CC BY
33
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
несущих антигенные детерминанты для регРФ, восстановлены, обнаруживается 4 свободные сульфгидрильные группы/молекулу. Fc-фрагменты IgG человека, не имеющие детерминант для регРФ, содержат шарнир, однако тиольные группы в нем образуют дисульфидные связи. Алкилирование свободных сульфгидрильных групп Fc-фрагментов IgG ведет к потере свойства Fc-фрагментов IgG подавлять агглютинацию нагруженных IgG эритроцитов, вызванную регРФ. Данный факт не исключает, что SH группы шарнирной области непосредственно входят в состав антигенных детерминант, узнаваемых регРФ.
Заключение. Таким образом, формирование антигенных детерминант для регуляторного ревматоидного фактора на Fc-фрагментах IgG человека происходит в результате восстановления межцепочечных дисульфидных связей шарнира, сопровождающегося изменением кон-формации Fc-фрагментов IgG.
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ РАСТВОРИМОГО ЭНДОГЛИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ И ЕГО КОМПЛЕКСОВ
Смирнов И.В., Грязева И.В., Самойлович М.П., Шашкова О.А., Крутецкая И.Ю., Столбовая А.Ю., Крылова А.А.1, Берлина М.А., Пиневич А.А., Вартанян Н.Л., Климович В.Б.
Российский научный центр радиологии и хирургических технологий, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Эндоглин (CD105) представляет собой го-модимерный мембранный антиген клеток сосудистого эндотелия с молекулярным весом 90 кДа. Он является компонентом рецепторных комплексов TGF-ß, BMP и активина. Растворимая форма антигена образуется в результате протеолитического расщепления экстраклеточной части рецептора посредством MMP-14 и имеет молекулярный вес 80 кДа. Избыточное образование этого антигена может вызывать системную дисфункцию сосудистого эндотелия. Определение содержания этого эндо-глина в плазме крови используют для оценки вероятности развития преэклампсии у беременных женщин и прогнозирования течения ряда онкологических заболеваний.
При создании двухцентровых иммуноферментных систем, направленных на выявление растворимого эндогли-на, было обнаружено, что разные пары моноклональных антител выявляют различное (до двух порядков) содержание этого антигена в одних и тех же образцах плазмы крови человека. Эти результаты могут быть объяснены отсутствием или маскированием другими белками части эпитопов растворимого эндоглина.
Цель. Исследование аффинно выделенных из плазмы крови молекул растворимого эндоглина и копрецепити-рующих с ними белков.
Материалы и методы. Молекулы растворимого эндо-глина и копрецепитирующие с ними белки были выделены из пулового образца плазмы крови здоровых доноров посредством иммуноаффинной хроматографии. Их анализ вели с помощью методов электрофореза, иммунобло-та и двухцентрового ИФА. Также был применен подход последовательного сепарирования молекулярных комплексов на мембранах с уменьшающимися диаметрами пор. Моноклональные антитела к эндоглину человека, использованные в исследовании, были получены и охарактеризованы в лаборатории гибридомной технологии (Смирнов И.В., 2015).
Результаты. С помощью элеткрофореза в нативных условиях и иммуноблота показано, что молекулы растворимого эндоглина входят в состав надмолекулярных белковых комплексов с молекулярным весом более 200 кДа. Их размеры позволяют проходить через сепарирующие мембраны, имеющие пороги отсечения 1000 и 300 кДа. Комплексы эндоглина задерживаются мембраной с порогом отсечения 100 кДа.
Использование буферов с детергентными и хаотроп-ными агентами при подготовке проб для электрофоре-тического разделения приводит к частичной дезинтеграции молекулярных комплексов эндоглина и появлению фракции свободных димерных и мономерных молекул антигена (160 и 80 кДа). Тем не менее, существенная часть молекул эндоглина остается связанной с другими белками. Добавление восстанавливающего реагента приводит к полной диссоциации комплексов растворимого эндоглина и формированию трех фракций антигена (80 кДа, 70 кДа и 60 кДа).
