CC BY
23
Раздел - Радиобиология
Сравнение индукции апоптоза в клеточных культурах при фотонном облучении низкой и сверхвысокой мощности
Шишкин А.М., Смирнов В.П., Грабовский Е.В., Олейник Г.М., Иванов А.В., Кулинич Т.М., Боженко В.К.
Грабовский Евгений Валентинович1- директор Отделения физики токонесущей плазмы (ОФТП) Троицкого института инновационных и термоядерных исследований, ГК Росатом, к.т.н.
Олейник Георгий Михайлович1 - Начальник лаборатории. Троицкий институт инновационных и термоядерных исследований, ГК Росатом, к.т.н.
Смирнов Валентин Пантелеймонович2 - главный научный сотрудник Отделения физики токонесущей плазмы (ОФТП) Научно исследовательского института технической физики и автоматизации, ГК Росатом, Москва, д. физ.-мат. наук, профессор, действительный член Российской академии наук.
Боженко Владимир Константинович4 - зав. отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, д.м.н., профессор. Шишкин Александр Михайлович4 - старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н. Иванов Андрей Валерьевич4 - старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н. Кулинич Татьяна Михайловна4 - заведующая лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н.
Ответственный за переписку: Владимир Константинович Боженко ул. Профсоюзная, д. 86, г. Москва, 117997 тел. 84991201114 vboienko@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России), 117997
1 - Троицкий институт инновационных и термоядерных исследований, ГК Росатом (ТРИНИТИ), Москва, Троицк;
2 - Научно исследовательский институт технической физики и автоматизации, ГК Росатом, Москва;
3 - ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, 117997, ГСП-7, г. Москва, ул. Профсоюзная, дом 86 (ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России)
Финансирование:
Работы были выполнены при поддержке ГК Росатом и гранта Российского научного фонда 15-10355.
Резюме
Цель: сравнить биологическую эффективность воздействия излучения высокой мощности и низкомощностного излучения по уровню развития позднего апоптоза при облучении ими культур клеток.
Материалы и методы: установки использовавшиеся для облучения: "Ангара-5-1" и "Рокус-АМ". На культурах А549, НЕК 293 и НСТ116 методом проточной цитофлуориметрии исследовано развитие позднего апоптоза по уровню гиподиплоидного пика при окраске пропидием иодидом.
Результаты: выявлен более высокий уровень развития позднего апоптоза при облучении клеточных культур излучением высокой мощности.
Заключение: в отношении развития позднего апоптоза, показана более высокая биологическую эффективность излучения высокой мощности по сравнению с низкомощностным излучением.
Ключевые слова: излучение сверхвысокой мощности, апоптоз, культура клеток, проточная цитофлуориметрия, относительная биологическая эффективность (ОБЭ)
Comparison of induction of apoptosis in cell cultures at low and ultra-high dose rate photon irradiation
Shishkin A.M. - Candidate (PhD) of Medical Sciences
Smirnov V.P. - Doctor of Physico-Mathematical Sciences, professor
Grabovski E.V. - Candidate (PhD) of Engineering Sciences
Oleinik G.M. - Candidate (PhD) of Engineering Sciences
Ivanov A.V. - Candidate (PhD) of Medical Sciences
Kulinich T.M. - Candidate (PhD) of Medical Sciences
Bojenko V.K. - Doctor of Medical Sciences, professor
117997 Moscow, Profsoyuznaya str., 86, Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (Russian Scientific Center of Roentgenoradiology). Summary.
Purpose: to compare the biological effectiveness of gamma radiation with ultra-high dose rate and conventional (therapeutic) dose rate on cell cultures.
Materials and methods: the setup used for irradiation: irradiation with ultra-high dose rate unique device - "Angara-5-1" and conventional gamma irradiation on therapeutical equipment "Rokus-AM". The cell cultures A549, HEK 293 and HCT116 investigated. The level of apoptosis was measured by flow-cytometry method and is defined as hypodiploid peak when stained with propidium iodide.
