CC BY
248
Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N14. Текущий раздел: Радиобиология
Влияние острого гамма облучения на изменение показателей клеточного цикла в культуре клеток линии 293 HEK.
Боженко В.К., Иванов А.В., Кулинич Т.М., Шишкин А.М., ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения РФ, г. Москва.
Полный текст статьи в PDF: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v14/papers/shishkin_v14.pdf Адрес документа для ссылки: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v14/papers/shishkin_v14.htm Статья опубликована 30 июня 2014 года
Контактная информация:
Рабочий адрес: 117997, Москва, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86, ФГБУ «РНЦРР» Боженко Владимир Константинович - д.м.н., проф., руководитель отдела патоморфологии и лабораторной диагностики ФГБУ РНЦРР, +7(903)799-6484, vbojenko@mail.ru Иванов Андрей Валерьевич - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных технологий в онкологии ФГБУ РНЦРР, +7(499)120-11-14
Кулинич Татьяна Михайловна - к.м.н., врач к.л.д. клинико-диагностической лаборатории ФГБУ РНЦРР +7(499)120-11-14
Шишкин Александр Михайлович - старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий в онкологии ФГБУ РНЦРР, +7(499)120-11-14 schy@mail.ru Контактное лицо
Иванов Андрей Валерьевич - +7(499)120-11-14, an.v.ivanov@yandex.ru
Резюме
Цель. Цель настоящей работы заключалась в анализе изменений показателей клеточного цикла культуры клеток in vitro при однократном гамма-облучении в диапазоне 2-10 Гр. Материалы и методы. Методами проточной цитофлюориметрии исследована радиочувствительность клеточной линии 293 HEK после однократного облучения с помощью гамма-терапевтической установки «Рокус - АМ».
Основные результаты и основные выводы. Произведены количественная и качественная оценка радиочувствительности и изменения показателей клеточного цикла после однократного облучения в дозе 2 -10 Гр. Клеточная гибель при дозе 10 Гр достигла 40%. После облучения наблюдалась задержка пролиферации в фазе G2M. Этот эффект зависел от дозы и при 10 Гр после 24 ч 90% клеток находились в фазе G2M.
Ключевые слова: радиочувствительность, клеточный цикл, клеточная линия 293 HEK.
Influence of acute gamma irradiation on cell cycle parameters in 293 HEK cell culture. Bozhenko V.K., Ivanov A.V., Kulinich T.M., Shishkin A.M.
Federal State Budget Establishment "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" (RSCRR) of Ministry of Health of Russian Federation, Moscow
Bozhenko V.K. - Doctor of Medicine, professor, head of department of pathomorphology and laboratory diagnostics RSCRR +7(903)799-6484, vbojenko@mail.ru
Ivanov A.V. - candidate of Medical Science, leading researcher, laboratory of cellular technology in oncology RSCRR, +7(499)120-11-14
Kulinich T.M. - candidate of Medical Science, physician of clinical laboratory diagnostics clinical diagnostic laboratory, +7(499)120-11-14
Shishkin A.M. - senior researcher, laboratory of cellular technology in oncology RSCRR,
+7(499)120-11-14
Responsible for correspondence
Ivanov Andrey Valerievich - +7(499)120-11-14, an.v.ivanov@yandex.ru
Summary
Purpose. The aim of the work was to determine change of the quantitative indicators depending on the cell cycle after one fraction gamma irradiation in vitro.
Materials and methods. Cells (line 293 HEK) got single fraction irradiation on gamma-ray equipment "ROKUS-AM". Cell cycle was analyzed on Beckman Culter FC 500 flow cytometer. Standard PI-based method of dyeing was used.
The main results. Quantitative and qualitative assessment of radiosensitivity and changes in parameters of cell cycle after a single exposure to a dose of 2 to 10 Gy was carried out. Cell death after dose of 10 Gy reached 40%. After irradiation cell stopped proliferation at the G2M phase. This effect depended on dose and 90% cells stopped at G2M phase 24 hours after 10 Gy. After 48 hours most cells still were resting in G2M phase of cell cycle. Keywords: radiosensitivity, cell cycle, cell line 293 HEK.
