CC BY
31
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №12-4/2016 ISSN 2410-6070
нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников». Не соответствие наблюдается в кислотности (водородный показатель) в родниках №1 и в в роднике «Иулиании Лазаревской» - вода кислая. По остальным показателям: окисляемость, жесткость, содержание хлоридов, пробы родниковой воды соответствуют нормам СанПиН 2.1.4.1175-02. Список использованной литературы:
1. 1.Захарова И.К. Оценка качества родниковой воды села Лазарево Владимирской области// Машиностроение и безопасность жизнедеятельности. 2015. № 1 (23). С. 5-10.
2. 2. Димакова Н.А., Шарапов Р.В. Проблема загрязнения подземных вод// Современные наукоемкие технологии. 2013. № 2. С.79-82.
3. 3. Шарапов Р.В. Структура системы мониторинга подземных вод // Машиностроение и безопасность жизнедеятельности. 2012. № 4 (14). С. 20-23.
4. 4.Шарапов Р.В. Проблема интеграции данных мониторинга подземных вод// Современные наукоемкие технологии. 2013. № 12. С. 67-69.
5. 5.Шарапов Р.В. Организация автоматического наблюдения за состоянием поверхностных вод//Машиностроение и безопасность жизнедеятельности. 2014. № 2 (20). С. 32-38.
6. 6. Плотников Н.И. Подземные воды - наше богатство. М.; «Недра», 1976. - 207 с.
7.Шарапов Р.В. Принципы мониторинга подземных вод // Машиностроение и безопасность жизнедеятельности, №3, 2012. - С. 274-30.
© Захарова И.К., 2016
УДК 582.483:578.083
А.А. Муравлёв, К.б.н.
Т.Г. Рогожина, К.б.н.
Е.В. Чеснокова, М.н.с.
ФГБНУ ВНИИ рапса г. Липецк, Российская Федерация
ВЛИЯНИЕ ПРЕДОБРАБОТКИ, НАЧАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ,
ПИТАТЕЛЬННЫХ СРЕД И ГЕНОТИПА НА ОТЗЫВЧИВОСТЬ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO
ГОРЧИЦЫ БЕЛОЙ (SINAPIS ALBA L.)
Аннотация
Изучали влияние предварительной обработки бутонов, температур начального этапа культивирования, состава питательной среды и генотипа на андрогенез пыльников in vitro горчицы белой.
Ключевые слова
Культура пыльников, питательная среда, предобработка, органогенез, вторичные структуры.
Горчица белая (Sinapis alba L.) является одной из масличных капустных культур. В семенах большинства сортов содержится до 36 % жира, 29 % белка; наличие эруковой кислоты 30 % и глюкозинолатов более 1,0 %. Период вегетации составляет 60-70 суток. Растения устойчивы к засухе и высоким температурам, в период уборки стручки не растрескиваются.
Использование рекомендуемого регламента в культуре пыльников in vitro не всегда способствует индукции эмбриоидов. Среди капустных культур более изучена технология получения дигаплоидных растений у ярового рапса. И элементы технологии переносят на другие виды капустных культур.
Использование пониженных положительных температур (4-5оС), перед помещением пыльников на питательную среду является самым распространённым и эффективным приёмом в повышении выхода
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №12-4/2016 ISSN 2410-6070_
эмбриоидов из пыльников у многих культурных видов [1, 2, 3].
Исследования Sharma и Bhojwani и George, Rao показали, что эмбриоидогенез горчицы сарептской (Brassica juncea) стимулировало предварительное культивирование пыльников при 35оС в течение 1-5 суток с последующим перенесением на 25оС. Частота индукции эмбриоидов составила 3%. Также эмбриоидогенезу способствовало начальное культивирование при 5оС в течение 3 суток [4, 5].
Иногда для стимуляции андрогенеза пыльников in vitro перед сбором пыльников донорные растения обрабатывали парааминовой кислотой [6].
