CC BY
42
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
фективности антибиотиков использовались диски антибиотиков (Oxoid Ltd., England). Исследование фагоцитоза меченых Cy3 (GE Healthcare, Sweden) L. monocytogenes (EGD серовар l/2a) проводилось на проточном цитометре (Cytomics FC 500 MPL, Beckman Coulter, Inc.). Анализировалось не менее 10000 событий. Эукариотические клетки кудьтивировались в питательной среде в СО2 инкубаторе при 37 °C. Количество IL-6 определялось с помощью ИФА (R&D Systems).
Результаты. Полученный рекомбинантный человеческий белок Tag-7/PGLYRP-l связывается с клеточными стенками бактерий, но не демонстрирует бактерицидной и бактериостатической активности при использованных концентрациях. Однако с помощью диско-диффузионного метода было выявлено, что в некоторых случаях присутствие Tag7/PGLYRP-1 может усиливать чувствительность бактерий к наличию антибактериальных препаратов.
С использованием макрофагоподобной клеточной линии ANA-1 продемонстрировано, что присутствие Tag-7/PGLYRP-l стимулирует фагоцитоз внутриклеточных патогенных бактерий L. monocytogenes. С помощью инфекционной in vitro модели показано, что присутствие Tag-7/PGLYRP-l ингибирует внутриклеточное выживание L. monocytogenes, предохраняя эукариотические клетки от заражения.
Белок Tag-7/PGLYRP-l способствует выработке клетками ANA-1 активных форм кислорода, а так же провос-палительного цитокина IL-6.
Заключение. Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что пептидогликан-распознаю-щий белок Tag-7/PGLYRP-l активирует защитные механизмы врожденного иммунитета, препятствует заражению эукариотических клеток L. monocytogenes.
Работа поддержана грантом РФФИ № l5-04-07649.
Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-9069.20l6.4.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФАКТОРА, ИНГИБИРУЮЩЕГО МИГРАЦИЮ МАКРОФАГОВ, И ЕГО РЕЦЕПТОРА CD74 УСИЛИВАЕТСЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНОМ С ЛАБИЛЬНО СВЯЗАННОЙ МЕДЬЮ
Соколов А.В., Костевич В.А., Горбунов Н.П., Грудинина Н.А., Васильев В.Б.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Введение. Ранее нами было установлено, что медьсодержащий белок острой фазы воспаления церулоплаз-мин (ЦП), благодаря наличию лабильно связанных ионов меди, образует белок-белковый комплекс с фактором, ингибирующим миграцию макрофагов (МИФ) — ключевым цитокином воспаления. Введение насыщенного медью ЦП усиливало провоспалительную активность МИФ при моделировании септического шока у мышей in vivo, приводя к l00% смертности мышей, а аффинные антитела против МИФ препятствовали этому. Поскольку для активации провоспалительной активности МИФ необходимо его взаимодействие с инвариантной цепью главного комплекса гистосовместимости (CD74), были основания высказать гипотезу, что ЦП с лабильно связанной медью может влиять на взаимодействие МИФ и CD74. Целью
работы явилось исследование взаимодействия МИФ, ЦП и CD74. В задачи входило получение высокоочищенных белков и характеристика их взаимодействия.
Материалы и методы. Взаимодействие ЦП, МИФ и sCD74 изучали с помощью аффинной хроматографии, гель-фильтрации, электрофореза в полиакриламидном геле без детергентов и метода поверхностного плазмон-ного резонанса. Был клонирован внеклеточный домен рецептора CD74 (sCD74), получена плазмида, кодирующая N-концевую полигистидиновую последовательностью, сайт для гидролиза тромбином перед аминокислотной последовательностью sCD74. Отработан протокол, позволивший выделить высокоочищенный sCD74 из телец включения E. coli с помощью металл-хелатной хроматографии, гидролиза тромбином и аффинной хроматографии на МИФ-агарозе.
