CC BY
17
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Материалы и методы. Липолиз после введения ЛФ мышам оценивали по концентрации неэстерифицирован-ных жирных кислот в сыворотке крови. Взаимодействие ЛФ и олеиновой кислоты оценивали по связыванию кислоты с белком после диализа их смеси. Апоптоз клеток линий HL-60, THP-1, Jurkat оценивали с помощью проточной цитометрии. Гепатому 22А (20 000 клеток) ино-кулировали мышам линии С3НА и ежедневно оценивали рост опухолей у контрольной группы животных и животных, получавших ежедневно внутрибрюшинного по 4 мг комплекса ЛФ-олеиновая кислота.
Результаты. В течение 1-5 часов после внутрибрю-шинной инъекции мышам ЛФ человека (100 мг/кг) мы обнаружили увеличение концентрации неэстерифици-рованных жирных кислот в 1,8-3,8 раза. При добавлении раствора олеиновой кислоты в этаноле к ЛФ мы не наблюдали образования мицелл, характерного для смешивания олеиновой кислоты с водой и физиологическим раствором. Титрование ЛФ олеиновой кислотой показало, что один моль ЛФ может связать до 8 моль олеиновой кислоты. Комплекс ЛФ с олеиновой кислотой индуцировал апоптоз раковых клеток (HL-60, THP-1, Jurkat). При изучении динамики роста опухолей после инокуляции гепатомы 22А у мышей линии С3НА в течение двух недель у пяти из девяти мышей, получавших комплекс ЛФ-олеиновая кислота, не наблюдалось заметного роста опухолей, в отличие от контрольной группы животных с практически равномерным и выраженным ростом опухолей. Однако на третью неделю наблюдений рост опухолей был заметен в обеих группах: средний диаметр опухолей в группе мышей, получавших комплекс лак-тоферрин-олеиновая кислота, составил 7(+/-4) мм, а у контрольных мышей средний диаметр опухолей составил 17(+/-)5 мм.
Заключение. Таким образом, мы показали, что комплекс ЛФ с олеиновой кислотой обладает противораковым эффектом in vitro и in vivo. В дальнейшем планируется оптимизировать дозу комплекса и схему его введения при исследовании противоракового эффекта in vivo. Исследование поддержано грантом Президента РФ MK-5074.2016.4.
ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ PSEUDOMONASAERUGINOSA НА КЛЮЧЕВЫЕ ЭФФЕКТОРЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
Солдатенкова А.В., Калошин А.А., Борисова О.В., Калиниченко Е.О., Ахматова Н.К., Михайлова Н.А.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия
Патологии, ассоциированные с P. aeruginosa, являются серьезной проблемой для иммунокомпрометирован-ных пациентов. В ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова проводятся исследования по разработке вакцинного препарата против P. aeruginosa на основе рекомбинантных белков патогена.
Цель и задачи. Исследование влияния комплекса рекомбинантных антигенов Pseudomonas aeruginosa на систему адаптивного и врожденного иммунитета. Изучение протективного эффекта, синтеза специфических антител, уровня цитокинов и субпопуляционной структуры лимфоцитов селезенок мышей.
Объектом настоящего исследования явился комплекс рекомбинантных белков P. aeruginosa (белка F наружной
мембраны и рекомбинантной атоксической формы экзотоксина А [анатоксин]).
Ранее подобраны оптимальные дозы рекомбинантных белков OprF и анатоксина для индукции защитного эффекта, которые составили 25 мкг и 50 мкг на мышь (при двукратном введении) соответственно. В настоящей работе исследовали иммунный ответ на введение с двухнедельным интервалом комплекса рекомбинантных белков, сорбированных на гидроксиде алюминия в тех же дозах.
Протективный эффект оценивали по выживаемости мышей линии Balb/C после заражения живой вирулентной культурой P. aeruginosa, расчитывая ЛД50 и индекс эффективности. В результате проведенных экспериментов показано, что комплекс белков защищал животных с индексом эффективности 2,5.
Уровень синтеза специфических антител исследовали в ИФА с сорбированными на планшете рекомби-нантными белками. Выявлено существенное увеличение концентрации специфических IgG-антител в ответ на иммунизацию исследуемым комплексом по сравнению с интактными животными.
Уровень цитокинов определяли на проточном ци-тометре FC-500 (Beckman Culter, США) при помощи тест-системы FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10 plex. Через 4 ч, 8 ч, 24 ч и 14 дней после первой иммунизации осуществляли тотальный забор крови у групп мышей. Максимальные значения ТЫ-цитокинов наблюдали: к 24 ч для TNFa (увеличение в 8,5 раз ), к 8 часам для IL-1P ( в 13,4 раза), к 4 часам для IL-1a ( в 5,1 раз), к 8 ч для IL-2 ( увеличение в 2,7 раз), к 24 часам для IFNy и IL-12p70 (в 10,9 и 5,3 раз соответственно). Максимальные значения ^2-цитокинов в сыворотках наблюдали через 8 часов для IL-4 (увеличение в 1,4 раза), к 4 часам для IL-5 (в 2,9 раз) и к 24 часам в случае IL-6, IL-10, IL-13 (увеличение в 5,4; 3,7 и 1,5 раза соответственно). Динамика Th17-/Th21-/ ^22-цитокинов в сыворотках мышей под воздействием комплекса рекомбинантных белков была следующей: IL-17A максимально повышался через 8 часов (в 248,4 раза), IL-21 — через 8 ч (увеличение с 0 до 17,33 пкг/мл), IL-22 — через 8 часов ( в 3,2 раза).
Для изучения субпопуляционной структуры лимфоцитов через две недели после курса иммунизаций у животных извлекали селезенки, выделяли спленоциты и окрашивали моноклональными антителами, меченными флюоорохромом, к поверхностным клеточным маркерам (Caltag Laboratories, США). Исследование показало, что в опытной группе (иммунизированные мыши) повышалось содержание NK-клеток (CD16+/CD32+, в 1,64 раз), T-хелперов (CD4+, в 1,25 раз), В1-лимфоцитов (CD5+, в 1,13 раз), В2-лимфоцитов (CD19+, в 2,3 раз) при снижении численности цитотоксических лимфоцитов (CD8+, в 1,47 раз) по сравнению с контролем (неимму-низированные мыши). В общей популяции клеток повышалось содержание типов, экспрессирующих маркеры ранней (CD25+) и поздней (MHCII+) активации клеток.
Таким образом в результате проведённых исследований установлена активация клеточных и гуморальных звеньев иммунной системы в ответ на введение исследуемого комплекса рекомбинантных белков, что открывает перспективы для создания вакцины на его основе.
Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий» на 2016 год.
