CC BY
27
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
апоптоза Т-клеток различных областей тимуса крыс, вызываемого интраперитонеальным переносом аутологич-ных макрофагов, предварительно активированных in vitro бактериальным полисахаридом и окрашенных прижизненных красителем для выяснения их топографической локализации в тимусе.
Материалы и методы. Исследование проведено на 28 крысах линии Вистар. У животных забирали клеточную взвесь интраперитонеального смыва и инкубировали в питательной среде RPMI-1640 в течение суток в пластиковых чашках Петри. Концентрировали содержание макрофагов посредством многократного отбора надосад-ка с неприкреплёнными клетками. В культуральную среду опытной группы добавляли липополисахарид (ЛПС) E. coli (0,1 мкг/мл) и раствор прижизненного красителя 5-карбофлуоресцеин диацетата (0,5 мкг/мл); к контрольной группе добавляли только краситель. Через 24 часа инкубации, прикрепленные к пластику макрофаги, отделяли 0,02% раствором Версена и вводили интраперитоне-ально животному-хозяину. Через 24 часа после введения клеток, проводили декапитацию и тимэктомию животных. Отобранные тимусы делили на две части: из одной получали клеточную взвесь для анализа на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD, USA), вторую подвергали иммуногистохимическому анализу на криостат-ных крезах. Для выявления тимоцитов в стадии апоптоза окрашивали их антителами к аннексину. Подсчет мигрировавших в тимус клеток проводили в программе ImagePro Insight 6.0.
Результаты. Адаптивный перенос крысам аутологич-ных макрофагов, предварительно активированных бактериальным липополисахаридом in vitro, усиливал миграцию этих клеток с периферии в тимус на 74,8±12,2% (P < 0,01) относительно животных, которым вводили аутологичные макрофаги без активации эндотоксином. Гистологическое исследование показало, что меченые макрофаги, мигрировавшие в тимус, локализовались преимущественно в кортико-медулярной и субкапсулярной зонах, хотя часть клеток обнаруживалась и в корковой области. Иммуногистохимическое исследование продемонстрировало, что во всех этих зонах достоверно увеличивалось количество тимоцитов в состоянии раннего апоптоза (P < 0,01). Проточная цитофлуориметрия лейкоцитарной взвеси, полученной из тимусов животных контрольной и экспериментальной групп, также продемонстрировала достоверное увеличение количества тимоцитов на стадии раннего апоптоза после трансфера животным аутологич-ных ЛПС-стимулированных макрофагов на 84,4±21,3% (P < 0,001).
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что неспецифическая стимуляция макрофагов бактериальным липополисахаридом усиливает их миграцию в те области тимуса, где идут процессы антигеннезависи-мой дифференцировки Т-клеток. Усиленная миграция активированных макрофагов сопровождается интенсификацией апоптоза тимоцитов в этих областях тимуса. Описанные факты расширяют наши представления о механизмах акцидентальной атрофии тимуса, добавляя к основным исполнителям макрофагов, мигрирующих в тимус с периферии после их активации бактериальным эндотоксином.
ОРГАНИЗАЦИЯ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ, РАСПОЗНАВАЕМЫХ РЕГУЛЯТОРНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ ФАКТОРОМ НА Fc-ФРАГМЕНТАХ IgG ЧЕЛОВЕКА
Сидоров А.Ю., Бедулева Л.В., Меньшиков И.В., Терентьев А.С., Ирина М.П.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет», Ижевск, Россия
Введение. В недавно проведенных нами исследованиях было показано, что устойчивость к развитию экспериментально-вызванных аутоиммунных заболеваний, а также их ремиссия ассоциированы с продукцией популяции ревматоидного фактора, выявляемого методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов (Beduleva, 2015). Полученные факты обозначают данную популяцию ревматоидного фактора как фактор регуляции аутореактивности и потенциальную биомишень, усиливая продукцию которой, можно подавлять аутоиммунные реакции. Чтобы отличать популяцию ревматоидного фактора ассоциированного с устойчивостью к развитию экспериментальных аутоиммунных заболеваний от известных ранее популяций, продукция которых предсказывает и усиливает аутоиммунные заболевания, мы назвали ее регуляторный ревматоидный фактор (регРФ) (Sidorov, 2017). Мы также показали, что антигенные детерминанты для регРФ можно индуцировать на Fc фрагментах гомологичного IgG. Иммунизация крыс такими фрагментами вызывает повышение уровня регРФ и редукцию симптомов коллаген-индуцирован-ного артрита (Sidorov, 2017). Было выяснено, что данные антигенные детерминанты формируются в шарнирной области Fc-фрагментов IgG, были найдены условия их индукции. Однако организация антигенных детерминант распознаваемых регРФ не ясна.
