CC BY
45
УДК: 57.085.2
оптимизация технологической схемы получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (БЯЛЗЗТСЛ ОЬЕЯЛСЕЛ ь) в условиях культуры пыльников т УНЯО путем контроля гаметного происхождения растений-регенерантов пцр-анализом
C.B. ГАРКУША, доктор сельскохозяйственных наук, директор (e-mail: agroplazma@gmail.com) H.B. ЕПИФAНОBИЧ, аспирант Ж.М. МУХИНА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Е.Г. CABЕHКО, старший научный сотрудник B.A. ГЛАЗЫРИНА, старший научный сотрудник Л.А. ШУНДРИНА, научный сотрудник Bсероссийский научно-исследовательский институт риса, п. Белозерный, 3, Краснодар, 350921, Российская Федерация
Резюме. Надёжная технология получения удвоенных гаплоидных линий капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) для последующего использования их в качестве родительских форм имеет большое значение, так как позволяет значительно ускорить процесс создания коммерческих гибридов F1. Цель исследования - разработка лабораторной методики контроля гаметного (из микроспор) происхождения регенерантов капусты белокочанной, получаемых в условиях культуры пыльников in vitro, на основе молекулярно-генетического подхода. Основной принцип усовершенствования, применяемый впервые, - сравнительное генотипирование донорных генотипов (источника эксплантов) и полученных из эксплантов растений-регенерантов молекулярными (микросателлитными) ко-доминантными маркерами. Получены регенеранты капусты белокочанной от различных донорных генотипов в культуре пыльников in vitro; установлены микросателлитные профили донорных генотипов по пяти SSR-маркерам, в результате чего экспериментальным путем подобран SSR-маркер Bol AB 20 TR, проявивший кодоминантный характер наследования у исследованных генотипов, применительно к последним оптимизированы условия ПЦР с выбранным маркером; получены микросателлитные профили растений-регенерантов, выращенных в условиях in vitro из пыльников донорных генотипов в SSR-локусе Bol AB 20 TR; проведена сравнительная проверка аллельного состояния микросателлитного локуса Bol AB 20 TR удонорныхрастений и растений-регенерантов, на основе чего сделан вывод о гаметном происхождении последних. Cхема призвана обеспечить генетическую чистоту и морфологическую выровненность создаваемых отечественными селекционерами гибридов F1 капусты белокочанной. После полевой апробации она буде1т востребована в практических селекционных программах, проводимых, в частности, ФГБНУ «BНИИ риса».
Ключевые слова: капуста белокочанная, культура пыльников in vitro, гаметное происхождение регенерантов, геноти-пирование SSR-маркерами.
Для цитирования: Оптимизация технологической схемы получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в условиях культуры пыльников in vitro путем контроля гаметного происхождения растений-регенерантов ПЦР-анализом/C.B. Гаркуша, Н.B. Епифанович, Ж.М. Мухина, Е.Г. Cавенко, B.A. Глазырина, Л.А. Шундрина//Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. №. S. C. 33-35.
Повышение выровненности отечественных гибридов капусты белокочанной значительно поднимет их статус и конкурентоспособность на рынке семян. Этого можно быстро и эффективно достичь, используя в качестве родительских линий гибридов F1 удвоенные
гаплоиды. В этой связи гарантированное конвейерное получение удвоенных гаплоидов обеспечивает колоссальные технологические преимущества, позволяя значительно (как минимум в два-три раза) ускорить процесс создания коммерческих гибридов F1 капусты белокочанной [1].
Цель исследований - оптимизация методической схемы контроля гаметного (из микроспор) происхождения регенерантов капусты белокочанной, получаемых в условиях культуры пыльников in vitro, на основе молекулярно-генетического подхода.
Основная идея исследования состоит в использовании для этого молекулярных маркеров. Микросателлитные (SSR) маркеры подходят для такой цели идеально. Они стабильны в соматических клетках, их наследование носит кодоминантный характер, что позволяет отличать гомозиготное состояние от гетерозиготного. Распределение по всему геному облегчает использование этих маркеров для молекулярного картирования, простота манипуляций и значительная аллельная изменчивость обеспечивают их высокую информативность [2, 3, 4].
