CC BY
68
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
с таковым в контроле. При этом концентрация прогестерона, соответствующая III триместру беременности, приводит к увеличению количества нейтрофилов с недифференцированным ядром, а концентрация прогестерона, соответствующая II триместру беременности, ведет к формированию внеклеточных ловушек нейтрофилами.
Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что прогестерон в концентрациях, соответствующих I, II и III триместрам беременности, приводит к снижению кислородзависимой бактерицидной функции неактивированных нейтрофилов и, напротив, к усилению формирования внеклеточных ловушек, максимальное значение которых регистрируется в группе, где концентрация прогестерона соответствует II триместру беременности. Скорее всего, полученные данные в эффектах действия прогестерона на нейтрофилы можно объяснить различием в рецепторном аппарате, обеспечивающем бактерицидную функцию и формирование НВЛ.
Американские ученые показали, что при оплодотворении происходит стимуляция миграции нейтрофилов на слизистые оболочки женского репродуктивного тракта, где происходит образование НВЛ в ответ не только на различные микроорганизмы, но и на сперматозоиды. Интересно, что в семенной плазме были обнаружены различные виды ДНКаз, которые разрушают структуру НВЛ и освобождают связанные ловушками сперматозоиды, восстанавливая их подвижность. Также ученые предполагают, что некоторые белки плазмы способны подавлять активацию нейтрофилов в отношении сперматозоидов, но не бактерий. В связи с этим недостаточность ДНКаз-ной активности семенной плазмы или активности ее некоторых белков может быть одной из причин бесплодия [6].
На сегодняшний день считается, что прогестерон проявляет иммуносупрессивные и противовоспалительные свойства [1], и при изучении влияния прогестерона на окислительную
бактерицидность нейтрофилов мы подтверждаем данный факт, но интересно, что при этом прогестерон увеличивает количество НВЛ. Возможно, именно НВЛ принадлежит роль обеспечения антимикробной резистентности репродуктивного тракта матери и защиты плода от инфекций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алешкин В. А. Иммунология репродукции. - Чита, 2004.
2. Долгушин И. И., Андреева Ю. С., Савочкина А. Ю. Нейтрофиль-ные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. - М., 2009.
3. Ширшев С. В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий. - Екатеринбург, 2009.
4. Шмагель К. В. Иммунитет беременной женщины. - М., 2003.
5. Долгушин И. И., Андреева Ю. С. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: метод обнаружения и оценка эффективности улавливания бактерий // Микробиология. - 2009. - № 2. - С. 65-67.
6. Alghamdi A. S., FosterD. N. Seminal DNase frees spermatozoa entangled in neutrophil extracellular traps // Biol. Reprod. - 2005. -Vol. 73. - P. 1174-1181.
7. Bouman A., HeinemanM. J., FaasM. M. Sex hormones and the immune response in humans // Hum. Reprod. Update. - 2005. - Vol. 11. - P. 411-423.
8. McDonnell D. P. Molecular pharmacology of estrogen and progesterone receptors // Menopause. Biology and Pathology. - , 2000.
- P. 459-480.
9. Molloy E. J. Amanda J. Sex-specific alterations in neutrophil apoptosis: the role of estradiol and progesterone // Blood. - 2003. - Vol. 102. - P. 2653-2659.
10. Zena M., Ghirardelloa A. Hormones, immune response, and pregnancy in healthy women and SLE patients // Swiss. Med. Wkly.
- 2010. - Vol. 140, N 13-14. - P. 187-201.
11. Fuchs T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps // J. Cell Biol. - 2007. - Vol. 176. - P. 231-241.
Поступила 13.02.12
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.373.3.015.46.076.9
А. В. Солдатенкова, Н. К. Ахматова, Н. А. Михайлова
влияние рекомбинантного анатоксина на эффекторы иммунного ответа у мышей
Лаборатория протективных антигенов, лаборатория механизмов регуляции иммунитета ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва (105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а)
Разработан штамм-продуцент рекомбинантной атоксичной формы экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa. Рекомбинантный анатоксин состоит из доменов I, II и части домена III с делецией 106 аминокислотных остатков CooH-терминального участка и обладает антигенными, протективными и иммуногенными свойствами. Цель исследования - изучить влияние рекомбинантного анатоксина на иммунофенотип и функциональную активность клеток-эффекторов иммунной системы.
