CC BY
140
© РУЖИЛО О.С., ДИВАКОВА Т.С., 2013
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ, АКТИВИРУЮЩИХ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ПЕРОКСИСОМ PPARa И PPARGC1A, НА РАЗВИТИЕ СИНДРОМА ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ
РУЖИЛО О.С.*, ДИВАКОВА Т.С.**
УО «Полесский государственный университет»*
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»**
Резюме. Цель исследования - изучение вклада полиморфизма генов, кодирующих РРЛЯа и РРЛЯОС1Л, в развитие синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) у женщин репродуктивного возраста в белорусской популяции.
Нами проведено исследование методом случай-контроль 120 женщин. Основная группа включала 60 пациенток с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ), группа сравнения состояла из 60 здоровых женщин. Молекулярно-генетическое исследование проводилось методом ПЦР и ПДРФ анализа.
Аллели со сниженной функциональной активностью генов РРЛЯа (гб4253778) и РРЛЯОС1Л (^8192678) встречаются чаще у пациенток с СПКЯ (РРЛЯа: %2=12,87, ОЯ 2,87 (95% С1 1,60-5,52), р<0,001; РРЛЯОС1Л: х2=19,1, ОЯ 3,78 (95% С1 2,05-6,94), р<0,001). Носительство аллеля С гена РРЛЯа и аллеля А гена РРЛЯОС1Л рассматриваются как ассоциированные с СПКЯ.
Ключевые слова: синдром поликистозных яичников, гены PPARа, PPARGC1A, генетический полимор-
Abstract. The objective of the present investigation was to study the contribution of polymorphism of the genes coding PPARa and PPARGC1A to the development of polycystic ovary syndrome (PCOS) in women of the reproductive age living in Belarus.
We investigated 120 women using the case-control study method. The main group included 60 women with polycystic ovary syndrome (PCOS), and the control group included 60 healthy women. Molecular-genetic research was conducted using PCR-RFLP analysis. PCOS patients more frequently than controls were carriers of alleles with reduced functional genes activity (PPARa (rs4253778): %2=12,87, OR 2,87 (95% CI 1,60-5,52), p<0,001; PPARGC1A (rs8192678): x2=19,1, OR 3,78 (95% CI 2,05-6,94), p<0,001).
Carriage of allele C of the gene PPARa and that of allele A of the gene PPARGC1A are considered as associated with PCOS.
Key words: polycystic ovary syndrome, genes PPARa and PPARGC1A, genetic polymorphism.
Более 70 лет продолжаются дискуссии по вопросам этиологии и патогенеза синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) у женщин. Несмотря на большое число предложенных теорий развития
Адрес для корреспонденции: 225710, г. Пинск, ул.Центральная, д.80, кв. 70. Тел.моб.: +375 (29) 16984-85, e-mail: ruzhylo@tut.by - Ружило Ольга Сергеевна.
СПКЯ, патогенез заболевания до конца не изучен. В настоящее время известно, что СПКЯ имеет семейный характер, носящий мультифакториальный тип наследования [1]. Основной перечень работ, посвященных изучению генетической этиологии СПКЯ, базируется на исследовании полиморфных вариантов возможных генов-кандидатов заболевания. Однако генетические механизмы, лежащие в осно-
ве СПКЯ, несмотря на многолетние исследования, до сих пор остаются неясными [2, 3]. В настоящее время основным подходом в изучении генетической предрасположенности к определенной патологии является методика исследования полиморфизмов генов-кандидатов. Сущность подхода заключается в проверке гипотезы, связано ли наличие полиморфного варианта гена с развитием заболевания. Поиски в геноме человека полиморфизма отдельных генов или локусов, которые были бы характерны для всех пациентов с СПКЯ, пока не дали ощутимых результатов. Положительные находки касались гена FTO (ген, ассоциированный с жировой массой, rs9939609). Учитывая важную роль ожирения в этиологии СПКЯ и сахарного диабета 2 типа Barber et al. (2008) установили, что аллель А гена FTO связана с развитием СПКЯ.
Рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом (PPARs) — группа ядерных рецепторов, функционирующих в качестве фактора транскрипции. PPARs играют существенную роль в регуляции клеточной дифференцировки, метаболизме глюкозы и липидов. PPARs оказывают и другие эффекты - противовоспалительный, действие на яичники и плаценту, что может служить связующим звеном между обменом углеводов и липидов, воспалительным ответом и репродуктивной функцией. К эндогенным лигандам PPARs относятся свободные жирные кислоты и метаболиты арахидоновой кислоты, к экзогенными - такие лекарственные средства как тиазолидиндионы и фибраты [5, 6].
Ген PPARa кодирует белок, имеющий свойство специфически связываться с PPAR-чувствительными элементами промоторов генов жирового и углеводного метаболизма и регулировать их транскрипцию. Среди изученных полиморфизмов PPARA можно выделить G/C полиморфизм 7-го интрона (rs 4253778). Замена нуклеотида G на C в положении 2528 гена ассоциируется со снижением экспрессии гена, что приводит к нарушению регуляции липидного и углеводного обменов: G/G - нормальный вариант по-
лиморфизма в гомозиготной форме; G/C
- гетерозиготная форма полиморфизма; C/C - мутантный вариант полиморфизма в гомозиготной форме.
PPARGC1A (коактиватор 1a PPARy) в результате воздействия на транскрипционные факторы опосредованно выполняет следующие функции: повышение секреции инсулина и катаболическое воздействие на жировую массу; активацию процессов адаптивного термогенеза; стимуляцию образования митохондрий и усиление окислительных процессов; регуляцию глюконе-огенеза и транспорта глюкозы; регуляцию липогенеза и др. Особый интерес среди всех обнаруженных вариаций в продукте гена PPARGC1A представляет аминокислотная замена Gly482Ser. Ее причиной является замена нуклеотида G на A в положении 1444 8-го экзона: G/G - нормальный вариант полиморфизма в гомозиготной форме; G/A - гетерозиготная форма полиморфизма; A/A - мутантный вариант полиморфизма в гомозиготной форме. 482Ser-аллель ассоциируется со снижением уровня экспресии гена PPARGC1A и с уменьшением интенсивности окислительных процессов и митохондриального биосинтеза в клетках [7]. Для 482Ser-аллели показана связь с инсулинорезистентно-стью и сахарным диабетом типа 2 [8].
Цель настоящего исследования заключается в изучении вклада полиморфных вариантов генов, кодирующих PPARa и PPARGC1A в развитие СПКЯ у женщин репродуктивного возраста в белорусской популяции.
Методы
Обследование проводилось после получения письменного информированного согласия, одобренного комиссией по биоэтике Полесского государственного университета. Основную группу составили 60 пациенток с СПКЯ, наблюдавшихся в кабинете по лечению бесплодия, невынашивания и эндокринной патологии в акушерско-гинекологическом отделении № 1 филиала «Женская консультация» г. Пин-
ска. Группа сравнения состояла из 60 здоровых женщин репродуктивного возраста. В группе сравнения не было выявлено нарушений менструальной функции, гипе-рандрогении и ожирения. Диагноз СПКЯ устанавливали на основании клинического обследования и инструментальных методов диагностики в соответствии с критериями «Роттердамского консенсуса по СПКЯ» (2003 г.) Европейского Общества Репродукции Человека и Эмбриологии и Американского Общества Репродуктивной Медицины после исключения другой эндокринной патологии. Для определения индекс массы тела (ИМТ) использовали стандартную формулу: ИМТ = вес, кг / рост2, см. Гирсутизм определяли как избыточный рост волос в андрогензависимых зонах по шкале Ферримана-Голлвея.
Всем женщинам были проведены молекулярно-генетические исследования по стандартным методикам с использованием высокочувствительных методов: ПЦР (полимеразная цепная реакция), ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) в Научно-исследовательской лаборатории лонгитудинальных исследований УО «Полесский государственный университете». ДНК выделяли из буккаль-ного эпителия. Для определения полиморфизма G2528C (rs4253778) гена PPARa проводили ПЦР со следующей парой праймеров (температура отжига - 60°С): прямой праймер:
5'-ACAAT CACTCCTT AAAT AT GGT GG-3';
обратный праймер: 5'-AAGTAGGGACAGACAGGACCAGTA-3'.