Первые положительные результаты по культивированию пыльников in vitro горчицы белой получили Klimaszewska, Keller [7]. Было показано, что начальная температура культивирования пыльников 35оС в течение 2 суток с последующим культивированием при 25оС позитивно влияет на андрогенез пыльников. Частота эмбриоидогенеза увеличивается при сочетании температур культивирования 35оС в течение 2 суток затем 2 часа при 40оС и последующее культивирование при 25оС.
В большинстве случаев с целью повышения индукции эмбриоидогенеза пыльников используют различные варианты питательных сред.
Изменяя минеральные составы питательных сред и их чередование в период культивирования каллусов, Leelavathi с соавторами [8] получили высокую отзывчивость пыльников - более 90%. Донорные растения горчицы белой выращивали при средней температуре день/ночь от 25-34/14-25оС. Изучаемые среды формировали каллус или неправильные структуры, они сохраняли высокую потенциальную возможность формировать вторичные эмбриоиды и проростки. Цитологический анализ полученных растений, в том числе и растений из вторичных эмбриоидов показал наличие 80% гаплоидных растений.
Поиск оптимальных условий индукции эмбриоидогенеза в культуре пыльников in vitro горчицы белой является актуальным.
Методика исследований. В изучении андрогенеза пыльников горчицы белой использовали донорные растения, выращенные в полевых условиях. Бутоны собирали в течение всего периода цветения растений, начиная с появления первых цветков на растении. Периодически определяли маркерные параметры (длину и цвет) пыльника, соответствующие одноядерной и ранней двуядерной стадии развития микроспор. Размер бутонов находился в интервале 1,0-1,5 мм.
Бутоны стерилизовали в 70% спирте 10-20 секунд, затем 7-10 минут в 7% растворе «Domestos» или 50%-ном водном растворе гипохлорида натрия. Бутоны промывали 3-4 раза стерильной дистиллированной водой.
Пыльники сорта Рапсодия вводили в культуру в день сбора или после охлаждения: 1 вариант -предобработка бутонов холодом 0 часов, культивирование пыльников при температуре 26°С; 2 -предобработка бутонов холодом 0 часов, культивирование пыльников при температуре 35°С двое суток; 3 -предобработка бутонов холодом 24 часа, культивирование пыльников при температуре 26°С; 4 -предобработка бутонов холодом 24 часа, культивирование пыльников при температуре 35°С двое суток.
Изолирование и посадку пыльников горчицы белой проводили в асептических условиях, на питательную среду МС Murashige, Skoog [9] и B5 в модификации Келлера и Армстрона [10]. Среда МСВ5 содержит макросоли МС, а микросоли В5 с добавками по прописи Келлера [10].
В качестве регуляторов роста использовали 2,4-Д, (2,4 - дихлорфеноксиуксусная кислота) - 0,1 мг/л, НУК (нафтилуксусная кислота) - 0,1 мг/л, 6-БАП (6-бензиламинопурин) - 0,1, 0,2, 1,0 мг/л и кинетин - 0,1. 0,4 мг/л.
Культивирование пыльников проводили в темноте до формирования вторичных структур (эмбриоидов, каллусов). Вторичные структуры пересаживали на органогенную среду МС с добавлением 6-БАП - 3,0 мг/л и НУК - 0,5 мг/л.
Результаты исследований
В исследованиях изучали влияние условий предобработки бутонов на процесс образования вторичных структур в пыльниках горчицы белой. Изолированные пыльники культивировали на питательной среде МС с добавлением 2,4-Д и НУК по 0,1 мг/л.
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №12-4/2016 ISSN 2410-6070_
В результате культивирования пыльников in vitro горчицы белой индукцию вторичных структур получили на трёх вариантах (табл. 1). Лучшая индукция пыльников получена во втором варианте 1,17%. Пыльники, введённые в культуру в день срыва бутонов, не прошедших обработку пониженными положительными температурами (1 и 2 варианты), формировали вторичных структур больше, чем в 3 и 4 вариантах. Частота образования вторичных структур составила 0,17 в первом и 1,17% во втором варианте. Различия между 1 и 2 вариантами достоверны (НСРо,о5 - 0,56).