Оглавление:
Введение
Цель работы
Материалы и методы
Результаты
Обсуждение
Выводы
Список литературы Введение
Известно, что чувствительность опухолей одного и того же типа к облучению у различных индивидуумов существенно различается (Кулинич и др. 2005). Также резко различаются последствия лучевой терапии для организма при облучении опухолей в сходных дозах (Pinar et al., 2007). Поэтому при онкологических заболеваниях чрезвычайно важно определять индивидуальную реакцию на радиационное воздействие. Из вышеизложенного следует, что поиск адекватных критериев оценки индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности является одной из важнейших проблем современной радиобиологии и медицины.
Так как радиочувствительность организма связана главным образом со способностью клеточных систем:
1) предотвращать возникновение повреждений ДНК;
2) репарировать индуцированные радиацией повреждения ДНК;
3) эффективно элиминировать клетки, в которых репарация повреждений ДНК невозможна (запуск апоптоза), то в настоящей работе был изучен один из основных компонентов, определяющих клеточную радиочувствительность, а именно, задержка пролиферации в G2 фазе клеточного цикла, позволяющая репарировать большинство повреждений ДНК.
О механизмах, которые отвечают за вариабельность радиочувствительности известно не все, но процессы репарации повреждений ДНК и индукции апоптоза являются определяющими в отклике клетки на воздействие радиации.
В зависимости от типа повреждения, способности и эффективности их репарации и продолжительности блокировки клеточного цикла в клетках либо будут образовываться генетические нарушения, либо будет запускаться апоптоз. Клеточная радиочувствительность имеет корреляционную зависимость как с количеством первичных
двунитевых разрывов ДНК, индуцированных ионизирующей радиацией, так и с количеством неотрепарированных двунитевых повреждений ДНК, однако, клоногенная выживаемость клеток коррелирует, как правило, только с неотрепарированными двунитевыми повреждениями ДНК (Dikomey and Brammer, 2001).
Данные о корреляции между цитогенетическими нарушениями и клеточной выживаемостью крайне противоречивы (Slavotinek et al., 1993; Champion et al., 1995). Это несоответствие может быть объяснено различиями по фазам клеточного цикла во время облучения и пролиферативной активности клеток. Особенно важны исследования распределения по фазам клеточного цикла в результате облучения, так как многие противоопухолевые агенты, в частности химиопрепараты, обладают различной эффективностью в зависимости от того, на какой фазе цикла находятся клетки мишени. Радиочувствительность клеток неодинакова на протяжении клеточного цикла. Наиболее радиочувствительной является фаза G2M. S-фаза является наиболее радиорезистентной. Gl-фаза имеет в своем начале радиорезистентный участок, а затем радиочувствительность повышается по направлению к S-фазе (Bernhard et al., 1995; Su, 2006). Кривые выживания могут иметь различную форму (Deschavanne, Fertil, 1996; van den Aardweg et al., 2002). Облученные клетки претерпевают задержку клеточного цикла. В ходе этой задержки происходят репарационные процессы, в частности, репарация разрывов ДНК (Bartek, Lukas, 2001; B0e et al., 2012). Возможны три типа задержки: задержка в G1-фазе, в S-фазе и G2/M (B0e et al., 2012; Dunne et al., 2003; Nagasawa et al., 2006). Исходом задержки может явиться возобновление движения по клеточному циклу или переход клетки в апоптоз (Dunne et al., 2003; Verheij, Bartelink, 2000). В процессе развития апоптоза можно выделить несколько этапов:
1. Инициаторная фаза - происходит инициация и трансдукция проапоптотического сигнала. В качестве индукторов апоптоза могут выступать самые различные факторы, например, проонкогены, молекулы-лиганды мембранных рецепторов смерти, цитотоксические химиопрепараты, радиация и др.
2. Эффекторная фаза - происходит активация каспазной системы клетки.
3. Фаза деградации клетки - деструкция клеточного материала. На этой фазе апоптотической гибели клеток происходит включение в работу нуклеаз, протеаз и липаз, что приводит к дезинтеграции всех клеточных систем.
В то же время показано, что время задержки клеточного деления зависит от дозы облучения, для большинства изученных культур клеток задержка деления соответствует примерно 1 ч на каждый 1 Гр. Принято считать, что задержку деления претерпевают все клетки популяции. Однако это представление не соответствует данным о различной
чувствительности клеток к ионизирующему излучению в различных фазах клеточного цикла и данным об изменении митотического индекса в зависимости от дозы облучения. Исходя из вышеизложенного, была проведена динамическая количественная оценка клеточной популяции по уровню клеточной гибели и распределение популяции по стадиям клеточного цикла после однократного облучения в диапазоне доз 2-10 Гр.
