.
При статистической обработке результатов было установлено, что лактобактерии и Candida не проявляют выраженного антагонизма на уровне вагинального биотопа и способны сосуществовать в различных титрах. Это хорошо согласуется с данными других авторов, которые указывают, что при рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе у женщин сохраняется общее число лактобацилл [4].
Таким образом, нашими исследованиями продемонстрировано, что из двух исследованных групп бактерий - представителей вагинального биотопа только энтерококки способны регулировать количество
Candida в вагинальном содержимом. Для проверки этого предположения был проведен ряд экспериментов на белых беспородных крысах-самках с вагинальным кандидозом. На фоне введения в вагинальную полость крыс метаболитов энтерококков (группа 1) или взвеси энтерококков (группа 2) наблюдали снижение количества Candida по сравнению с контрольной группой 3, в которой вместо энтерококков использовали стерильный ТСБ (Рис. 3).
При этом в группе 1 (введение продуктов метаболизма энтерококков) отмечали заметную тенденцию снижения концентрации Candida в вагинальной полости у крыс. В итоге на 7-е сутки титр микромицетов в вагинальном содержимом не превышал 2,6-102 КОЕ/ мл. В группе 2 (введение суспензии живых энтерококков) также выявили снижение концентрации грибов, но данный эффект наступал позже, чем в группе 1, и был менее стабильным. В контрольной группе, в большинстве случаев, титр C. albicans в вагинальном содержимом не снижался и на 7-е сутки превышал 1,0-103 КОЕ/мл (Рис. 3).
Количество Candida I мл
1200 т—
О I-1-г-1-I
0 3 5 7
Эксперимент с энтерококками (дни)
Рис. 3. Концентрация Candida в вагинальном содержимом у крыс на фоне интравагинального введения метаболитов энтерококков (группа 1), взвеси энтерококков в ТСБ (группа 2) или стерильного ТСБ (контрольная группа).
Таким образом, наиболее выраженный антиканди-дозный эффект наблюдали при введении в вагинальную полость крыс с кандидозом концентрата метаболитов энтерококков, а не суспензии живых бактерий. Это могло быть связано с тем, что энтерококки были вынуждены вступать в антагонистические отношения с микромицетами, что тормозило рост бактерий и, соответственно, продукцию ими биологически активных антифунгальных субстанций. Согласно полученным результатам можно утверждать, что именно растворимые продукты метаболизма энтерококков определяют, в большей степени, антикандидозную активность Enterococcus spp.
ВЫВОДЫ
1. Было выявлено, что Candida и энтерококки являются антагонистами в вагинальной полости у женщин детородного возраста, при этом повышение титра энтерококков сопровождается снижением титра грибов.
2. Лактобактерии не оказывают существенного влияния на присутствие и концентрацию Candida в вагинальной полости у женщин детородного возраста в вагинальном биотопе.
3. Продукты метаболизма энтерококков способствуют снижению уровня колонизации вагинальной полости C. albicans в экспериментальных моделях на крысах, что приводит к ускорению элиминации ми-кромицетов.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Буданов П.В., Стрижакова M.A. Новое в терапии нарушений микроценоза влагалища// Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2006. - Т.5, №1. - С. 104-108.
2. Попова А.Л., Дворянских С.А., Яговкина Н.В. Современные аспекты лечения и профилактики вульвовагинального кан-дидоза (обзор литературы) // Вятский медицинский вестник. - 2013. - №4. - С. 31-36.
3. Занько С.Н. Вагинальный кандидоз // Охрана материнства и детства - 2006. - № 1-7.- С. 64-71.
4. Крупейченко В.В., Барановская Е.И. Микрофлора влагалища у беременных, больных вульвовагинальным кандидозом // Охрана материнства и детства - 2009. - №2. - С. 93-95.
5. Цизина Е.А., Ильина Н.А. Нормоценоз влагалища и его влияние на здоровье женщин // Молодой ученый. - 2011. - Т.2, №8. - С. 152-156.
6. Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Симбиотические энтерококки и проблема энтерококковой оппортунистической инфекции. - М., 2007. - С. 30.
7. Ускова Н.А., Махрова Т.В., Суворов А.Н., Заславская М.И. Влияние Enterococcus faecium на развитие экспериментального кандидоза у крыс // Проблемы мед. микологии. - 2012. - Т.14, №2. - С. 131-132.
8. Бондаренко К.Р., Озолиня Л.А., Бондаренко В.М., Шпирко В.О. Особенности влагалищной микроэкосистемы в период гестации (обзор литературы)// Вестник РГМУ - 2014. - №4. - С. 6-11.
9. Мусаева З.М. Микробиоценоз влагалища и его коррекция // Проблемы женского здоровья. - 2008. - Т. 3, №3.- С. 43-53.
10. Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р., Анкирская А.С. ФГУ Вагинальная микоэкосистема влагалища в норме и при патологии // Гинекология. - 2009. - Т. 11, №3. - С. 9-11.
Поступила в редакцию журнала 20.09.2016
Рецензенты: С.М. Игнатьева, И.А. Босак