Цель и задачи. Целью исследования было выяснить организацию антигенных детерминант для регуляторного ревматоидного фактора на Fc-фрагментах IgG человека.
Материалы и методы. Fc-фрагменты IgG человека получали методом папаинового протеолиза. Выделение и очистку Fc фрагментов проводили методами экс-клюзионной хроматографии на колонке Sephacryl S 100 26/400, аффинной хроматографии на protein A- и protein G-сефарозе. О наличии антигенных детерминант на Fc-фрагментах IgG для регуляторного РФ судили по способности последних вызывать дозозависимое торможение агглютинации нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванной регуляторным РФ. Количество свободных сульфгидрильных групп на Fc-фрагментах IgG человека определяли методом Эллмана. Алкилирование сульфгидрильных групп проводили избытком йодацета-мида с последующей очисткой от примеси йодацетами-да методом эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex 200 10/300.
Результаты. Были исследованы Fc-фрагменты IgG человека несущие и не имеющие антигенных детерминант узнаваемых регРФ человека. Обнаружено, что коэффициент поглощения Fс-фрагментов IgG, несущих антигенные детерминанты для регРФ, при 280 нм в 2 раза выше, чем Fc-фрагментов IgG, не имеющих таких детерминант. Данный факт указывает на то, что формирование антигенных детерминант для регРФ сопровождается изменением конформации Fc-фрагментов IgG. Все дисуль-фидные связи в шарнире Fc-фрагментов IgG человека,
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
несущих антигенные детерминанты для регРФ, восстановлены, обнаруживается 4 свободные сульфгидрильные группы/молекулу. Fc-фрагменты IgG человека, не имеющие детерминант для регРФ, содержат шарнир, однако тиольные группы в нем образуют дисульфидные связи. Алкилирование свободных сульфгидрильных групп Fc-фрагментов IgG ведет к потере свойства Fc-фрагментов IgG подавлять агглютинацию нагруженных IgG эритроцитов, вызванную регРФ. Данный факт не исключает, что SH группы шарнирной области непосредственно входят в состав антигенных детерминант, узнаваемых регРФ.
Заключение. Таким образом, формирование антигенных детерминант для регуляторного ревматоидного фактора на Fc-фрагментах IgG человека происходит в результате восстановления межцепочечных дисульфидных связей шарнира, сопровождающегося изменением кон-формации Fc-фрагментов IgG.
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ РАСТВОРИМОГО ЭНДОГЛИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ И ЕГО КОМПЛЕКСОВ
Смирнов И.В., Грязева И.В., Самойлович М.П., Шашкова О.А., Крутецкая И.Ю., Столбовая А.Ю., Крылова А.А.1, Берлина М.А., Пиневич А.А., Вартанян Н.Л., Климович В.Б.
Российский научный центр радиологии и хирургических технологий, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Эндоглин (CD105) представляет собой го-модимерный мембранный антиген клеток сосудистого эндотелия с молекулярным весом 90 кДа. Он является компонентом рецепторных комплексов TGF-ß, BMP и активина. Растворимая форма антигена образуется в результате протеолитического расщепления экстраклеточной части рецептора посредством MMP-14 и имеет молекулярный вес 80 кДа. Избыточное образование этого антигена может вызывать системную дисфункцию сосудистого эндотелия. Определение содержания этого эндо-глина в плазме крови используют для оценки вероятности развития преэклампсии у беременных женщин и прогнозирования течения ряда онкологических заболеваний.