Цель работы
Целью настоящей работы было определение количественной зависимости изменения показателей клеточного цикла и гибели клеток при однократном гамма-облучении клеток in vitro в диапазоне доз 2-10 Гр.
Материалы и методы
В работе была использована клеточная линия 293HEK (клетки почки эмбриона человека, трансформированные ДНК аденовируса типа 5 (Ad 5)) (Graham et al., 1977). Культивирование осуществляли в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, по 50 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина и 2 мМ L-глутамина, при 37° С и 5% СО2. Для снятия и рассаживания клеток с плашки использовали 0.25% раствор трипсина в ЭДТА. Облучение проводили в культуральных чашках Петри диаметром 35 мм (Nunc, Дания), по 4 чашки в параллелях на каждую мощность дозы, с помощью гамма-терапевтической установки «Рокус - АМ». Мощность дозы составляла 0,77 Гр в минуту, в поле 20х20 см, РИП - 75. Облучение проводили в дозах 2, 4, 6, 8, 10 Гр. Набор дозы осуществлялся последовательным добавлением по 4 чашки через каждые 2 Гр. Таким образом, на каждую точку приходилось 4 образца культуры клеток. При облучении культура клеток представляла 75% монослой.
После воздействия гамма-излучения на клетки чашки Петри с культурой помещались в СО2-инкубатор (37° С, 5% СО2). Анализ изменений пролиферативной активности и уровня апоптоза, индуцированных воздействием гамма-излучения, проводился через 24 и 48 часов после облучения. Использовался метод проточной цитофлуориметрии (проточный цитофлуориметр FC500, Beckman-Culter). Клетки «снимали» со дна чашки Петри с помощью 0.25% раствора трипсина в ЭДТА, отмывали от среды в фосфатно-солевом буфере, половину от общего числа клеток образца (~1-105) фиксировали в этаноле для последующей окраски йодистым пропидием, а оставшуюся часть окрашивали двойной меткой - аннексин V - йодистый пропидий.
Для оценки уровня апоптоза была использована окраска аннексин V (CALTAG laboratories, США) - пропидий йодид (Rieger A.M. et al. 2011). Такой метод окраски
позволяет одновременно определять интактные клетки (отрицательные и по аннексину V, и по пропидию йодиду), клетки, находящиеся в «раннем» апоптозе (положительные по аннексину V, отрицательные по пропидию йодиду), и клетки, находящиеся в «позднем» апоптозе или в некрозе (положительные и по аннексину V и по пропидию йодиду). Для оценки изменений распределения клеток по фазам клеточного цикла был применен метод окраски фиксированных образцов йодистым пропидием (Calbiochem, San Diego, США). Предварительная фиксация клеток была проведена с помощью 70 % этилового спирта в течение 24 часов. Для исключения связывания йодистого пропидия с РНК фиксированные образцы обрабатывались РНКазой в конечной концентрации 50 мкг/мл (R - 4875, Sigma, США) в течение 15 минут при 37° С (Riccardi C, Nicoletti I, 2006; Rieger A.M. et al. 2011).
Обработку полученных результатов проводили с помощью программы FloMax 2.0 и программы для анализа показателей клеточного цикла ModFit 3.0, США.
Результаты и обсуждение
При облучении клеточной линии 293HEK в диапазоне доз 2 - 10 Гр через сутки отмечалось линейное увеличение количества погибших клеток по мере возрастания дозы. Количество клеток в стадии «раннего апоптоза» также линейно возрастало и составило 31% при дозе 10 Гр. Соответственно, линейно снижалось количество живых клеток и при максимальной дозе составило 58 % (рис.1).
80
• Живые
70
L
J
• Аннексии
• Пропидий йодид
on
4
0
2
4 6 8
доза, Гр
10
12
Рисунок 1. Зависимость доли живых клеток - «Живые», клеток перешедших в апоптоз -«Аннексин», и некротических клеток - «Пропидий йодид» от дозы (Гр) через 24 ч после облучения.
Через 48 часов сохранялась та же зависимость количества живых клеток и клеток, перешедших в апоптоз, при этом пропорция «живых» и «мертвых» клеток практически не изменилась (рис.2).
