CC BY
165
ГЕНЕТИКА, БИОТЕХНОЛОГИЯ, СЕЛЕКЦИЯ И СЕМЕНОВОДСТВО
Известия ТСХА, выпуск 1, 2015 год
УДК 635.33:581.4
ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ (BRASSICA OLERACEA L.) IN VITRO
Р.Н. КИРАКОСЯН, Е.А. КАЛАШНИКОВА (РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева)
Установлено, что присутствие в среде МС гормонов НУК в концентрации 1 мг/л, Дропп — 0,01 мг/л стимулировало процесс прямого эмбриогенеза. В этих условиях микроспоры внутри пыльника сохраняли свою жизнеспособность на протяжении длительного выращивания в условиях in vitro. Проведенный цитологический анализ растений-регенерантов (подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и хромосом в меристеме корня) подтвердил их гаплоидную природу.
Ключевые слова: белокочанная капуста, культура микроспор, изолированные пыльники, изолированные завязи, in vitro, андрогенез, гиногенез.
Селекция различных сельскохозяйственных культур остается длительным и трудоемким процессом, основанным преимущественно на внутривидовой гибридизации с последующим отбором растений, использованием инфекционно-провокационных фонов для оценки посадочного материала на устойчивость к стрессовым факторам среды, и в зависимости от вида растения вегетативного или репродуктивного способов размножения [1].
Метод культуры клеток, тканей и органов в настоящее время является общепризнанным и широко внедряется при решении многих проблем современной биологии, физиологии и селекции растений. Поэтому сочетание традиционных и биотехнологических методов селекции является эффективным в создании новых сортов с одновременным повышением продуктивности и устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам.
Большой практический интерес представляет культивирование пыльников и изолированных микроспор для получения удвоенных гаплоидных растений. В популяции удвоенных гаплоидов, т.е. однородных гомозиготных линий, легче проводить отбор по хозяйственно ценным признакам, чем в сложных популяциях первых гибридных поколений, в которых обычно проводится отбор. Известно, что эффективность отбора определяется соотношением компонент генотипической и средовой изменчивости в популяции. Фенотипическая изменчивость в популяциях удвоенных
18
гаплоидов определяется только аддитивными эффектами генов и условиями выращивания. В искусственно созданной популяции, состоящей из линий удвоенных гаплоидов, эффективность отбора приближается к 100%. Использование удвоенных гаплоидных линий позволяет проводить более эффективно отбор желаемых генотипов из сравнительно небольших популяций по сравнению с традиционной технологией выделения самоопылённых генотипов [5]. В связи с тем, что у гаплоидов отсутствует явление доминантности, их можно успешно использовать в мутационной селекции, а также для передачи генов от полиплоидных видов диплоидным, при решении теоретических вопросов, связанных с происхождением видов, созданием серий моносомиков.
Капуста белокочанная (Brassica oleracea L.) — универсальная культура, широкому распространению которой способствовали ее ценные хозяйственные свойства: высокая урожайность, наличие большого сортового разнообразия различной скороспелости, а также лежкоспособность используемых органов, что позволяет иметь свежую продукцию в течение года. Биологические особенности капусты обуславливают возделывание ее на всей территории Российской Федерации. В кочанах капусты в обилии содержатся витамины Р, К, В1, В2, РР, С, инозит, фолиевая кислота, биотин. Все эти вещества и витамины полезны и необходимы для организма человека. Капуста богата полезными минеральными солями, в частности, калия, фосфора, есть кальция железо, марганец. Капуста является также источником сахаров и легкоусвояемых белков. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ — холестерина [4].
Немаловажное значение капуста имеет в качестве кормового растения для сельскохозяйственных животных и птиц, для чего в свежем или силосованном виде используют отходы от столовых сортов и специально культивируют кормовые сорта, но главным образом — листья капусты [4].
