CC BY
24
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
Таким образом, было установлено, что регуляторные клетки действительно принимают участие в сдерживании патологического процесса при инфекции, но модуляция инфекционного процесса с помощью клеточной терапии является очень сложной задачей, решение которой требует, как минимум, детальных знаний о динамике воспалительного процесса, и кратности введения клеток.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского Научного Фонда 15-15-30020.
ВЛИЯНИЕ СЕМАФОРИНА 3А НА ФУНКЦИИ ТИМОЦИТОВ МЫШИ
Рутто К.В., Кудрявцев И.В., Людыно В.И., Киселева Е.П.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Семафорин ЗА (Sema 3A) известен как фактор, направляющий рост аксонов. Однако действие этого фактора гораздо шире и затрагивает клетки иммунной системы. В тимусе он синтезируется эпителиальными клетками и регулирует процесс адгезии тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса человека (Lepelletier Y., 2007).
Цель. Изучение влияния Sema ЗА на пролиферацию, миграцию и адгезию тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса мыши.
Адгезию тимоцитов проводили на двух линиях эпителия тимуса мыши — кортикального cTEC1-2 и медуллярного mTEC3-10 (Kasai M. et al., 1996). Пролиферацию ти-моцитов изучали в присутствии конканавалина А (Con А) и без него с помощью МТТ-теста и визуального подсчета клеток. Миграцию тимоцитов мыши изучали с использованием поликарбонатных вставок с диаметром пор 5 мкм 24-луночного формата (Kim C. et al., 1998).
На первоначальном этапе исследований с использованием реакции обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) было выявлено, что тимоциты экспрессируют мРНК следующих рецепторов Sema ЗА: PlexA1, PlexA2, PlexA3 и Nrp-1. При исследовании поверхностной экспрессии рецепторов с помощью проточной цитометрии среди тимоцитов было выявлено 37,5% PlexA1+ клеток и 89,8% Nrp-1+ клеток. Полученные данные указывают на то, что тимоциты могут служить мишенями для действия Sema 3A.
С помощью MTT-теста было показано, что Sema ЗА снижает митоген-индуцированную пролиферацию ти-моцитов в концентрациях 100 нг/мл (ОП570 в контроле - 0,285±0,014, n = 6; с Sema ЗА - 0,236±0,013, n = 5, p < 0,05) и 200 нг/мл (ОП570 в контроле - 0,З17±0,021, n = 6; с Sema ЗА - 0,24З±0,011, n = 6, p < 0,05). Полученные данные подтвердились при визуальном подсчёте клеток (в контроле - 4,82±0,09 млн/мл, n = З; с Sema ЗА 100 нг/мл - 4,28±0,06 млн/мл, n = З, p < 0,05; с Sema ЗА 200 нг/мл -З,48±0,11 млн/мл, n = З, p < 0,05).
Далее было показано, что Sema ЗА в концентрациях 10-200 нг/мл дозозависимо ингибировал адгезию тимо-цитов к обеим клеточным линиям (при З0 и 120 мин инкубации) с максимальны эффектом в концентрации 200 нг/мл. Чтобы выяснить, какие клетки являются мишенью действия Sema ЗА, тимоциты и эпителиальные клетки прединкубировали раздельно с Sema ЗА (200 нг/мл) в течение 2 ч, после чего клетки отмывали З раза и проводили
адгезию в течение 30 мин. Ингибирующий эффект Sema 3A сохранялся только при предварительной обработке тимоцитов, как на cTEC1-2 (индекс адгезии в контроле 33,12±0,57 n = 10; с Sema 3A 28,4±1,6 n = 10, p < 0,05), так и на mTEC3-10 (в контроле 39,66±0,82 n = 8; с Sema 3A 32,53±0,76 n = 10, p < 0,001). При этом предобработка Sema 3A клеток эпителия эффекта не давала. Обработка тимоцитов блокирующими антителами к Nrp-1 полностью отменяла ингибирующий эффект 200 нг/мл Sema 3A на адгезию тимоцитов к кортикальным (индекс адгезии в контроле 43,96±1,85 n = 6; с Sema 3A 21,58±9,96 n = 6; с Sema 3A и антителами к Nrp-1 — 42,67±1,33 n = 6, p < 0,001) и медуллярным клеткам (в контроле: 28,85±1,10 n = 6; с Sema 3A 24,40±1,59 n = 6; с Sema 3A и антителами к Nrp-1: 32,54±1,95 n = 6, p < 0,05). Таким образом, ингибирующий эффект Sema 3A был связан с его действием на тимоциты, а не на клетки эпителия, и опосредован через рецептор Nrp-1 на тимоцитах.