Рисунок 2. Зависимость доли живых клеток - «Живые», клеток перешедших в апоптоз -«Аннексин», и некротических клеток -«Пропидий йодид» от дозы (Гр) через 48 ч после облучения.
Количество некротических клеток («Пропидий йодид») через 48 часов снижалось до фоновых значений и не зависело от дозы облучения. Это говорит о том, что через 48 часов основная гибель клеток осуществляется за счет апоптоза, а не некроза. Распределение клеток культуры по клеточному циклу через 24 часа после облучения отличалось резким возрастанием количества клеток в 02М-фазе (рис.3).
доза, Гр
• 00 01 • Б 02 М
Рисунок 3. Распределение клеток по фазам клеточного цикла в зависимости от дозы через 24 часа после облучения.
При этом уже при дозе однократного гамма облучения 4 Гр практически все клетки через 24 часа находились в 02М фазе клеточного цикла. Одновременно наблюдалось снижение количества клеток, находящихся в фазе 01. Количество клеток в Б-фазе было снижено по сравнению с контролем и не менялось в зависимости от уровня дозы. Это говорит о том, что основная часть клеток блокировалась в фазе 02М. При этом клетки из 01-фазы переходили в Б-фазу и из нее в 02М, что вызывало снижение количества клеток в 01-фазе, увеличение в фазе 02М при постоянном количестве клеток в Б-фазе. Через 48 часов после облучения картина распределения клеток по фазам клеточного цикла менялась, хотя и оставалась зависимость преобладания 02М фазы при увеличении дозы облучения, а количество клеток в Б-фазе оставалось неизменным на всем диапазоне доз и не отличалось от такового в контроле (рис. 4).
Рисунок 4. Распределение клеток по фазам клеточного цикла в зависимости от дозы через 48 часов после облучения.
Сравнение клеточного цикла через 24 и 48 часов:
Сравнение данных, представленных на рисунках 3 и 4, показывает, что даже при облучении в дозе 10 Гр пусть и через 48 часов небольшая доля клеток способна преодолеть 02М блок и перейти в 01 фазу клеточного цикла. При этом доля клеток, перешедших из 02М в 01, возрастает практически линейно с уменьшением дозы и при дозе 2 Гр практически не отличается от контроля.
Если через 24 часа после облучения большинство клеток задерживается в 02М уже при дозе 4 Гр, то через 48 часов видно, что большая часть клеток (по сравнению с 24 часами) находится в 01 фазе (для дозы 6 Гр это, например, 8,1 % - через 24 часа и 33,6% - после 48 часов соответственно), т.е. часть клеток смогла преодолеть задержку в 02, поделиться и перейти в 01 фазу.
2 ГР
ТI ' I I | 1 Р Г 7 | I I I Г ^ Г ГЦ I | I I Г 1
«из гюо ля
(ПЗ )
3
е :
V
Е
в"
6 ГР
Г I I—I—|—1—1—I—I—[—I—1—1—г—
10 ГР
г^рг г 1 I | I I I I | I I I I | Ш И» та Ч «I
Рисунок 5. Распределения клеток линии 293 по фазам клеточного цикла через 24 часа после облучения в дозе 2- 10 Гр. Окраска пропидий йодидом. По оси абсцисс интенсивность - флюоресценции, по оси ординат - количество клеток.
При анализе гистограмм клеточного цикла через 24 часа после облучения (рис.5) обращает на себя внимание:
1. Увеличение пролиферативной активности клеток, выражающееся в увеличении числа клеток в 02М и снижении - в 01 фазах клеточного цикла.
2. Увеличение коэффициента вариации (СУ) для клеток в 02М - фазе с 9 до 25,8%.
Chaméis (FL3-)
А В
Рисунок 6. Распределение клеток культуры 293 по клеточному циклу после облучения в дозе 6 Гр. A - через 24 часа, B - через 48 часов после облучения. Окраска пропидий йодидом. По оси абсцисс - интенсивность флюоресценции, по оси ординат - количество клеток.
Сравнение гистограмм через 24 и 48 часов (рис. 6) также показывает увеличение CV пиков, особенно G2 через 48 часов, по сравнению с гистограммами через 24 часа.