Results: it was found higher levels of late apoptosis upon irradiation of cell cultures with ultrahigh dose rate gamma radiation with equal dose.
Conclusion: in relation to the development of late apoptosis, higher level of biological effectiveness of gamma radiation discovered for irradiation with ultra-high dose rate compared with low (conventional, therapeutic) dose rate.
Keywords: ultra-high dose rate photon irradiation, apoptosis, cell culture, flow cytometry, relative biological effectiveness
Введение
Центральным вопросом клинических радиобиологических исследований является предсказание эффекта радиационного воздействия в зависимости от свойств применяемого облучения. [11].
Одной из возможных существенных характеристик облучения является мощность дозы. На сегодняшний день диапазон дозы в лучевой терапии простирается от примерно 0,1 Гр/ч до нескольких Гр/мин. Однако появление сильноточных импульсных ускорителей электронов и лазерных ускорителей пучков частиц, применяемых как для генерации корпускулярного излучения, так и фотонного, при работе в режиме генерации высокоинтенсивного тормозного излучения позволяет достичь мощности дозы в 109 Гр/с и выше.
Эта мощность дозы обычно называется сверхвысокой дозой. В ранних исследованиях авторы в основном не обнаружили различий в цитотоксическом эффекте in vitro при экспонировании клеток при обычной или сверхвысокой мощности дозы (108 Гр/с) или получили даже снижение ОБЭ. [7].
Результаты исследований последнего времени отличаются значительной противоречивостью. В нескольких последних исследованиях, при сравнении ОБЭ излучения с высокой мощностью дозы, порядка 109 Гр/с с обычным режимом
непрерывного облучения авторы не обнаружили существенной разницы между ними. [9, 2, 10].
В то же время, в других работах обнаружено существенное изменение ряда биологических показателей, таких как количество возникающих двунитевых разрывов, задержка клеточного цикла, изменение урвня экспрессии ряда генов и др., свидетельствующих о более высоком ОБЭ излучения со сверхвысокой мощностью [3, 4]. В ряде работ отмечена и обратная итенденция. Таким образом, данные по ОБЭ излучения со сверхвысокой мощностью на сегодняшний момент противоречивы [5].
Противоречивость полученных результатов может объясняться значительной разнородностью в условиях проведения исследований. К ним относятся использование различных биологических моделей, проведение облучения при разном уровне оксигенации, различная природа облучения и применение разных методов оценки повреждающего действия. [7; 11].
В целом, несмотря на уже значительную историю вопроса, изучение радиобиологии сверхвысокой дозы все еще находится в начальном состоянии. В то же время, ряд полученных на сегодняшний день доклинических данны, таких как данные о меньшем повреждающем действии сверхмощного облучения на нормальные ткани, при сохранении полноценного эффекта в отношении опухолевых клеток, могут сыграть значительную роль в развитии радиационной онкологии [8].
Поэтому исследование изменения биологической эффективности при ультравысоких мощностях дозы является актуальной, малоизученной фундаментальной проблемой в радиобиологии и медицинской радиологии. Материалы и методы Источники излучения.
Источником излучения сверхвысокой мощности являлась установка Ангара-5-1 [1]. Генерация излучения в установке осуществляется восемью независимыми модулями,
включенными параллельно, со среднеквадратичным разбросом времени срабатывания 10 нс. Продолжительность импульса напряжения на полувысоте амплитуды составляет 40 -70 нс. Основная энергия генерируемых квантов излучения лежит в области 200-600 кэВ. Регистрация временных параметров излучения осуществлялась алмазными рентгеновскими дозиметрами типа АД3. Для предварительной дозиметрии и дозиметрии в процессе постановки экспериментов использовались термолюминисцентные дозиметры (ТЛД) ДШ -03 на основе бората магния. Отжиг таблеток детекторов и определение дозы производилось с помощью прибора КДТ-02М. Для облучения образцы располагались в специальном дюралевом контейнере, имеющим вид цилиндра, обращенного дном к источнику. Толщина дна и стенок контейнера составляла 7мм. Предварительно проведенные эксперименты по распределению дозы в пространстве контейнера показали, что изменение дозы не превышает 10% на сантиметр в вертикальном и горизонтальном направлении. Для точного определения дозы в каждом сеансе облучения непосредственно рядом с образцами располагались ТЛД. Максимальная достигнутая в проведенных экспериментах мощность дозы превышала 100 МГр/сек.