Капуста белокочанная является перекрёстноопыляемым растением, имеющим двухлетний цикл развития. В связи с этим селекционный процесс этой культуры является длительным, трудоемким и основан преимущественно на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбором, использовании инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды.
Работы по получению гаплоидных растений у представителей рода Brassica ведутся во многих странах. Однако факторы, от которых зависит эффективность пыльцевого эмбриогенеза, еще недостаточно изучены. В связи с этим актуальными проблемами повышения эффективности метода культуры пыльников являются выявление сортов, гибридов, линий, обладающих высокой андроклинной способностью, определение длины бутона на момент инокуляции пыльников, при которой микроспоры являются морфогенными, режим их стерилизации и состав питательной среды для их культивирования.
Методика проведения исследований
Работу проводили на сортах и гибридах F1 представителей рода Brassica белокочанной капусте (B. oleracea L.): гибрид F1 Юбилей, линии ЭТ1 и АМФ 3Л. Растения-доноры выращивали в теплице на Селекционной станции имени Н.Н. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в течение года.
Объектом исследования служили изолированные бутоны, микроспоры, завязи и семяпочки. Соцветия подвергали комплексной предобработке: 1) обработка соцве-
19
тий в течение 2-х сут. пониженными температурами (+4...+6°С); 2) затем обработка в течение 1-х сут. повышенными температурами (+32°С). Во всех предобработках в состав раствора входил нитрат серебра в концентрации 40 мг/л.
Для поверхностной стерилизации бутонов использовали в качестве стерилизующего агента сулему в концентрации 0,1%. Изолированные бутоны выдерживали в сулеме в течение 3-4 мин., после чего их промывали в 3-х порциях стерильной дистиллированной воды.
В работе использовали питательные среды по прописи Мурасиге и Ску-га (МС) [7] с добавлением сахарозы 2%, агара 0,8%, а также фитогормонов. В качестве веществ с цитокининовой активностью использовали Дропп, БАП (6-бензиламинопурин), в концентрациях 0,01-1,0 мг/л, в качестве веществ ауксино-вого типа — НУК, ИУК в концентрациях 0,5-1,0 мг/л. рН среды находился в пределах 5,5-5,8.
Пыльники асептически извлекали из бутонов в условиях ламинар-бокса и культивировали на индуцирующих питательных средах МС в чашках Петри, которые помещали в климакамеру (Binder, Германия) и инкубировали в темноте при температуре 35°С в течение 24 ч, после чего температурный режим уменьшали до 25°С. В этих условиях экспланты выращивали в течение 25 сут., затем переносили в световую комнату, где были установлены 16-часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью света 5 тыс. лк.
Придерживались правил работы в стерильных условиях, разработанных на кафедре генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева [2].
Цитологические исследования по подсчету хромосом и числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц проводили в соответствии с практикумом по цитологии и цитогенетике растений [6].
Результаты и их обсуждение
Успех получения каллусных и/или эмбриогенных гаплоидных структур зависит от правильной оценки исходного состояния развития гаметофита донорного растения. В работе изучали зависимость стадии развития микроспор от размера бутона и его расположения в главном и боковых соцветиях (табл. 1).
Как следует из таблицы 1, микроспоры на одноядерной стадии развития находятся, как правило, в бутонах, расположенных как на главном, так и на боковых соцветиях в рядах от 1 до 4 от его центра. Содержание микроспор в пыльниках в стадии ранней средней одноядерной (3 стадия) до поздней одноядерной (6 стадия) составляет 76,3-88,1%. Кроме того, при изолировании бутонов необходимо учитывать цвет пыльника, который должен иметь окраску светло-зеленого цвета.
Регуляторы роста представлены широким спектром природных и синтетических веществ, оказывающих воздействие на все этапы онтогенеза растений. Среди них особое место занимают природные фитогормоны и их синтетические аналоги, направленно регулирующие процессы, протекающие в растениях, что позволяет использовать их в биотехнологии in vitro. В работе изучали влияние различных регуляторов роста на процесс прямого органогенеза и эмбриогенеза. Особое значение было отведено препарату Дропп, который является нетрадиционным регулятором роста в работах по получению в условиях in vitro гаплоидных растений. Полученные результаты представлены в таблице 2.