Обсуждение
Несмотря на большие успехи в исследовании связи клеточного цикла и воздействия ионизирующего излучения на клетку, все еще много проблем остаются не решенными. Поддержание генетической стабильности клетки при воздействии на нее ионизирующей радиации реализуется с помощью комплекса молекулярных механизмов, которые включают остановку клеточного деления в различных фазах клеточного цикла и, собственно, механизмы репарации ДНК, реализуемые в период остановки прохождения по клеточному циклу. Впервые, остановка деления клеток после облучения была продемонстрирована в 1953 г. в работе (Howard, Pelc, 1953). В последующем было показано, что в ходе этой задержки происходят репарационные процессы, в частности, репарация разрывов ДНК (Bartek, Lukas, 2001; Boe et al., 2012). Хотя механизмы репарации, такие как гомологическая рекомбинация и негомологическое соединение концов являются важными ответами на двойные разрывы ДНК, регуляция клеточного цикла, вероятно, наиболее актуальный и ключевой аспект радиационной чувствительности. Показано, что несколько молекулярных путей (pathway) задействовано в контроле клеточного деления после воздействия ионизирующей радиации. Выделяют два основных механизма: один относится к комплексу cyclin B1/p34cdc2, а другой включает онкоген ras. Ras может существенно увеличивать длительность G2/M после
облучения клетки. При этом в инициации и реализации остановки деления задействован большой комплекс белков, таких как ATM, ATR, р53, p21 и др.
В настоящее время известно, что чувствительность клеток к ионизирующему излучению различна в различных фазах клеточного цикла. Наиболее чувствительны клетки в G2M фазе клеточного цикла, менее чувствительны в S и G1 фазе. Остановка деления в G2 фазе - один из основных механизмов ответа на повреждение ДНК клетки, и молекулярные механизмы инициации этой остановки активно изучаются. В то же время, механизмы контроля остановки клеточного деления в S и G2 фазе остаются далеки от полного понимания.
Несмотря на это, тот факт, что различные фазы клеточного цикла, отличаются радиочувствительностью, позволяет сделать вывод о наличии пути улучшения химио- и радиотерапии - это частичная синхронизация клеток и воздействие на клеточную популяцию в наиболее радиочувтсвительной фазе.
Применение веществ, сихронизирующих клетки в G2M может существенно повысить чувствительность клеточной популяции к воздействию радиации. Работы по радиосенсибилизирующему эффекту кофеина подтверждают эту точку зрения. Однако его применение in vivo затруднено побочными токсическими эффектами. В то же время, знание количественных закономерностей изменения распределения популяции клеток по фазам клеточного цикла после облучения во временной динамике имеет важное практическое значение для разработки новых схем фракционирования и использования различных химиопрепаратов до или после курсов лучевой терапии (Pawlik, Keyomarsi, 2004; Dillon et al. 2014).
Полученные в настоящей работе зависимости распределения популяции клеток по фазам клеточного цикла после однократного облучения позволяют сделать предварительные выводы о наибольшей эффективности облучения второй фракцией, если исходить из фундаментальных данных, что наибольшая чувствительность клеток к ионизирующему облучению характерна для G2M фазы. Анализ зависимости доза - облучение - количество клеток в G2M через 24 часа показывает, что наиболее целесообразно использовать разовую дозу от 4 и более Гр для облучения в режиме каждый день. Если анализировать зависимость доза - количество клеток в G2M через 48 часов, то целесообразней использование дозы 6 и более Гр. Дальнейшее изучение динамики клеточных популяций после однократного или фракционированного облучения необходимо для выяснения количественных закономерностей и углубленного понимания механизмов наблюдаемых эффектов.
Выводы
Облучение клеточной линии 293 HEK в диапазоне доз 2-10 Гр приводит к пропорциональному дозе линейному убыванию количества живых клеток через 24 и 48 часов после облучения. Одновременно линейно возрастает количество клеток, переходящих в апоптоз. При однократных дозах 4 и более Гр основное количество клеток (>80%) через 24 часа задерживается в фазе G2M. Через 48 часов эта доля уменьшается, и только 50% находятся в G2M фазе после 4 Гр облучения. Можно предположить, что часть из них преодолевает блок в G2M и переходит в фазу G1. Для задержки основной части клеточной популяции в G2M на 48 часов требуется доза 6 и более Гр.