Заключение. С помощью иммунохимических методов продемонстрирована молекулярная гетерогенность растворимого эндоглина плазмы крови и вхождение этого антигена в состав молекулярных комплексов.
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОГЛИКАН-РАСПОЗНАЮЩЕГО БЕЛКА TAG-7/PGLYRP-1 НА ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ВЫЖИВАНИЕ LISTERIA MONOCYTOGENES
Слонова Д.А.1, 2, Посвятенко А.В.2, 3, Сысолятина Е.В.4, Еромолаева С.А.4, Кибардин А.В.2, 3, Лысюк ЕЮ.2' 3, Гапонов А.М.2, Гнучев Н.В.3, Георгиев Г.П.3, Ларин С.С.1' 2 3
1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Москва, Россия
2 ФГБУ «Национальный научно-практический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии
им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
3 ФГБУН «Институт биологии гена» РАН, Москва, Россия
4 ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
В настоящее время в медицине описано несколько заболеваний, вызываемых внутриклеточными патогенами (туберкулез, менингококковая инфекция, бруцеллез и другие). Одним из таких заболеваний является листе-риоз. Его возбудитель Listeria monocytogenes — широко распространенная грамположительная бактерия, обладающая способностью к внутриклеточному паразитизму. Лечение листериоза чаще всего проводится антибиотиками, однако в последнее время стали применять и комплексную терапию, направленную на усиление внутренней защиты организма. Одним из компонентов системы врожденного иммунитет является пептидогликан распознающий белок Tag-7/PGLYRP-1.
Цель. Исследовать влияние белка Tag-7/PGLYRP-1 на свойства бактерий и их взаимодействие с компонентами врожденного иммунитета.
Материалы и методы. В работе использовали человеческий пептидогликан-распознающий рекомбинантный белок Tag-7/PGLYRP-1, полученный с помощью эука-риотической экспрессионной системы. Для оценки эф-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
фективности антибиотиков использовались диски антибиотиков (Oxoid Ltd., England). Исследование фагоцитоза меченых Cy3 (GE Healthcare, Sweden) L. monocytogenes (EGD серовар l/2a) проводилось на проточном цитометре (Cytomics FC 500 MPL, Beckman Coulter, Inc.). Анализировалось не менее 10000 событий. Эукариотические клетки кудьтивировались в питательной среде в СО2 инкубаторе при 37 °C. Количество IL-6 определялось с помощью ИФА (R&D Systems).
Результаты. Полученный рекомбинантный человеческий белок Tag-7/PGLYRP-l связывается с клеточными стенками бактерий, но не демонстрирует бактерицидной и бактериостатической активности при использованных концентрациях. Однако с помощью диско-диффузионного метода было выявлено, что в некоторых случаях присутствие Tag7/PGLYRP-1 может усиливать чувствительность бактерий к наличию антибактериальных препаратов.
С использованием макрофагоподобной клеточной линии ANA-1 продемонстрировано, что присутствие Tag-7/PGLYRP-l стимулирует фагоцитоз внутриклеточных патогенных бактерий L. monocytogenes. С помощью инфекционной in vitro модели показано, что присутствие Tag-7/PGLYRP-l ингибирует внутриклеточное выживание L. monocytogenes, предохраняя эукариотические клетки от заражения.
Белок Tag-7/PGLYRP-l способствует выработке клетками ANA-1 активных форм кислорода, а так же провос-палительного цитокина IL-6.
Заключение. Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что пептидогликан-распознаю-щий белок Tag-7/PGLYRP-l активирует защитные механизмы врожденного иммунитета, препятствует заражению эукариотических клеток L. monocytogenes.
Работа поддержана грантом РФФИ № l5-04-07649.
Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-9069.20l6.4.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФАКТОРА, ИНГИБИРУЮЩЕГО МИГРАЦИЮ МАКРОФАГОВ, И ЕГО РЕЦЕПТОРА CD74 УСИЛИВАЕТСЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНОМ С ЛАБИЛЬНО СВЯЗАННОЙ МЕДЬЮ
Соколов А.В., Костевич В.А., Горбунов Н.П., Грудинина Н.А., Васильев В.Б.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Введение. Ранее нами было установлено, что медьсодержащий белок острой фазы воспаления церулоплаз-мин (ЦП), благодаря наличию лабильно связанных ионов меди, образует белок-белковый комплекс с фактором, ингибирующим миграцию макрофагов (МИФ) — ключевым цитокином воспаления. Введение насыщенного медью ЦП усиливало провоспалительную активность МИФ при моделировании септического шока у мышей in vivo, приводя к l00% смертности мышей, а аффинные антитела против МИФ препятствовали этому. Поскольку для активации провоспалительной активности МИФ необходимо его взаимодействие с инвариантной цепью главного комплекса гистосовместимости (CD74), были основания высказать гипотезу, что ЦП с лабильно связанной медью может влиять на взаимодействие МИФ и CD74. Целью
работы явилось исследование взаимодействия МИФ, ЦП и CD74. В задачи входило получение высокоочищенных белков и характеристика их взаимодействия.
Материалы и методы. Взаимодействие ЦП, МИФ и sCD74 изучали с помощью аффинной хроматографии, гель-фильтрации, электрофореза в полиакриламидном геле без детергентов и метода поверхностного плазмон-ного резонанса. Был клонирован внеклеточный домен рецептора CD74 (sCD74), получена плазмида, кодирующая N-концевую полигистидиновую последовательностью, сайт для гидролиза тромбином перед аминокислотной последовательностью sCD74. Отработан протокол, позволивший выделить высокоочищенный sCD74 из телец включения E. coli с помощью металл-хелатной хроматографии, гидролиза тромбином и аффинной хроматографии на МИФ-агарозе.
Результаты. Соответствие аминокислотной последовательности электрофоретически гомогенного sCD74 было доказано с помощью масс-спектрометрии фрагментов трипсинолиза (найдено 90% предсказанной последовательности). С помощью оптических сенсоров с иммобилизованным МИФ (BiaCore X-100) мы показали, что на взаимодействие МИФ и sCD74 практически не влияли ионы меди: константы диссоциации 19,1(+/-1,2) и 17,7(+/-0,9) нМ. ЦП лишенный ионов лабильной меди не влиял на взаимодействие МИФ и sCD74, напротив, присутствие ионов лабильной меди в ЦП увеличило сродство МИФ и sCD74 в 1,5 раза: константа диссоциации 12,2(+/-0,7) нМ. Аналогичные результаты были получены с помощью метода аффинной хроматографии: ЦП с лабильно связанными ионами меди способствовал взаимодействию sCD74 с иммобилизованным на агарозе МИФ. При гель-фильтрации ЦП, МИФ и sCD74 элюи-ровались совместно в буфере, содержащем 5 мкМ сульфата меди.
Заключение. Таким образом, мы показали, что ЦП может усиливать взаимодействие МИФ с внеклеточным доменом CD74.
Исследование поддержано грантом РФФИ № 16-0401182.
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОРАКОВЫХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСА ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА С ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ
Соколов А.В., Власенко А.Ю., Костевич В.А., Старикова Э.А., Киселева Е.П., Васильев В.Б.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Введение. Белок грудного молока и секреторных гранул нейтрофилов, лактоферрин (ЛФ), обладает противораковой активностью, однако механизм его действия изучен не до конца. Недавно было показано, что ЛФ молока коров подобно альфа-лактальбумину образует комплекс с олеиновой кислотой, вызывающий апоптоз раковых клеток в культуре. Целью работы явилось исследование взаимодействия ЛФ человека с олеиновой кислотой и его противораковых свойств in vitro и in vivo. В задачи входило исследование липолитического эффекта ЛФ, изучение взаимодействия ЛФ и олеиновой кислоты, влияния комплекса на апоптоз культивируемых клеток, а также наблюдение за ростом гепатомы 22А после подкожной инокуляции мышам.