ПЦР проводили на автоматических термоциклерах Biometra (Biometra, Germany). Продуктами амплификации в этой ПЦР являются фрагменты ДНК длиной 266 пар оснований (п.о.). Наличие замены нуклеотида G/C в 2528 положении 7-го интрона гена PPARa создаёт сайт распознавания для эндонуклеазы TaqI. Для детекции этого полиморфизма проводили обработку продукта ПЦР рестрикта-зой TaqI при 65°С в течение одного часа. Анализ длины амплифицированных фрагментов и продуктов их рестрикции прово-
дили электрофоретическим разделением в агарозном геле и гель-документированием в проходящем ультрафиолетовом свете, с применением цифровой компьютерной видеосъемки на приборе GDS-8000 («UVP», США). Генотипу GG соответствуют не-рестрицированные фрагменты длиной 266 п.о., генотипу GС - три фрагмента длиной 266, 215 и 51 п.о., а генотипу СС - 2 фрагмента длиной 215 и 51 п.о. (рис. 1).
Для определения полиморфизма G1444A гена PPARGC1A (rs8192678) проводили ПЦР со следующей парой праймеров (температура отжига - 58°С): прямой праймер: 5'-TGCTACCTGAGAGAGACTTTG-3' обратный праймер: 5'-CTTTCATCTTCGCTGTCATC-3'
Продуктами амплификации в этой ПЦР являются фрагменты ДНК длиной 260 п.о.
Наличие замены нуклеотида G/A в 1444-м положении 8-го экзона гена PPARGC1A создаёт для эндонуклеазы MspI сайт рестрикции. Для детекции этого полиморфизма проводили обработку продукта ПЦР рестриктазой MspI при 37°С в течение одного часа с последующим электрофорезом продуктов рестрикции. Генотипу AA (Ser/Ser) соответствуют не-рестрицированные фрагменты длиной 260 п.о., генотипу AG (Ser/Gly) - три фрагмента длиной 260, 148 и 112 п.о., а генотипу GG (Gly/Gly) - 2 фрагмента длиной 148 и 112 п.о. (рис. 2).
Для статистической обработки полученных данных применяли программное обеспечение STATISTICA 8.0 («StatSoft Inc.», США). Значимость различий в частоте аллелей между сравниваемыми выборками определяли с использованием критерия хи-квадрат или точного теста Фишера. Различия считались значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Обследование 60 пациенток с СПКЯ показало, что все они не зависимо от массы тела имели нарушения менструального цикла, которые дебютировали с менар-
12 3 4
Рис. 1. Электрофореграмма результатов ПЦР-ПДРФ анализа полиморфизма О2528С гена РРЛЯа.
Дорожки: 1 - ДНК-маркер молекулярных масс (шаг 50 п.о., СагіЯоШ); 2 - продукт амплификации и рестрикции ДНК индивидуума с генотипом ОС; 3 - продукт амплификации и рестрикции ДНК индивидуума с генотипом ОС; 4 - продукт амплификации и рестрикции ДНК индивидуума с генотипом СС.
хе у 80% пациенток. Вторичная аменорея отмечена в анамнезе у 11,7% пациенток с СПКЯ.
У большинства пациенток с СПКЯ отмечался гирсутизм: у 20% гирсутное число более 12 баллов, 40% женщин имели пограничное оволосение - гирсутное число 7-12 баллов. Избыток массы тела и ожирение отмечено у 26 пациенток (43,3%). Для пациенток с СПКЯ характерно избыточное отложение жира в области живота и развитие абдоминального типа ожирения. Клиническая характеристика исследуемой группы приведена в таблице 1.