В качестве источника излучения низкой мощности использовалась гамма-терапевтическая установка «Рокус-АМ». В проведенных экспериментах мощность дозы составляла 0,9 Гр/мин (15 мГр/сек). Облучение проводилось с расстоянием источник-поверхность 75 см в поле 10 х 10 см. Клеточные культуры
Были использованы следующие клеточные линии: А549 - (человек, карцинома легкого, предоставлена РАСХН), НЕК 293 (человек, почка эмбриона, трансформированная ДНК аденовируса типа 5 (Ad5), предоставлена РАСХН), НСТ-116 - (человек, колоректальный рак, предоставлена Институтом канцерогенеза). Клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)(ПанЭко), 50мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глутамина. Культивирование осуществлялось в С02-инкубаторе в
вентилируемых культуральных флаконах при 37°С, в 5% атмосфере СО2. Для пересева клеток из культурального флакона удаляли среду и, после промывки 2 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ)(ПанЭко) добавляли 0,5 мл 0.25% раствора трипсина в ЭДТА. Клетки отходили в течение 5 мин, после чего трипсин инактивировался добавлением культуральной среды. Пересев клеток осуществлялся таким образом, чтобы на момент облучения конфлюэнтность составляла 70-80%.
Непосредственно перед облучением адгезионные культуры снимали с матрасов с использованием раствора трипсина, отмывали и помещали в свежую среду. Транспортировка клеток до установок осуществлялась в закрытых флаконах при температуре 37°С. После облучения клетки культивировались в течение 24 и 48 часов, после чего снимались с культурального флакона как описано выше и фиксировались для последующего определения уровня позднего апоптоза. Определение уровня позднего апоптоза
Поздний апоптоз характеризуется образованием апоптотических телец, содержащих фрагментированную ДНК. Методами проточной цитофлуориметрии, при окраске клеток на ДНК, апоптотические тельца регистрируются на диаграммах содержания ДНК как субдиплоидный пик. Для окрашивания ДНК клеток использовался пропидий йодид (Р1). Пропидий йодид, как и большинство флуоресцирующих красителей, связывающихся с ДНК, не может проходить через мембраны интактных клеток [6] поэтому, чтобы повысить проницаемость мембран, клетки предварительно фиксировали спиртом. Для фиксации образцы клеточной суспензии центрифугировали при 300 g в течение 5 мин. После удаления супернатанта к осадку добавляли 1 мл ФСБ (рН=7.4), ресуспендировали и повторно центрифугировали в том же режиме. После удаления надосадочной жидкости, осадок ресуспендировали в 300 мкл ФСБ. К полученной суспензии по капле добавляли 900 мкл ледяного 70%-ного этанола (-20°С) при постоянном перемешивании. Хранение образцов осуществлялось при -20°С не более 4 дней.
Для окрашивания клеток на ДНК фиксированные образцы предварительно центифугировали при 300g в течение 10 минут. После удаления супернатанта, клетки отмывали 1 мл ФСБ. К осадку добавляли 100 мкл ФСБ и ресуспендировали. Поскольку йодида пропидия способен связываться также и с РНК, исследуемую клеточную суспензию инкубировали с 20 мклРНКазы А (R - 4875, Sigma) при 37°С в течение 30 мин для элиминирования РНК. После окончания инкубации в суспензию добавляли 50 мкл пропидия йодида (PI). Окрашивание проходило в течение 40 мин при комнатной температуре, в защищенном от света месте. Перед анализом на проточном цитофлуориметре в образец вносили 1 мл ФСБ. Конечная концентрация клеток составляла не менее 1 млн/мл. Анализ проводился на проточном цитофлуориметре Epics XL (Coulter-Beckman). Измерялось отношение клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК (субдиплоидный пик) к общему количеству клеток. Результаты и обсуждение
На рисунке 1 показаны типичные гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции пропидия йодида в контроле и после облучения в дозе 5 Гр (установка "Ангара-5-1") через 48 часов.