Результаты. Соответствие аминокислотной последовательности электрофоретически гомогенного sCD74 было доказано с помощью масс-спектрометрии фрагментов трипсинолиза (найдено 90% предсказанной последовательности). С помощью оптических сенсоров с иммобилизованным МИФ (BiaCore X-100) мы показали, что на взаимодействие МИФ и sCD74 практически не влияли ионы меди: константы диссоциации 19,1(+/-1,2) и 17,7(+/-0,9) нМ. ЦП лишенный ионов лабильной меди не влиял на взаимодействие МИФ и sCD74, напротив, присутствие ионов лабильной меди в ЦП увеличило сродство МИФ и sCD74 в 1,5 раза: константа диссоциации 12,2(+/-0,7) нМ. Аналогичные результаты были получены с помощью метода аффинной хроматографии: ЦП с лабильно связанными ионами меди способствовал взаимодействию sCD74 с иммобилизованным на агарозе МИФ. При гель-фильтрации ЦП, МИФ и sCD74 элюи-ровались совместно в буфере, содержащем 5 мкМ сульфата меди.
Заключение. Таким образом, мы показали, что ЦП может усиливать взаимодействие МИФ с внеклеточным доменом CD74.
Исследование поддержано грантом РФФИ № 16-0401182.
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОРАКОВЫХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСА ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА С ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ
Соколов А.В., Власенко А.Ю., Костевич В.А., Старикова Э.А., Киселева Е.П., Васильев В.Б.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Введение. Белок грудного молока и секреторных гранул нейтрофилов, лактоферрин (ЛФ), обладает противораковой активностью, однако механизм его действия изучен не до конца. Недавно было показано, что ЛФ молока коров подобно альфа-лактальбумину образует комплекс с олеиновой кислотой, вызывающий апоптоз раковых клеток в культуре. Целью работы явилось исследование взаимодействия ЛФ человека с олеиновой кислотой и его противораковых свойств in vitro и in vivo. В задачи входило исследование липолитического эффекта ЛФ, изучение взаимодействия ЛФ и олеиновой кислоты, влияния комплекса на апоптоз культивируемых клеток, а также наблюдение за ростом гепатомы 22А после подкожной инокуляции мышам.
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Материалы и методы. Липолиз после введения ЛФ мышам оценивали по концентрации неэстерифицирован-ных жирных кислот в сыворотке крови. Взаимодействие ЛФ и олеиновой кислоты оценивали по связыванию кислоты с белком после диализа их смеси. Апоптоз клеток линий HL-60, THP-1, Jurkat оценивали с помощью проточной цитометрии. Гепатому 22А (20 000 клеток) ино-кулировали мышам линии С3НА и ежедневно оценивали рост опухолей у контрольной группы животных и животных, получавших ежедневно внутрибрюшинного по 4 мг комплекса ЛФ-олеиновая кислота.
Результаты. В течение 1-5 часов после внутрибрю-шинной инъекции мышам ЛФ человека (100 мг/кг) мы обнаружили увеличение концентрации неэстерифици-рованных жирных кислот в 1,8-3,8 раза. При добавлении раствора олеиновой кислоты в этаноле к ЛФ мы не наблюдали образования мицелл, характерного для смешивания олеиновой кислоты с водой и физиологическим раствором. Титрование ЛФ олеиновой кислотой показало, что один моль ЛФ может связать до 8 моль олеиновой кислоты. Комплекс ЛФ с олеиновой кислотой индуцировал апоптоз раковых клеток (HL-60, THP-1, Jurkat). При изучении динамики роста опухолей после инокуляции гепатомы 22А у мышей линии С3НА в течение двух недель у пяти из девяти мышей, получавших комплекс ЛФ-олеиновая кислота, не наблюдалось заметного роста опухолей, в отличие от контрольной группы животных с практически равномерным и выраженным ростом опухолей. Однако на третью неделю наблюдений рост опухолей был заметен в обеих группах: средний диаметр опухолей в группе мышей, получавших комплекс лак-тоферрин-олеиновая кислота, составил 7(+/-4) мм, а у контрольных мышей средний диаметр опухолей составил 17(+/-)5 мм.
Заключение. Таким образом, мы показали, что комплекс ЛФ с олеиновой кислотой обладает противораковым эффектом in vitro и in vivo. В дальнейшем планируется оптимизировать дозу комплекса и схему его введения при исследовании противоракового эффекта in vivo. Исследование поддержано грантом Президента РФ MK-5074.2016.4.
ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ PSEUDOMONASAERUGINOSA НА КЛЮЧЕВЫЕ ЭФФЕКТОРЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
Солдатенкова А.В., Калошин А.А., Борисова О.В., Калиниченко Е.О., Ахматова Н.К., Михайлова Н.А.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия
Патологии, ассоциированные с P. aeruginosa, являются серьезной проблемой для иммунокомпрометирован-ных пациентов. В ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова проводятся исследования по разработке вакцинного препарата против P. aeruginosa на основе рекомбинантных белков патогена.
Цель и задачи. Исследование влияния комплекса рекомбинантных антигенов Pseudomonas aeruginosa на систему адаптивного и врожденного иммунитета. Изучение протективного эффекта, синтеза специфических антител, уровня цитокинов и субпопуляционной структуры лимфоцитов селезенок мышей.
Объектом настоящего исследования явился комплекс рекомбинантных белков P. aeruginosa (белка F наружной
мембраны и рекомбинантной атоксической формы экзотоксина А [анатоксин]).
Ранее подобраны оптимальные дозы рекомбинантных белков OprF и анатоксина для индукции защитного эффекта, которые составили 25 мкг и 50 мкг на мышь (при двукратном введении) соответственно. В настоящей работе исследовали иммунный ответ на введение с двухнедельным интервалом комплекса рекомбинантных белков, сорбированных на гидроксиде алюминия в тех же дозах.
Протективный эффект оценивали по выживаемости мышей линии Balb/C после заражения живой вирулентной культурой P. aeruginosa, расчитывая ЛД50 и индекс эффективности. В результате проведенных экспериментов показано, что комплекс белков защищал животных с индексом эффективности 2,5.
Уровень синтеза специфических антител исследовали в ИФА с сорбированными на планшете рекомби-нантными белками. Выявлено существенное увеличение концентрации специфических IgG-антител в ответ на иммунизацию исследуемым комплексом по сравнению с интактными животными.
Уровень цитокинов определяли на проточном ци-тометре FC-500 (Beckman Culter, США) при помощи тест-системы FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10 plex. Через 4 ч, 8 ч, 24 ч и 14 дней после первой иммунизации осуществляли тотальный забор крови у групп мышей. Максимальные значения ТЫ-цитокинов наблюдали: к 24 ч для TNFa (увеличение в 8,5 раз ), к 8 часам для IL-1P ( в 13,4 раза), к 4 часам для IL-1a ( в 5,1 раз), к 8 ч для IL-2 ( увеличение в 2,7 раз), к 24 часам для IFNy и IL-12p70 (в 10,9 и 5,3 раз соответственно). Максимальные значения ^2-цитокинов в сыворотках наблюдали через 8 часов для IL-4 (увеличение в 1,4 раза), к 4 часам для IL-5 (в 2,9 раз) и к 24 часам в случае IL-6, IL-10, IL-13 (увеличение в 5,4; 3,7 и 1,5 раза соответственно). Динамика Th17-/Th21-/ ^22-цитокинов в сыворотках мышей под воздействием комплекса рекомбинантных белков была следующей: IL-17A максимально повышался через 8 часов (в 248,4 раза), IL-21 — через 8 ч (увеличение с 0 до 17,33 пкг/мл), IL-22 — через 8 часов ( в 3,2 раза).
Для изучения субпопуляционной структуры лимфоцитов через две недели после курса иммунизаций у животных извлекали селезенки, выделяли спленоциты и окрашивали моноклональными антителами, меченными флюоорохромом, к поверхностным клеточным маркерам (Caltag Laboratories, США). Исследование показало, что в опытной группе (иммунизированные мыши) повышалось содержание NK-клеток (CD16+/CD32+, в 1,64 раз), T-хелперов (CD4+, в 1,25 раз), В1-лимфоцитов (CD5+, в 1,13 раз), В2-лимфоцитов (CD19+, в 2,3 раз) при снижении численности цитотоксических лимфоцитов (CD8+, в 1,47 раз) по сравнению с контролем (неимму-низированные мыши). В общей популяции клеток повышалось содержание типов, экспрессирующих маркеры ранней (CD25+) и поздней (MHCII+) активации клеток.
Таким образом в результате проведённых исследований установлена активация клеточных и гуморальных звеньев иммунной системы в ответ на введение исследуемого комплекса рекомбинантных белков, что открывает перспективы для создания вакцины на его основе.
Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий» на 2016 год.