20
Т а б л и ц а 1
Содержание микроспор, находящихся на разных стадиях развития в пыльнике в зависимости от места расположения бутона в соцветиях белокочанной капусты (В. о1егасеа 1_.), %
Место расположения бутона от центра соцветия, ряд Стадии развития микроспор
1-2 3-6 7-9
Центр соцветия 79,9 (77,2 ■ 83,0* 5,7 (1,4 ■ 6,7) 0
1-2 24,2 (16,1 ■ 29,3) 76,3 (67,2 ■ 83,0) 0
3-4 11,1 (5,7 ■ 15,2) 88,1 (82,1 ■ 91,2) 0
5-6 0 10,9 (6,3 ■ 16,4) 81,3 (75,1 ■ 87,1)
> 6 0 0 98,9 (95,4 ■ 99,9)
* Здесь и далее 95%-ный доверительный интервал.
Т а б л и ц а 2
Эффективность морфогенеза капусты белокочанной на питательной среде МС с различным сочетанием препарата Дропп, % (линия ЭТ1)
Препарат, мг/л НУК, мг/л
1 0,5 0,01
1 0 0 0
0,5 0 0 0
Дропп 0,2 Э*1,1 (0,3 ■ 2,4) Э*0,3 (0,1 ■ 1,8) 0
0,01 Э*8,6 (5,4 ■ 11,4) Э*1,3 (0,4 ■ 3,2) 0
Э* — эмбриогенез.
Из таблицы 2 следует, что в вариантах с присутствием препарата Дропп в концентрации 0,01 мг/л учитываемый показатель составил 8,6%, в варианте с 0,2 мг/л — 1,1%. При более высоких концентрациях Дропп в питательной среде процесс эмбриогенеза не был отмечен. Вероятно, повышенные концентрации гормона в питательной среде приводят к изменению метаболических процессов, что вызывает гибель пыльника и микроспор.
Полученный положительный эффект влияния препарата Дропп на процесс прямого эмбриогенеза для линии ЭТ1 был апробирован и для других генотипов капусты белокочанной (табл. 3).
21
Т а б л и ц а 3
Влияние различных концентраций препарата Дропп в питательной среде на индукцию прямого эмбриогенеза изолированных пыльников, %
(во всех вариантах содержание НУК — 1 мг/л)
Генотипы Концентрация Дроппа, мг/л
0,01 0,2 0,5 1,0
ЭТ1 8,7 (6,3 - 11,4) 3,1 (1,8 - 6,2) 1,2 (0,3 - 2,2) 0
АМФ 3Л 3,1 (2,6 - 5,2) 0,6 (0,2 - 2,5) 0 0
F., Юбилей 8,4 (5,9 - 10,9) "Î 2 5) 0,8 (0,3 - 1,9) 0
Экспериментально установлено, что повышенной морфогенетической активностью отличались линия ЭТ1 и гибрид F1 Юбилей. Для этих генотипов частота эмбриогенеза составила 8,7 и 8,4 % соответственно.
В дальнейшем полученные эмбриоиды изолировали от пыльника и самостоятельно культивировали на безгормональной питательной среде МС. В этих условиях эмбриоиды в течение 2-х недель развивались в проростки, которые в дальнейшем были перенесены на среды для размножения (минеральные соли — по прописи МС, Дропп — 0,01 мг/л, НУК — 1 мг/л, сахароза — 2%).
Для размножения растений был применен метод активации развития существующих меристем (черенкование). Содержание препарата Дропп в питательной среде существенно повысило морфогенетическую активность культивируемых тканей, что проявилось на коэффициенте размножения.
Дифференцированные адвентивные почки в процессе культивирования развивались в микропобеги, которые характеризовались активным ростом, формированием листа правильной морфологии и корневой системы (рис. 1).