Мышам внутрибрюшинно вводили по 50 мкг рекомбинантного анатоксина с интервалом 2 нед. Через 7 дней после каждой иммунизации у животных оценивали субпопуляционную структуру лимфоцитов селезенок методом проточной цитометрии. Уровень цитокинов в сыворотках мышей после однократной иммунизации (50 мкг) рекомбинантным анатоксином исследовали через 2, 4, 6 и 24 ч методом проточной цитометрии при помощи тест-системы FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10 plex.
Рекомбинантный анатоксин вызывал изменение численности клеток-эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета, активировал TLR2, TLR4 и TLR9, в ранние сроки стимулировал продукцию провоспалительных, а позднее и противовоспалительных цитокинов. Рекомбинантный анатоксин способен активировать эффекторы иммунной системы и оказывать регулирующее действие на иммунные механизмы с формированием полноценного иммунного ответа с врожденными и адаптивными составляющими.
Ключевые слова: экзотоксин A, Pseudomonas aeruginosa, рекомбинантный токсин, иммунофенотип, TLRs, цитокины
- 245 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
A.V. Soldatenkova, N.K. Akhmatova, N.A. Mikhailova
INFLUENCE OF RECOMBINANT TOXOID ON-EFFECTORS OF THE IMMUNE RESPONSE IN MICE
A strain-producer of a nontoxic recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, was developed. It consists domains I, II and III with the deletion of 106 amino acid residues COOH-terminal region.
Recombinant toxoid demonstrate antigenic, protective and immunogenic properties. Aim: Evaluation of recombinant toxoid effects by using immunophenotype and functional activity of immune system effector cells.
Mice were injected intraperitoneally with 50 |jg of recombinant toxoid with an interval of 2 weeks. 7 days after each immunization we assessed the spleen subpopulation structure of lymphocytes by using flow cytometry analysis.
The cytokine responses of mice were monitored by using flow cytometry analysis at 2, 4, 6 and 24 hours after immunization («FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10 plex»).
The recombinant toxoid induced change in the number of effector cells of innate and adaptive immunity, activated TLR2, TLR4 and TLR9, stimulated more production of proinflammatory cytokines and on the latest research phases - antiinflammatory cytokines.
aTox3 able to activate effectors of the immune system and exert a regulating effect on the immune mechanisms withe formation of a complete immune response with innate and adaptive components.
Key words: exotoxin A, Pseudomonas aeruginosa, recombinant toxoid, immunophenotype, TLRs, cytokines
Введение. Pseudomonas aeruginosa - распространенный грамотрицательный, аэробный, оппортунистический патоген человека и животных. Среди здоровой части населения синегнойная палочка редко вызывает заболевания, однако среди иммунокомпрометированных больных риск заболеваемости резко возрастает. P. aeruginosa является причиной развития различных заболеваний, в том числе острых инфекций, ассоциированных с высокой заболеваемостью и смертностью.
К настоящему времени разработано и апробировано множество вариантов вакцин против P. aeruginosa. Среди них препараты, приготовленные на основе живых аттенуированных бактерий [9, 10], убитых суспензией микробов [6], липополисахаридов (ЛПС) [8], на основе белков наружной мембраны [4, 5], белков жгутиков [17], в том числе экзотоксина A (ЭТA). Однако по разным причинам в настоящее время в клинической практике ни один из препаратов, предназначенных для иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойной инфекции, не используют.
Неэффективность терапии антибиотиками за счет полирезистентности большинства клинических изолятов, а также отсутствие зарегистрированных иммунопрепаратов для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых P. aeruginosa, обусловливают актуальность разработки специфических защитных средств против данного патогена.
Среди многочисленных факторов патогенности особый интерес представляет ЭТA, ингибирующий белковый синтез в эукариотических клетках, поэтому создание вакцинного препарата против P. aeruginosa на основе протективных эпитопов ЭТA представляется перспективным.