Анализ распределения частот аллелей РРЛЯа и РРЛЯОС1Л у пациенток с СПКЯ и здоровых женщин методом построения таблиц сопряженности выявил достоверные различия в частотах аллелей (для РРЛЯа: Х2= 12,87, ОЯ 2,87 (95% СІ 1,60-5,52), р<0,001; для РРЛЯОС1Л: х2=19,1, ОЯ 3,78 (95% СІ
Рис. 2. Электрофореграмма результатов ПЦР-ПДРФ анализа полиморфизма О1444Л гена РРЛЯОС1Л.
Дорожки: 1 - ДНК-маркер молекулярных масс (шаг 50 п.о., Саг1ЯоШ); 2 - продукт амплификации и рестрикции ДНК индивидуума с генотипом ЛЛ; 3 - продукт амплификации и рестрикции ДНК индивидуума с генотипом ЛО; 4 - продукт амплификации и рестрикции ДНК индивидуума с генотипом ОО.
2,05-6,94), р<0,001. Аллель С РРЛЯа у пациенток с СПКЯ встречается в 2,2 раза чаще, чем у здоровых. Аллель А РРЛЯОС1Л в группе пациенток с СПКЯ встречается в 1,8 раза чаще, чем в группе сравнения. Эти данные сходны с полученными нами ранее на небольшой выборке и подтверждают вывод о том, что генотипы со сниженной функциональной активностью встречались чаще у пациенток с СПКЯ [9].
В исследованиях, где применяется молекулярно-генетический метод, принято обнаруженные частоты распределения полиморфных аллелей сравнивать с т.н. популяционными частотами, то есть с имеющимися в данном географическом регионе у конкретной этнической группы. К сожалению, такой информации по Республике Беларусь в международных базах данных нет, поэтому мы использовали данные о частоте генотипов РРЛЯа в русской попу-
Таблица 1
Клиническая характеристика пациенток с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ)
Показатель Пациентки с СПКЯ (n=60) %
Олигоменорея 49 81,7
Вторичная аменорея 7 11,7
Поликистозные яичники при ультразвуковом исследовании 53 88,3
Признаки гиперандрогении - Гирсутное число >12 - Акне - Жирная себорея 12 16 31 0 ,8 ,7 20 6 1 225
Бесплодие 50 83,3
Избыток массы тела (ИМТ>25 кг/м2) 17 28,3
Ожирение (ИМТ>30 кг/м2) 9 15
Окружность талии >80 см 26 43,3
Таблица 2
Распределение частот генотипов PPARa у пациенток с СПКЯ, здоровых женщин
и в русской популяции
Аллели и СПКЯ Группа сравнения Русская популяция
генотипы n=60 % n=60 % (Ahmetov Ildus I. et al., 2006), %
Генотипы
GG 2 3,3 33 55 70
GC 53 88,3 26 43,3 27,3
CC 5 8,3 1 1,7 2,7
Аллели
G 57 47,5 92 76,7 83,6
C 63 52,5 28 23,3 16,4
Таблица 3
Распределение частот генотипов PPARGC1A у пациенток с СПКЯ и в группе здоровых женщин
Аллели и генотипы СПКЯ Группа сравнения
n=60 % 0 6 = n %
Генотипы
GG 2 3,3 28 46,7
GA 51 85 29 48,3
AA 7 11,7 3 5
Частота аллели
G 55 45,8 85 70,8
A 65 54,2 35 29,2
ляции (размер выборки 1242 человека) [10]. При сравнении частот генотипов у здоровых индивидуумов в русской популяции и в группе сравнения статистически значимых различий не выявлено (х2=1,56, р=0,2842). База данных ALFRED Йельского универ-
ситета (США) содержит информацию о частотах аллелей гена РРАЯОС1А в эстонской популяции (А - 0,251; О - 0,749, размер выборки 1884 человека), русской популяции (А - 0,300; О - 0,700, размер выборки 50 человек), французской популяции (А
- 0,400; G - 0,600, размер выборки 58 человек), итальянской популяции (A - 0,350; G
- 0,650, размер выборки 26 человек), адыгейской популяции (A - 0,380; G - 0,620, размер выборки 34 человека) [11]. Несмотря на небольшие размеры сравниваемых выборок, частоты аллелей PPARGC1A в нашем исследовании в группе сравнения не имеют статистически значимых различий с частотами аллелей этого гена в других европейских популяциях (p>0,05).