Следовательно, при правильном подборе SSR-маркеры позволяют выявить аллельное состояние изучаемых локусов ДНК у донорных генотипов, которые служат источником эксплантов (как правило, это гибриды F1 или расщепляющиеся популяции, полученные из них), и у получаемых регенерантов. У последних, если они представляют собой дига-плоиды (или гаплоиды), изучаемые локусы ДНК могут быть только в гомозиготном состоянии. Если же регенеранты - соматические диплоиды (возникли из спорофитной диплоидной ткани пыльника), у них возможно гетерозиготное состояние исследуемых локусов. Причем, при их соматическом происхождении микросателлитные профили всегда будут идентичны таковым у донорных растений, чего не будет в случае гаметного происхождения регенерантов.
Условия, материалы и методы. Для сравнительного генотипирования микросателлитных локусов ДНК в качестве доноров пыльников использовали растения гибридных комбинаций F1 и F3 капусты белокочанной (№№ 26, 28, 32, 47, 57, 59, 62, 74, 76, 77, 86, 111, 113, 114, 115, 115/1, 115/2, 125, 125/1, 125/2, 129), а также полученные из их пыльников растения-регенеранты.
ДНК выделяли методом СТАВ [5], а также по протоколу, предложенному Corrald B.C. с коллегами [6]. Проведено сравнительное генотипирование SSR-локусов ДНК донорных растений и полученных из их пыльников регенерантов. Для ПЦР-анализа использовали SSR-маркеры: B.n. 38 A, B.n. 40 Cl, CC 969507, B.n. 19 A, Bol AB 20 TR, выбранные из базы данных генетических ресурсов NSBI и доступные на сайте www.ncbi.nih.gov.
Условия ПЦР оптимизировали экспериментальным путём применительно к исследуемым генотипам капусты белокочанной (см. табл.). ДНК-амплификацию микросателлитных последовательностей проводили в конечном объеме 25 мкл. Использовали следующий состав реакционной смеси: 0,1 мМ каждого дезокси-рибонуклеозидфосфата (dNTPs); 0,23мкМ каждого праймера; ПЦР-буфер (20 мМ Трис-HCl, pH 8,4, 50 мМ KCl); 1 единица Taq-полимеразы, 3 мкл выделенной ДНК.
Таблица. Оптимизация параметров ПЦР для генотипирования изученных образцов капусты белокочанной
Шаг реакции Температура, °С Продолжительность Число циклов
Шачальная денатурация 95 15 мин 1
II. Денатурация 94 2 мин 1
III. Денатурация 94 1 мин 1
Отжиг праймеров 65 30 с 1
Синтез 72 45 с 1
Затем каждый второй цикл температуру отжига сни-
жали на 1 °С до достижения температуры 55°С
IV. Денатурация 94 1 мин 20
Отжиг праймеров 55 30 с 20
Синтез 72 45 с 20
Завершающий синтез 72 1 мин 1
Для визуализации продуктов ПЦР использовали электрофорез в 2%-ном агарозном геле при напряжении 150 В в течение 30-50 мин, в зависимости от длин амплифицированных фрагментов ПЦР [7].
Результаты и обсуждение. При культивировании пыльников в условиях in vitro редко удается полностью исключить возможность возникновения диплоидных эмбрионов из соматических тканей. В этой связи роль технологии гарантированного получения регенеран-тов гаметного (из микроспор) происхождения для последующего использования в качестве родительских форм для гибридных комбинаций особенно велика, так как позволяет в разы ускорить процесс создания коммерческих гибридов капусты белокочанной.
Исследование аллельного полиморфизма у 30 донорных генотипов капусты белокочанной показало, что образцы №№ 4, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30 гетерозиготны в локусе Bol AB 20 TR (рис. 1). Следовательно, полученные из их пыльников регенеранты гаметного (из микроспор) происхождения будут демонстрировать в этом локусе только состояние гомозиготности. Гетерозиготные регенеранты можно подвергать браковке как имеющие спорофитное происхождение (из ткани пыльника).
Остальные доноры (№№ 1, 2, 3, 5, 6-13, 19, 2129) оказались гомозиготами в указанном локусе. Следовательно, использованный SSR-маркер для
Рис. 2. Аллельная миграция в микросателлитном локусе Bol АВ 20 TR регенерантов капусты белокочанной, полученных от различных гибридных комбинаций: 1-6 - от F1 №111; 7-9 - от
них не применим, поскольку только гетерозиготное состояние исследуемоголокуса ДНК донорных генотипов информативно для дальнейших прогнозов по гаметному происхождению получаемых растений-регенерантов.
Изучение микросателлитного профиля того же локуса (Bol AB 20 TR) у 20 регенерантов капусты белокочанной, полученных от донорных генотипов (рис. 2), показало, что растения № 1-9 - негаметного происхождения, так как они гетерозиготны, как и их донорные формы (№№ 14-18, см. рис. 1). Растения №№ 10-20 в изучаемом локусе гомозиготны, хотя донорные формы в нём гетерозиготны (№№ 4, 20, 30, см. рис. 1). Поэтому с большой долей вероятности можно утверждать, что указанные регенеранты получены из микроспор.