Кроме того, Sema 3A в концентрации 100 нг/мл оказывал хеморепеллентный эффект в отношении тимоцитов, а предобработка тимоцитов антителами к Nrp-1 отменяла эффект Sema 3A (индекс миграции в контроле 1,49±0,01 n = 5; с Sema 3A 0,65±0,08 n = 5, p < 0,001; с Sema 3A и антителами к Nrp-1 - 1,21±0,08 n = 5, p < 0,01).
Таким образом, были получены новые данные о влиянии Sema3A на пролиферацию, миграцию тимоцитов мыши и их адгезию к эпителиальным клеткам тимуса, имеющие значение для лучшего понимания процесса созревания Т-лимфоцитов.
Работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-06150.
ЛПС-СТИМУЛИРОВАННЫЕ МАКРОФАГИ МИГРИРУЮТ В ТИМУС И ИНДУЦИРУЮТ АПОПТОЗ ТИМОЦИТОВ
Семенова М.А., Сергеев В.Г.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет» Ижевск, Россия ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия», Ижевск, Россия
Введение. Представление о роли тимуса в иммунологических механизмах инфекционных заболеваний ограничивается представлением о закономерной акциден-тальной инволюции этого органа в ходе формирования адаптационного синдрома в ответ на действие стрессор-ных инфекционных агентов. Наряду с данными о прямом атрофическом действии на тимус гормонов надпочечников, появляется информация о том, что и сами бактериальные агенты через клеточное опосредование влияют на интенсивность гибели тимоцитов. Важную роль в механизмах такого взаимодействия могут играть макрофаги, которые, как показали последние исследования, способны проникать в тимус после нагрузки антигеном на периферии и вызывать селективную клональную делецию тимоцитов, имеющих рецепторы к данному антигену.
Однако из этих экспериментов остается неясным ограничено ли их действие только делецией относительно зрелых антигенспецифических Т-клеток мозгового вещества, или мигрирующие в тимус макрофаги способны к индукции апоптоза малодифференцированных тимоцитов корковой зоны, т.е. участвовать в процессе атрофии тимуса. Для ответа на этот вопрос мы провели эксперимент, целью которого явилась оценка интенсивности
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
апоптоза Т-клеток различных областей тимуса крыс, вызываемого интраперитонеальным переносом аутологич-ных макрофагов, предварительно активированных in vitro бактериальным полисахаридом и окрашенных прижизненных красителем для выяснения их топографической локализации в тимусе.
Материалы и методы. Исследование проведено на 28 крысах линии Вистар. У животных забирали клеточную взвесь интраперитонеального смыва и инкубировали в питательной среде RPMI-1640 в течение суток в пластиковых чашках Петри. Концентрировали содержание макрофагов посредством многократного отбора надосад-ка с неприкреплёнными клетками. В культуральную среду опытной группы добавляли липополисахарид (ЛПС) E. coli (0,1 мкг/мл) и раствор прижизненного красителя 5-карбофлуоресцеин диацетата (0,5 мкг/мл); к контрольной группе добавляли только краситель. Через 24 часа инкубации, прикрепленные к пластику макрофаги, отделяли 0,02% раствором Версена и вводили интраперитоне-ально животному-хозяину. Через 24 часа после введения клеток, проводили декапитацию и тимэктомию животных. Отобранные тимусы делили на две части: из одной получали клеточную взвесь для анализа на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD, USA), вторую подвергали иммуногистохимическому анализу на криостат-ных крезах. Для выявления тимоцитов в стадии апоптоза окрашивали их антителами к аннексину. Подсчет мигрировавших в тимус клеток проводили в программе ImagePro Insight 6.0.