Заключение
Носительство аллеля C гена PPARa и аллеля А гена PPARGC1A рассматриваются нами как ассоциированные с СПКЯ. Можно предположить, что именно дефекты регуляторных генов, таких как PPARs, являются причиной каскада метаболических и гормональных нарушений при СПКЯ. Кроме того, лечение препаратами, нормализующими углеводный и липидный обмен (бигуаниды и тиазолидиндионы), мероприятия по нормализации веса и правильное питание ведут к нормализации эндокринного статуса и восстановлению овуляции у женщин с СПКЯ.
Практические перспективы использования полученных результатов исследования заключаются в возможности прогнозировать развитие СПКЯ у девушек-подростков с учетом генотипа, семейного анамнеза и образа жизни, а также проводить дифференцированную терапию и корректировать питание, физическую активность, совмещая традиционные подходы и использование генетических детерминант.
Литература
1. Azziz, R. Polycystic Ovary Syndrome Is a Family Affair / Azziz R. // J Clin Endocrinol Metab. -2008. - N 5. - P. 1579-1581.
2. The Molecular-Genetic Basis of Functional Hyperandrogenism and the Polycystic Ovary Syndrome / H. F. Escobar-Morreale [et al.] // Endocrine Reviews. - 2005. - N 2. - P. 251-282.
3. Genetic polymorphisms of FSHR, CYP17, CYP1A1, CAPN10, INSR, SERPINE1 genes in adolescent girls with polycystic ovary syndrome / T. Unsal [et al.] // J Assist Reprod Genet. - 2009. -Vol. 26. - P. 205-216.
4. Association of variants in the fat mass and obesity associated (FTO) gene with polycystic ovary syndrome / T. M. Barber [et al.] // Diabetologia. -2008. - Vol. 51.- P. 1153-1158.
5. Nuclear Receptors of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR) Family in Gestetional Diabetes: From Animal Models to Clinical Trials / P. Arck [et al.] // Biology of Reproduction. - 2010.
- Vol. 83 - P. 168-176.
6. Yeeoufou, A. Multifaced roles of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) at cellular and whole organism levels / A. Yeeoufou, W. Wahli // Swiss Med Wkly. - 2010. - Vol. 140.
- P.13071.
7. An exonic peroxisome proliferator-activated receptor-г coactivator-16 variation may mediate the resting energy expenditure through a potential regulatory role on important gene expression in this pathway / K. Mirzaei [et al.] // J Nutrigenet Nutrigenomics. - 2012. - Vol. 5, N 2. - P. 59-71.
8. Evidence for interaction between PPARG Pro12Ala and PPARGC1A Gly482Ser polymorphisms in determining type 2 diabetes intermediate phenotypes in overweight subjects / S.M. Ruchat [et al.] // Exp Clin Endocrinol Diabetes. - 2009 Oct. - Vol. 117, N 9. - P. 455-459.
9. Ружило, О.С. Роль полиморфизма генов PPARa и PPARGC1A в развитии синдрома поликистозных яичников у женщин репродуктивного возраста в белорусской популяции. / О. С. Ружило, Т.С. Дивакова // Репродуктив. здоровье. Восточная Европа.- 2012. - № 5 (23).
- С. 189-192.
10. PPARa gene variation and physical performance in Russian athletes / I. A. Ildus [et al.] // Eur J Appl Physiol. - 2006. - Vol. 97 - P. 103-108.
11. База данных ALFRED (The ALlele FREquency Database) // Йельский университет [Электронный ресурс]. - Режим доступа : http://alfred.med. yale.edu. - Дата доступа : 18.02.2012.
Поступила 04.03.2013 г. Принята в печать 05.09.2013 г.
Сведения об авторах:
Ружило О.С. - старший преподаватель кафедры общей и клинической медицины УО «ПГУ»; Дивакова Т.С. - д.м.н., профессор, зав. кафедрой акушерства и гинекологии ФПК и ПК УО «ВГМУ».