Ранее нами получен штамм-продуцент рекомбинантного анатоксина синегнойной палочки. Продуцируемый анатоксин состоит из доменов I, II и части домена III с делецией 106 аминокислотных остатков COOH-терминального участка. Установлено, что анатоксин обладает способностью индуцировать образование специфических нейтрализующих антител у мышей и кроликов, обеспечивающих протектив-ную активность в отношении ЭТA Pseudomonas aeruginosa [2, 3], однако молекулярно-клеточные механизмы формирования иммунного ответа остаются неизученными.
Цель исследования - изучить влияние рекомбинантного анатоксина на иммунофенотип и функциональную активность клеток-эффекторов иммунной системы.
Материалы и методы. Препараты и штаммы. В работе использовали штамм-продуцент рекомбинантного анатоксина (E. coli BL21(DE3)-ATOX) и препарат рекомбинантного анатоксина.
Мыши. Мышей линии CBA массой 18-20 г получали из питомника «Андреевка» Московской области. Животных вы-
Солдатенкова Алена Владимировна - мл. науч. сотр., асп., тел. 8 (945) 917-57-74, e-mail:[email protected]
водили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных.
Получение рекомбинантного анатоксина. Штамм-продуцент культивировали в жидкой LB-среде, содержащей 25 мкг/мл канамицина, при 37°C и скорости перемешивания 250 об/мин. По достижении оптической плотности среды значения 0,6 (при длине волны 600 нм) добавляли ИПТГ (изопропилМ-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 3 ч. Биомассу собирали центрифугированием с ускорением 5000 g в течение 10 мин при температуре 4°C. Очистку рекомбинантного белка проводили при помощи Ni-агарозы с использованием буферных растворов B, C, D, E, имеющих следующий состав: 8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М Tris. Растворы различались по pH: буфер B - 8,0, C - 6,3; D - 5,9; E - 4,5.
Электрофорез в ПААГ проводили по общепринятой методике. После электрофореза в ПААГ отбирали фракции, содержащие рекомбинантный анатоксин, и проводили с ними ступенчатый диализ: препарат в стерильных условиях диа-лизовали против 20 объемов буфера C при температуре 4°С и постоянном перемешивании. Каждый час добавляли 50 мМ Tris-буфера pH 9,0, уменьшая таким образом концентрацию мочевины до 6 М, затем до 4, 2 и 1 М. Затем диализный мешок помещали в раствор 50 мМ Tris-буфера pH 9,0 и инкубировали в течение 18 ч, дважды обновляя раствор для диализа.
Иммунизация мышей. Мышам внутрибрюшинно вводили по 50 мкг анатоксина в 0,5 мл физиологического раствора трехкратно с интервалом 2 нед. В качестве контроля использовали мышей, которым вводили только физиологический раствор. Через 7 дней после каждой иммунизации у животных извлекали селезенки с целью изучения динамики изменения иммунофенотипа лимфоцитов. Для оценки уровня цитокинов у мышей забирали кровь через определенные интервалы времени (2, 4, 6, 24 ч) после однократного введения препарата в тех же дозах.
Получение суспензии мононуклеарных лейкоцитов (МЛ).Суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в 5 мл среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия). Клетки осаждали 10 мин центрифугированием со скоростью 250 g в 1 мин при температуре 4°C. Осадок ресуспендировали и удаляли эритроциты гипотоническим шоком: к осадку добавляли 900 мкл дистиллированной воды и перемешивали 10 с, затем добавляли 100 мкл 10-кратного раствора Хенкса (МПБП, Россия). После лизиса эритроцитов спленоциты осаждали и дважды отмывали средой RPML Подсчет живых и мертвых клеток проводили в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего в 0,9% растворе NaCl.
Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов селезенки мышей осуществляли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител к соответствующим антигенам различных субпопуляций лимфоцитов. Клет-
- 246 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 1% фетальной телячьей сывороткой (ФТС) и окрашивали согласно инструкции производителя («Caltag Laboratories», США) моноклональными антителами, меченными флюорохромом к поверхностным клеточным маркерам (CD3,
CD4, CD8, CD19, ySTCR, MHCII, TLR2,
TLR4, TLR9, меченные FITC: CD25, NK1.1^
PE; Foxp3 □ APC). Затем клетки отмывали 2 раза холодным ФСБ с 1% ФТС. Результаты учитывали на проточном цитометре FC-500 («Beckman Coulter», США). Для исследования TLR9 (Toll-подобный рецептор) и FoxP3 клетки предварительно обрабатывали пермеабилизирующим буфером (Permea-bilization Wash Buffer; «Biolegend», США) согласно инструкции производителя. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 5000 клеток в гейте. Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WinMDI 2.8.
Уровень цитокинов определяли на проточном цитометре FC-500 («Beckman Culter», США) при помощи тест-системы FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10 plex с использованием шариков, сенсибилизированных моноклональными антителами к цитокинам (GM-CSF, интерферон (INF)-y, интерлейкин (IL)-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,
IL-10, IL-17, фактор некроза опухоли а (TNF-а)) («Bioscience», США).
Результаты. Субпопуляционную структуру лимфоцитов селезенок оценивали при трехкратной иммунизации мышей через 7 сут после каждого введения рекомбинантного анатоксина (рис. 1).
Рекомбинантный анатоксин вызывал изменение численности клеток-эффекторов как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Об интенсивности иммунного ответа свидетельствовало нарастание уровня T-хелперов (CD4) и цитоксических лимфоцитов (CD8) - соответственно в 1,4 и 1,1—1,7 раза, а также их соотношения (CD4/CD8) на всех сроках наблюдения. Уровень CD3 повышался после каждой иммунизации и достигал своего максимума (с 58 ± 4,3 до 72 ±
5,5%) после 3-й инъекции, что указывало на активацию T-лимфоцитов.
Введение препарата обеспечивало активацию эффекторов врожденного иммунитета (натуральных киллеров —NK, NKT, y5T). Уровень CD16-экспрессирующих натуральных киллеров повышался в 4,5, 2,5 и 1,7 раза после 1, 2 и 3-й иммунизации, а yST-лимфоцитов — в 8,5, 10,5, 11,8 раза соответственно по сравнению с контролем.
Натуральные киллеры — T-лимфоциты (NKT — CD3/CD16) в большей степени активировались после 1-й иммунизации. После 2-й и 3-й инъекций существенных различий между исследуемыми группами не выявили.
На инициацию гуморальных механизмов иммунитета указывает повышение количества CD21-экспрессирующих клеток (в основном зрелых B-лимфоцитов). Максимальное количество этих клеток отмечали после 3-й иммунизации (повышение в 2,1 раза).
Рис. 1. Влияние рекомбинантного анатоксина (в %) на иммунофенотип МЛ селезенок мышей линии CBA.
а — после 1-й иммунизации, б — после 2-й, в — после 3-й.
1 — CD3; 2 — CD16; 3 — CD3/CD16; 4 — CD4; 5 — CD25; 6 — CD4/CD25/FoxP3; 7 — CD8; 8 — MH y5T; 10 -
II; 9 -
CD21; 11 — TLR2; 12 — TLR4; 13 — TLR9.
Об активации иммунных защитных механизмов свидетельствовало повышение численности клеток с маркером ранней активации клеток — CD25, представленным на активированных T- и B-лимфоцитах и моноцитах. Максимальное нарастание количества клеток с экспрессией данного маркера наблюдали после 1-й иммунизации мышей (7,4 ± 0,6% против 2,1 ± 0,5% в контроле). Последующие введения рекомбинантного анатоксина постепенно снижали численность CD25-экспрессирующих клеток.
- 247 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
Рис. 2. Изменение уровня цитокинов в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантным анатоксином, через 2, 4, 6 и 24 ч после иммунизации. 1 - IL-1a; 2 - IL-6; 2 - GM-CSF; 4 - IL-17; 5 - IFN-y; 6 - TNF-a; 7 - IL-5; 8 - IL-4; 9 - IL-10; 10 - IL-2.