Таблица 1
Влияние условий культивирования на индукцию эмбриоидов в культуре пыльников горчицы белой сорта Рапсодия
Вариант Количество, шт. Частота, %
культивируемых пыльников вторичных структур выхода вторичных структур
1 532 3 0,56
2 428 5 1,17
3 562 0 0
4 579 1 0,17
Обработка бутонов «холодом» (варианты 3 и 4) оказалась неэффективной. Частота образования вторичных структур составила от 0,0 до 0,17%, соответственно.
Таким образом, обработка бутонов пониженными положительными температурами перед изолированием пыльников снижает частоту выхода структур, а культивирование пыльников при температуре 35°С двое суток после изолирования стимулирует их образование.
Результаты культивирования пыльников горчицы белой, сорта Рапсодия, на питательных средах представлены в таблице 4.
Таблица 4
Влияние среды культивирования на индукцию эмбриоидов в культуре пыльников in vitro горчицы белой
Вариант Среда Регуляторы роста, мг/л Количество культивируемых пыльников, шт. Количество вторичных структур, шт. Частота выхода вторичных структур, %
1 В5 2,4-Д - 0,1, НУК -0,1 324 0 0
2 В5 6-БАП - 0,1, кинетин - 0,1 1343 1 0,07 с
3 В5 6-БАП - 1,0, кинетин - 0,4 320 0 0
4 В5 6-БАП - 0,2 538 2 0,37 сd
5 МС 2,4-Д - 0,1, НУК - 0,1 351 1 0,28 сd
6 МС 6-БАП - 0,2 209 3 1,43 а
7 МС 6-БАП - 0,1, кинетин - 0,1 407 5 1,23 аЬ
8 МС 6-БАП - 1,0, кинетин - 0,4 266 2 0,75 аЬс
9 МСВ5 2,4-Д - 0,1, НУК - 0,1 776 1 0,12 сd
10 МСВ5 6-БАП - 0,2 1289 4 0,03 d
НСР0,05 0,68
Максимальную индукцию вторичных структур наблюдали на среде 6 варианта (МС с добавлением 6-БАП в концентрации 0,2 мг/л) - 1,43%. Лучшие варианты индуцировали вторичные структуры с частотами 1,43, 1,23 и 0,75%, соответственно 6, 7, 8 вариантам сред с минеральной основой МС. Различия между вариантами не достоверны.
Среда 1 варианта, используемая для культуры пыльников рапса, не эффективна для культивирования пыльников горчицы белой. Также не эффективно использование фитогормонов 2,4-Д и НУК в концентрации 0,1мг/л с минеральной основой МС. Что не позволяет использование их в дальнейших исследованиях.
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №12-4/2016 ISSN 2410-6070_
Сочетание минеральных солей разных питательных сред (МСВ5) с разным составом регуляторов роста формировало вторичные структуры с частотой 0,12 и 0,03%. Полученные результаты уступают лучшим вариантам.
Пыльники индуцировали вторичные структуры в виде глобулярных и ненормальных типов эмбриоидов, а также в виде каллусной ткани (рисунок 1).
Рисунок 1 - Эмбриоид горчицы белой ненормального типа.
Анализы пыльников горчицы белой в период культивирования показали, что первые видимые процессы в изменении пыльников наступают в первую неделю культивирования - потеря окраски, интенсивное разрастание тычиночной нити. Некоторые пыльники лопались, и на их поверхности появлялся матовый каллус, который переносили на органогенную среду.
В таблице 3 представлены результаты культивирования пыльников 4 сортов на среде МС с добавлением 6-БАП в концентрации 0,2 мг/л.