Список литературы:
1. Кулинич Т.М., Боженко В.К., Сергеев И.Е., Сотников В.М., Хмелевский Е.В., Шишкин А.М. Изучение краткосрочных эффектов воздействия ионизирующего излучения на лимфоциты периферической крови больных неходжкинскими лимфомами in vitro //Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. 2005. N. 1. С. 3440.
2. Bartek J, Lukas J. Mammalian G1- and S-phase checkpoints in response to DNA damage. //Curr .Opin. Cell. Biol. 2001. V. 13(6). P. 738-47.
3. BernhardE.J.,Maity A.,MuschelR.J.,McKenna W.G. Effects of ionizing radiation on cell cycle progression.//Radiat.Environ.Biophys. 1995. V.34 P. 79-83
4. Sarcar B., Kahali S., Prabhu A. H., Shumway S. D.,YangXu T., Demuth, Chinnaiyan P.. Targeting radiation-induced G2/M checkpoint activation with the Wee-1 inhibitor MK-1775 in glioblastoma cell lines.//. Mol Cancer Ther Published OnlineFirst October 12, 2011. doi:10.1158/1535-7163.MCT-11-0469
5. Bee C.A., Krohn M., Redland G.E. et al. Induction of a G1-S checkpoint in fission yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012. V.109 (25). P. 9911-9916
6. Champion A. R., Hanson J. A., Court J.B. and Venables S. E. The micronucleus assay: an evaluation of its use in determining radiosensitivity in vitro.// Mutagenesis, 1995. V.10 P. 203-208.
7. Deschavanne P.J., Fertil B. A review of human cell radiosensitivity in vitro.// International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 1996. V. 34. N 1. P. 251-266
8. Dikomey E., Brammer I. Relationship between cellular radiosensitivity and non-repaired double-strand breaks studied for different growth states, dose rates and plating conditions in a normal human fibroblast line.// International Journal of Radiation Biology 2000. V. 76 P. 111113
9. Dillon M.T., Good J.S., Harrington K.J. Selective Targeting of the G2/M Cell Cycle Checkpoint to Improve the Therapeutic Index of Radiotherapy.// Clinical Oncology. 2014. V.26. N. 5. P. 257-265
10. Dunne A.L., Price M.E., Mothersill C. et al. Relationship between clonogenic radiosensitivity, radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells. //British Journal of Cancer. 2003. V. 89 (12). P. 2277-2283.
11. Graham F. L., Smiley J., Russell W. C., Nairn R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.// J. Gen. Virol. 1977. V. 36. N 7. P. 5972.
12. Howard A, Pelc SR. Synthesis of deoxyribonucleic acid in normal and irradiated cells and its relation to chromosome breakage. //Heredity 1953; V.6[suppl]: P. 261-273.
13. Nagasawa H., Keng P., Harley R., Dahlberg W., Little J.B. Relationship between gamma-rayinduced G2/M delay and cellular radiosensitivity //Int.J. RadiaBiol. 1994. V. 66(4). P.373-379.
14. Pawlik TM, Keyomarsi K. Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy. //Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2004 V.59(4) P.928-42.
15. Pinar, B., Lara, P.C., Lloret, M. . Radiation-induced DNA damage as a predictor of long-term toxicity in locally advanced breast cancer patients treated with high-dose hyperfractionated radical radiotherapy. // Radiat Res. 2007, 168(4), 415-422
16. Riccardi C, Nicoletti I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.// Nat Protoc. 2006. V. 1 N.3 P.1458-1461
17. Rieger A.M., Nelson K.L., Konowalchuk J.D., Barreda D.R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death // J. Vis. Exp. 2011 V. 24 P.2597
18. Slavotinek A., McMillan T. J. and Steel C. M. A comparison of micronucleus frequency and radiation survival in lymphoblastoid cell lines. //Mutagenesis. 1993. V. 8. P. 569-575
19. Su T.T. Cellular responses to DNA damage: one signal, multiple choices. //Annu. Rev. Genet. 2006. V. 40. P. 187-208.
20. van den Aardweg G.J.M.J., Naus N.C., Verhoeven A.C.A. et al. Cellular Radiosensitivity of Primary and Metastatic Human Uveal Melanoma Cell Lines. //Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. V. 43. N. 8. P. 2561-2565
21. VerheijM., BartelinkH. Radiation-induced apoptosis.// Cell Tissue Res. 2000. V. 301(1). P. 133-42.
ISSN 1999-7264 © Вестник РНЦРР Минздрава России © Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России