Рис. 1. Микропобеги капусты белокочанной in vitro
22
Сформированные растения-регенеранты в дальнейшем были перенесены в почвенные условия выращивания (рис. 2).
Рис. 2. Растения-регенеранты капусты белокочанной
Установлено положительное влияние торфо-дернового субстрата (в соотношении 1:1) на адаптацию растений-регенерантов капусты белокочанной к условиям in vivo (рис. 3).
Рис. 3. Растения-регенеранты капусты белокочанной in vivo
23
Для косвенного доказательства гаплоидной природы полученных растений белокочанной капусты применен метод подсчета количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. Экспериментально установлено, что количество хлоропла-стов в клетках устьиц гаплоидного растения составило от 9 до 11 шт., в то время как у исходных донорных растений их было от 18 до 25 шт. (рис. 4).
Рис. 4. Хлоропласты в замыкающих клетках устьиц: а — донорные (диплоидные) растения; Ь — растения-регенеранты капусты белокочанной
Прямым доказательством гаплоидной природы растений капусты является цитологический метод подсчета хромосом в меристеме корня. Нами установлено, что у растений-регенерантов, полученных в культуре изолированных микроспор, одинарный набор хромосом (n = 9).
Таким образом, на основании экспериментальных данных нами были подобраны условия культивирования, обеспечивающие получение растений-регенерантов капусты белокочанной из изолированных пыльников и микроспор и доказана их гаплоидная природа.
Библиографический список
1. Бондарева Л.Л. Методы ускорения селекционного процесса у капусты // Картофель и овощи. 2005. № 4. С. 7.
2. Калашникова E.A., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии. M.: КолосС. 2006. 144 с.
3. Май Дык Чунг. Технология получения гаплоидных растений рапса (Brassica napus) in vitro // Известия ТСХА. 2010. Вып. 1. С. 86-91.
4. Петрушко Ю.Н., Потемкина В.И., Федяй В.П. Белокочанная капуста. Современная ресурсосберегающая технология выращивания в условиях Приморского края. Уссурийск, 2003. 76 с.
5. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна. Тверь, 2000. С. 78-95.
6. Пухальский В.А. Цитология и цитогенетика растений. М.: Изд-во МСХА. 2004. 118 с.
7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 1962. 15(13). Р. 473-497.
24
PRODUCTION OF REGENERATED WHITE CABBAGE PLANTS (BRASSICA OLERACEA L.) FROM REPRODUCTIVE ORGANS IN VITRO
R.N. KIRAKOSYAN, E.A. KALASHNIKOVA
(Russian Timiryazev State Agrarian University)
For cabbage we have optimized steps of obtaining regeneratedplants by direct embryogenesis from microspores of isolated anthers. It was found that the presence of hormones in MS medium at concentration of NAA — 1 mg/l, Dropp — 0.01 mg/l stimulated the process of direct embryogenesis. Under such conditions the microspores in anther maintain their viabilityfor a long period of growing in vitro. Cytological analysis ofregenerated plants (counting the quantity of chloroplasts in stomatal guard cells and chromosomes in root meristem) confirmed their haploid nature.
Key words: cabbage, microspore culture, isolated anthers, isolated ovules, in vitro, androgenesis, gynogenesis.
Киракосян Рима Нориковна — асп. кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, ул. Тимирязевская, 49; e-mail: [email protected]).
Калашникова Елена Анатольевна — д. б. н., проф. кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (916) 927-73-19; e-mail: [email protected]).
Kirakosyan Rima Norikovna — PhD-student of the Department of Genetics, Biotechnology, Plant Breeding and Seed Production, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; e-mail: [email protected]).
Kalashnikova Elena Anatolievna — Doctor of Biological Sciences, Professor of the Department of Genetics, Biotechnology, Plant Breeding and Seed Production, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; tel.: +7 (916) 927-73-19; e-mail: [email protected]).
25