При создании двухцентровых иммуноферментных систем, направленных на выявление растворимого эндогли-на, было обнаружено, что разные пары моноклональных антител выявляют различное (до двух порядков) содержание этого антигена в одних и тех же образцах плазмы крови человека. Эти результаты могут быть объяснены отсутствием или маскированием другими белками части эпитопов растворимого эндоглина.
Цель. Исследование аффинно выделенных из плазмы крови молекул растворимого эндоглина и копрецепити-рующих с ними белков.
Материалы и методы. Молекулы растворимого эндо-глина и копрецепитирующие с ними белки были выделены из пулового образца плазмы крови здоровых доноров посредством иммуноаффинной хроматографии. Их анализ вели с помощью методов электрофореза, иммунобло-та и двухцентрового ИФА. Также был применен подход последовательного сепарирования молекулярных комплексов на мембранах с уменьшающимися диаметрами пор. Моноклональные антитела к эндоглину человека, использованные в исследовании, были получены и охарактеризованы в лаборатории гибридомной технологии (Смирнов И.В., 2015).
Результаты. С помощью элеткрофореза в нативных условиях и иммуноблота показано, что молекулы растворимого эндоглина входят в состав надмолекулярных белковых комплексов с молекулярным весом более 200 кДа. Их размеры позволяют проходить через сепарирующие мембраны, имеющие пороги отсечения 1000 и 300 кДа. Комплексы эндоглина задерживаются мембраной с порогом отсечения 100 кДа.
Использование буферов с детергентными и хаотроп-ными агентами при подготовке проб для электрофоре-тического разделения приводит к частичной дезинтеграции молекулярных комплексов эндоглина и появлению фракции свободных димерных и мономерных молекул антигена (160 и 80 кДа). Тем не менее, существенная часть молекул эндоглина остается связанной с другими белками. Добавление восстанавливающего реагента приводит к полной диссоциации комплексов растворимого эндоглина и формированию трех фракций антигена (80 кДа, 70 кДа и 60 кДа).
Заключение. С помощью иммунохимических методов продемонстрирована молекулярная гетерогенность растворимого эндоглина плазмы крови и вхождение этого антигена в состав молекулярных комплексов.
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОГЛИКАН-РАСПОЗНАЮЩЕГО БЕЛКА TAG-7/PGLYRP-1 НА ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ВЫЖИВАНИЕ LISTERIA MONOCYTOGENES
Слонова Д.А.1, 2, Посвятенко А.В.2, 3, Сысолятина Е.В.4, Еромолаева С.А.4, Кибардин А.В.2, 3, Лысюк ЕЮ.2' 3, Гапонов А.М.2, Гнучев Н.В.3, Георгиев Г.П.3, Ларин С.С.1' 2 3
1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Москва, Россия
2 ФГБУ «Национальный научно-практический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии
им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
3 ФГБУН «Институт биологии гена» РАН, Москва, Россия
4 ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
В настоящее время в медицине описано несколько заболеваний, вызываемых внутриклеточными патогенами (туберкулез, менингококковая инфекция, бруцеллез и другие). Одним из таких заболеваний является листе-риоз. Его возбудитель Listeria monocytogenes — широко распространенная грамположительная бактерия, обладающая способностью к внутриклеточному паразитизму. Лечение листериоза чаще всего проводится антибиотиками, однако в последнее время стали применять и комплексную терапию, направленную на усиление внутренней защиты организма. Одним из компонентов системы врожденного иммунитет является пептидогликан распознающий белок Tag-7/PGLYRP-1.
Цель. Исследовать влияние белка Tag-7/PGLYRP-1 на свойства бактерий и их взаимодействие с компонентами врожденного иммунитета.
Материалы и методы. В работе использовали человеческий пептидогликан-распознающий рекомбинантный белок Tag-7/PGLYRP-1, полученный с помощью эука-риотической экспрессионной системы. Для оценки эф-