Результаты. Адаптивный перенос крысам аутологич-ных макрофагов, предварительно активированных бактериальным липополисахаридом in vitro, усиливал миграцию этих клеток с периферии в тимус на 74,8±12,2% (P < 0,01) относительно животных, которым вводили аутологичные макрофаги без активации эндотоксином. Гистологическое исследование показало, что меченые макрофаги, мигрировавшие в тимус, локализовались преимущественно в кортико-медулярной и субкапсулярной зонах, хотя часть клеток обнаруживалась и в корковой области. Иммуногистохимическое исследование продемонстрировало, что во всех этих зонах достоверно увеличивалось количество тимоцитов в состоянии раннего апоптоза (P < 0,01). Проточная цитофлуориметрия лейкоцитарной взвеси, полученной из тимусов животных контрольной и экспериментальной групп, также продемонстрировала достоверное увеличение количества тимоцитов на стадии раннего апоптоза после трансфера животным аутологич-ных ЛПС-стимулированных макрофагов на 84,4±21,3% (P < 0,001).
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что неспецифическая стимуляция макрофагов бактериальным липополисахаридом усиливает их миграцию в те области тимуса, где идут процессы антигеннезависи-мой дифференцировки Т-клеток. Усиленная миграция активированных макрофагов сопровождается интенсификацией апоптоза тимоцитов в этих областях тимуса. Описанные факты расширяют наши представления о механизмах акцидентальной атрофии тимуса, добавляя к основным исполнителям макрофагов, мигрирующих в тимус с периферии после их активации бактериальным эндотоксином.
ОРГАНИЗАЦИЯ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ, РАСПОЗНАВАЕМЫХ РЕГУЛЯТОРНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ ФАКТОРОМ НА Fc-ФРАГМЕНТАХ IgG ЧЕЛОВЕКА
Сидоров А.Ю., Бедулева Л.В., Меньшиков И.В., Терентьев А.С., Ирина М.П.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет», Ижевск, Россия
Введение. В недавно проведенных нами исследованиях было показано, что устойчивость к развитию экспериментально-вызванных аутоиммунных заболеваний, а также их ремиссия ассоциированы с продукцией популяции ревматоидного фактора, выявляемого методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов (Beduleva, 2015). Полученные факты обозначают данную популяцию ревматоидного фактора как фактор регуляции аутореактивности и потенциальную биомишень, усиливая продукцию которой, можно подавлять аутоиммунные реакции. Чтобы отличать популяцию ревматоидного фактора ассоциированного с устойчивостью к развитию экспериментальных аутоиммунных заболеваний от известных ранее популяций, продукция которых предсказывает и усиливает аутоиммунные заболевания, мы назвали ее регуляторный ревматоидный фактор (регРФ) (Sidorov, 2017). Мы также показали, что антигенные детерминанты для регРФ можно индуцировать на Fc фрагментах гомологичного IgG. Иммунизация крыс такими фрагментами вызывает повышение уровня регРФ и редукцию симптомов коллаген-индуцирован-ного артрита (Sidorov, 2017). Было выяснено, что данные антигенные детерминанты формируются в шарнирной области Fc-фрагментов IgG, были найдены условия их индукции. Однако организация антигенных детерминант распознаваемых регРФ не ясна.
Цель и задачи. Целью исследования было выяснить организацию антигенных детерминант для регуляторного ревматоидного фактора на Fc-фрагментах IgG человека.
Материалы и методы. Fc-фрагменты IgG человека получали методом папаинового протеолиза. Выделение и очистку Fc фрагментов проводили методами экс-клюзионной хроматографии на колонке Sephacryl S 100 26/400, аффинной хроматографии на protein A- и protein G-сефарозе. О наличии антигенных детерминант на Fc-фрагментах IgG для регуляторного РФ судили по способности последних вызывать дозозависимое торможение агглютинации нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванной регуляторным РФ. Количество свободных сульфгидрильных групп на Fc-фрагментах IgG человека определяли методом Эллмана. Алкилирование сульфгидрильных групп проводили избытком йодацета-мида с последующей очисткой от примеси йодацетами-да методом эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex 200 10/300.
Результаты. Были исследованы Fc-фрагменты IgG человека несущие и не имеющие антигенных детерминант узнаваемых регРФ человека. Обнаружено, что коэффициент поглощения Fс-фрагментов IgG, несущих антигенные детерминанты для регРФ, при 280 нм в 2 раза выше, чем Fc-фрагментов IgG, не имеющих таких детерминант. Данный факт указывает на то, что формирование антигенных детерминант для регРФ сопровождается изменением конформации Fc-фрагментов IgG. Все дисуль-фидные связи в шарнире Fc-фрагментов IgG человека,