Таблица 3
Андрогенез пыльников in vitro сортов и гибридов горчицы белой
Наименование Количество, шт. Частота выхода структур,%
культивируемых пыльников вторичных структур
Рапсодия 2102 6 0,28
Зеленда 3020 3 0,09
К-4204 372 0 0
К-4197) 805 2 0,25
Всего: 6299 11 0,17
НСР0,05 0,14
Индукция пыльников в опыте составила 0,17%. Пыльники, собранные с донорных растений сортов Зеленда, Рапсодия и образеца коллекции ВИР К-4197 (Индия), формировали вторичные структуры с частотой 0,09, 0,28 и 0,25%, соответственно. Различия между сортами не достоверны.
Пыльники образца К-4204 (Канада) не индуцировали структуры. На третий день культивирования наблюдали чёрные пятна на срезе тычиночной нити. После 2 недель культивирования пыльники некротизировали, соматический каллус формировал корни.
Глобулярные эмбриоиды и каллусная ткань, пересаженные на органогенную среду, формировали зелёные морфогенные структуры (почки), затем пробирочные растения (рисунок 2). Полученные из каллусной ткани пробирочные растения не формировали корни, многократные пересадки на свежую среду не привели к формированию корневой системы.
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №12-4/2016 ISSN 2410-6070
Рисунок 2 - Пробирочное растение горчицы белой без корневой системы
Таким образом, пыльники донорных растений изучаемых генотипов являются не отзывчивыми на эмбриоидогенез в культуре пыльников in vitro на изучаемых средах.
Список использованной литературы:
1. Искакова, К. М., Тивари Ш. Влияние обработки холодом на образование андрогенных структур и регенерацию растений в культуре пыльников ячменя. / К. М. Искакова, Ш. Тивари // Проблемы современной биологии: Тр. 20 науч. конф. мол. учёных биол. фак. МГУ, Москва, 24 - 28 апр.,1989 // МГУ, - М.: - 1990. -С.87-91. - Деп. в ВИНИТИ 05. 02. 90, № С.41 - В 90.
2. Hadwiger, M. A., Heberle - Bors E. Pollen plant production in Triticum turgidun ssp. durum. / M. A. Hadwiger, E. Heberle - Bors // Genetic manipulation in plant breeding. - 1986. - P. 303-306.
3. Муравлёв, А.А., Артамонов А.А. Технология получения удвоенных гаплоидов ярового рапса. / А.А. Муравлёв, А.А. Артамонов / Москва, Россельхозакадемия, 2009 г. с 24.
4. Sharma, K.K., Bhojwani S.S. Microspore embryogenesis in anther cultures of two Indian cultivars of Brassica juncea (L.) Czern. / K.K. Sharma, S.S. Bhojwani // Plant Cell Tissue Organ Cultire. - 1985. - 4. - P. 235-239.
5. George, Leela, Rao P.S. In vitro induction of pollen embryos and plantlets in Brassica juncea through anther culture. / Leela George, P.S. Rao / Plant Science Letters - 1982 - N 26, - P. 111-116.
6. Раджи А. С. Влияние обработки донорных растений парааминобензойной кислотой на выход каллуса и регенерантов в культуре пыльников яровой пшеницы. / А.С. Раджи, Г.И. Иванова, В.В. Ефремова // Труды Кубанского гос. агр. унив. - 1991. - № 320. - С. 62-66.
7. Klimaszewska, K., Keller W.A. The production of haploids from Brassica hirta Moench (Sinapis alba L.) anther cultures. / K. Klimaszewska, W.A. Keller. / Z. Pflanzenphysiol. - 1983. - 109. - Р. 235-241.
8. Leelavathi, S. Somatic cell genetic studies in Brassica species. 1. High frequency production of haploid plant in Brassica alba (L.) H.f. & T. / S. Leelavathi, V.S. Reddy, S.K. Sen // Plant Cell Reports. - 1984. - 3. - P. 102-105.
9. Murashige, T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant - 1962. - V. 15. - P. 473-497.
10. Keller, W.A., Armstrong K.C. High frequency production of microspore-derived plants from Brassica napus anther cultures. / W.A. Keller, K.C. Armstrong / Z., Pflanzenzuchtg. - 1978. - V. 80. - P. 100-108.
© Муравлёв А.А., 2016