Инновационность предлагаемого методического подхода заключается в том, что качество (гаметное происхождение) получаемых из пыльников растений-регенерантов проверяют с использованием высокоинформативной локус-специфичной кодоминантной системы молекулярного маркирования микросателлитных локусов ДНК. Такой контроль чрезвычайно важен для селекционеров, которые заинтересованы в получении генетически стабильных гомозиготных линий для скорейшего создания на их основе гете-розисных гибридов.
Кроме того, технология удвоенных гаплоидов увеличивает эффективность селекционного процесса, так как отбор проводят в гомозиготных линиях, следовательно, фенотип полученных линий соответствует генотипу растений-регенерантов, а также обеспечивает массовое получение генетически стабильных линий и облегчает поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами.
В России метод получения удвоенных гаплоидов овощных капустных культур посредством культуры пыльников и изолированных микроспор in vitro успешно применяют во ВНИИССОК и РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Конечный выход эмбриоидов зависит от следующих основных его элементов: генотип растения, питательная среда, стадия развития микроспор, условия теплового шока или другой стимуляции, условия культивирования на питательной среде [8].
Рис. 1. Аллельное состояние микросателлитного локуса Bol AB 20 TR у растений разных гибридных комбинаций: 1, 2 - F3 № 23; 3 - F3 № 26; 4 - F1 № 114; 5 - F3 № 26; 6-12 - F3 № 28; 13 - F3 № 32; 14-16 - F1 № 111; 17, 18 - F1 № 113; 19 - F3 № 47; 20 - F1 № 114; 21, 22 - F3 № 76; 23 - F3 № 77; 24-29 - F3 № 57; 30 - F1 № 115.
F. №113; 10-15 - от F. №114; 16-20 - от F. №115
Альтернативный, широко используемый за рубежом, способ гарантированного и высокоэффективного получения регенерантов заведомо гаметного происхождения - культура изолированных микроспор in vitro [9]. Это технологически более сложный, трудоемкий метод, по сравнению с культурой пыльников, требующий соответствующего современного инструментария, дорогостоящих реактивов и тщательной подготовки (условий выращивания) маточных растений. Не во всех региональных селекционных учреждениях такая экспериментальная база имеется в наличии.
В России использование метода изолированных микроспор в лаборатории ООО «Селекционная станция имени Н.Н. Тимофеева» (РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева) позволило создать генетическую коллекцию линий капусты белокочанной и пекинской, обладающих уникальными комбинациями признаков и свойств.
Предлагаемая в нашем исследовании технологическая схема недорога и легко реализуема в условиях биотехнологической лаборатории, оборудованной для проведения ПЦР-анализа и экспериментальной гапло-идии. Подобные лаборатории, как правило, имеются в большинстве региональных селекционных учреждений. Поэтому такая методика может стать рутинной для массового контроля гаметного происхождения
регенерантов капусты белокочанной (а также других сельскохозяйственных культур), получаемых в культуре пыльников in vitro. Например, на её основе намерены проводить селекцию и семеноводство гибридов капусты белокочанной в ФГБНУ «ВНИИ риса».
Выводы. Экспериментальным путём был подобран SSR-маркер Bol 20 TR, информативный для выполнения основной задачи исследования - сравнительной проверки аллельного состояния изучаемых микросателлитных локусов ДНК у растений-доноров и полученных из их пыльников регенерантов капусты белокочанной, что позволило сделать выводы о происхождении последних.
Проведенный эксперимент - основа для разработки методической схемы эффективного и недорогого лабораторного контроля гаметного происхождения растений-регенерантов, получаемых в культуре пыльников капусты белокочанной in vitro, что чрезвычайно важно для селекционеров.
Для целей массового анализа конвейерно получаемых регенерантов информативной и достаточной будет проверка каждой донорной формы лишь по одному маркеру, если он находится у донорного растения в состоянии гетерозиготности, так как удвоенный гаплоид или гаплоид всегда будет гомозиготным в любом исследуемом локусе.
Литература.
1. Королева С.В. Особенности селекции белокочанной капусты для юга РФ в свете современных требований // Овощи России, ВНИИССОК, 2014. №4. С.52-56
2. Microsatellite diversity within Oryza sativa with emphasis on indica/japonica divergence/L.Z. Gao, C.H. Zhang, L.P. Chang, et al. // Genet. Res. 2005. V. 85. Pp. 1-14.
3. Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding/S.R. McCouch, X. Chen, O. Panaud, S. Temnykh, Y. Xu, et al.// Plant Mol. Biol. 1997. No 35. Pp. 89-99.
4. Sasaki T. The progress in rice genomics // Euphytica. 2001. V. 118. Pp. 103-111.
5. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Res. 1980. No 8 (19). Pp. 4321-4325.
6. Evaluation of "quick and dirty" DNA extraction methods for marker-assisted selection in rice (Oryza sativa L.) / B.C. Corrald, A. Das, P.S. Virk, D.J. Mackill // Plant Breeding. 2007. No 126. Pp. 47-50.
7. Артемьева А.М., Чесноков Ю.В., Клоке Э. Генетическое разнообразие и внутривидовые филогенетические взаимоотношения культур вида Brassica rapa L. по результатам анализа микросателлитов // Информ. вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. № 4. С. 608-619.
8. Шмыкова Н.А., Шумилина Д.В., Супрунова Т.П. Получение удвоенных гаплоидов у видов рода Brassica L. // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2015. Т. 19. № 1. C. 111-120
9. Шумилина Д.В., Шмыкова Н.А. Методы получения гаплоидных и дигаплоидных растений перца в культуре пыльников и микроспор // Сельскохозяйственная биология. 2011. № 5. C. 57.
OPTIMIZATION OF TECHNOLOGICAL SCHEME OF OBTAINMENT OF CULTIVATED CABBAGE (BRASSICA OLERACEA L.) DOUBLED HAPLOIDS UNDER CONDITIONS OF IN VITRO ANTHER CULTURE BY THE CONTROL OF GAMETE ORIGIN OF REGENERATED PLANTS BY PCR-ANALYSIS
S.V. Garkusha, N.V. Epifanovitch, Zh.M. Mukhina, E.G. Savenko, V.A. Glazyrina, L.A. Shundrina
All-Russian Rice Research Institute, p. Belozernyi, 3, Krasnodar, 350921, Russian Federation
Summary. The technology of guaranteed obtainment of doubled haploid lines of cultivated cabbage (Brassica oleracea L.) for their further use as parental forms is of great importance, as it allows accelerating several times the process of developing commercial F1 hybrids. The main purpose of this research was the development of laboratory testing methods for the control of gamete (from microspores) origin of cabbage regenerants, obtained in vitro culture, on the basis of molecular-genetic approach. The main principle of improvement, used for the first time, was a comparative genotyping of donor forms (source of explants) and regenerants, derived from explants, by molecular (microsatellite) co-dominant markers. It was obtained the regenerants of cultivated cabbage from various donor genotypes in anther culture in vitro and microsatellite profiles of donor genotypes by five SSR-markers. As a result, the Bol AB 20 TR SSR-marker was experimentally selected, which has co-dominant nature of inheritance in studied genotypes. PCR conditions with the selected marker were optimized for studied genotypes. Microsatellite profiles of regenerant plants, grown in vitro conditions from anthers of donor genotypes, in SSR-locus Bol AB 20 Tr were obtained. The comparative characteristic of the allelic state of the microsatellite locus Bol AB 20 TR in donor and regenerant plants was carried out, and the conclusion about their gamete origin was made. The scheme is designed to ensure genetic purity and morphological evenness of F1 hybrids of cultivated cabbage developed by domestic breeders. After field testing, it will be in demand in practical breeding programs carried out, in particular, in the All-Russian Research Institute of Rice Breeding.
Keywords: cultivated cabbage, anther culture in vitro, gamete origin of regenerants, SSR-genotyping.
Author Details: S.V. Garkusha, D. Sc. (Agr.), director (e-mail: agroplazma@gmail.com); N.V. Epifanovitch, post-graduate student; Zh.M. Mukhina, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; E.G. Savenko, senior research fellow; V.A. Glazyrina, senior research fellow; L.A. Shundrina, senior research fellow.
For citation: Optimization of Technological Scheme of Obtainment of Cultivated Cabbage (Brassica oleracea L.) Doubled Haploids under Conditions of in Vitro Anther Culture by the Control of Gamete Origin of Regenerated Plants by PCR-Analysis / S.V. Garkusha, N.V. Epifanovitch, Zh.M. Mukhina, E.G. Savenko, V.A. Glazyrina, L.A. Shundrina. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2016. V. 30. No 9. Pp. 33-35 (in Russ.).