Противоположную картину зафиксировали в отношении другого маркера - MHCII, который указывает на позднюю активацию эффекторов иммунной системы. Клетки с экспрессией данного маркера увеличивались в численности на все сроки наблюдения, достигая максимального уровня на последний срок иммунизации (54 ± 4,7% против 10 ± 0,5% в контроле). Такое изменение в динамике содержания клеток, экспрессирующих дифференцировоч-ные и активационные маркеры, свидетельствовало об активации механизмов иммуногенеза.
Введение рекомбинантного анатоксина также приводило к повышению количества T-regs (CD4/ CD25/FoxP3+-клеток), максимальный уровень которых отметили после 3-й иммунизации (в 4,5 раза выше контроля). Данный факт имеет важное значение, поскольку включение регуляторных механизмов иммунитета позволяет сдерживать чрезмерную активацию клеток, препятствующих их деструкции.
Эффективность распознавания микробных антигенов, взаимодействующих с TLRs, а также запуск сигнальных путей активации врожденного иммунитета в значительной мере определяют способ введения антигенов в организм в зависимости от их химической природы и концентрации. TLRs, являясь представителями паттернраспознающих рецепторов (PRRs), активируют механизмы врожденного иммунитета. Впоследствии сигналы, полученные от TLRs, приводят к формированию адаптивного иммунитета [1, 11].
Таким образом, особый интерес представлял мониторинг экспрессии TLRs под воздействием рекомбинантного анатоксина, так как данные рецепторы участвуют в распознавании продуктов микробного происхождения.
Уровень TLR2 оставался повышенным на протяжении всего опыта (максимально после 2-й иммунизации: 6,1 ± 0,5%).
Экспрессия TLR4 максимально повышалась при введении рекомбинантного анатоксина после 1-й иммунизации (в 4,25 раза), затем снижалась практически до фоновых значений, что могло свидетельствовать о незначительной примеси ЛПС в данном препарате.
Активность экспрессии внутриклеточных TLR9 была выше в 1,8, 6,8 и 1,2 раза после 1, 2 и 3-й иммунизаций соответственно. Результаты экспериментов показали, что рекомбинантный анатоксин при внутрибрюшинном введении вызывает различные сигнальные пути клеточной активации: повышается экспрессия TLR4, TLR9, TLR2, что обусловливает дальнейшую клеточную дифференцировку по Th1-и в определенной степени по №2-пути.
На следующем этапе работы изучали изменение цитокинового профиля сывороток мышей в динамике при введении рекомбинантного анатоксина (рис. 2).
Сроки наблюдения были выбраны в предварительных экспериментах при использовании различных микробных антигенов в соответствии с последовательностью этапов воспаления, характеризующихся пиками секреции отдельных цитокинов.
Мониторинг концентрации цитокинов показал изменение уровня как Th1-, так и Th2-индуцирующих цитокинов.
Так, о запуске начальных событий иммунного ответа свидетельствует значительное повышение на всех этапах наблюдения содержания IL-1a, про-
- 248 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
дуцирующегося преимущественно макрофагами (максимальное повышение через 2 ч: 887,4 ± 11,3 пг/мл).
Также значительные изменения обнаружили в уровне IL-6 (более 3000 пг/мл), который является мощным фактором дифференцировки B- и T-клеток. Многие клетки вырабатывают IL-6, включая Th2, макрофаги, ДК, фибробласты, эндотелиальные клетки и др. IL-6 является главным индуктором конечного этапа дифференцировки B-клеток и макрофагов, мощным стимулятором выработки белков острой фазы клетками печени.
Уровень IL-2, фактора роста и дифференцировки T-лимфоцитов, NK-клеток и B-лимфоцитов, а также INF-y повышался только в последний срок исследования (22,2 ± 1,9; 248,8 ± 4,8 пг/мл соответственно). Максимальный всплеск IL-17 выявили в 3-й срок исследования - 6,5 ± 0,5 пг/мл. Продукт макрофагов TNF-a, участвующий в развитии иммунного ответа в качестве кофактора ростовых цитокинов, максимально синтезировался через 2 ч (44,9 ± 2,5 пг/мл).
Уровень Т