Подавляющая часть клеток в контроле, имеющих диплоидное содержание ДНК, представляет основной пик на рисунке 1А. Правее его располагается пик соответствующий клеткам, находящимся в процессе деления. После облучения, в клетках подвергающихся апоптотической гибели, ДНК фрагментируется и частично подвергается ферментативному распаду. При этом происходит снижение общего количества ДНК в клетке. Такие клетки формируют хорошо выраженный пик гиподиплоидной области - В на рисунке 1.В.
А. Контрольный образец
В. Образец после облучения и инкубации 48 часов.
Рисунок. 1. Гистограммы распределения клеток по содержанию ДНК (интенсивности флуоресценции пропидия йодида). По вертикали - число отсчетов клеток. По горизонтали - содержание ДНК. Процент апоптотических клеток представлен в виде субдиплоидного пика Окрашивание с Р1 после фиксации в этаноле
Для исследованных клеточных культур были построены кривые доза-эффект по определенной окрашиванием Р1 доле гиподиплоидных клеток в зависимости от дозы облучения. Получены данные по уроню позднего апоптоза через 24 и 48 часов после облучения.
Рисунок 2. Уровень апоптоза в культуре Л549 (рак легкого) после воздействия высокоинтенсивного тормозного излучения ("Ангара-5-1") и облучения на терапевтическом гамма-аппарате ("Рокус-АМ") через 24 и 48 ч
При облучении культур клеток на гамма-установке «Рокус-АМ» были взяты дозы: 0.5; 1; 2; 3; 4 и 5 Гр. При высокоинтенсивном тормозном облучении с помощью установки "Ангара-5-1", дозы облучения были эквивалентны 0.5; 1; 2; 4; 6 и 10 Гр. Как видно из рисунка 2, уровень апоптоза, вызванного воздействием на клетки А549 высокоинтенсивным тормозным излучением, значительно выше, чем уровень апоптоза при воздействии гамма-излучения, полученного с помощью терапевтической установки «Рокус-АМ». Так, при дозе 3 Гр и инкубации после облучения 48 часов, уровень апоптоза в образцах, облученных с помощью «Рокус-АМ», составил 13%, в образцах, облученных на установке "Ангара-5-1", уровень апоптоза превышал 19%.
Рисунок 3. Уровень апоптоза в культуре НЕК 293 (эмбриональная почка) после воздействия высокоинтенсивного тормозного излучения ("Ангара-5-1") и облучения на терапевтическом гамма-аппарате ("Рокус-АМ") через 24 и 48 ч
При проведении экспериментов на культуре НЕК 293 (эмбриональная почка), максимальная доза облучения составила 5 Гр для высокоинтенсивного тормозного излучения (установка "Ангара-5-1") и 6 Гр для терапевтической установки «Рокус-АМ». Как и в культуре А549, при воздействии на клетки высокоинтенсивного тормозного излучения уровень апоптоза был выше, чем при облучении культуры с помощью гамма-установки «Рокус-АМ». Также наблюдался резкое увеличение уровня апоптоза при дозах эквивалентных 0.5 - 1 Гр и следующая за резким подъемом уровня апоптоза, фаза «плато» (рисунок 3.).
Для культуры клеток линии НСТ-116 (колоректальный рак) эффекты воздействия ионизирующего излучения как гамма-установки «Рокус-АМ», так и установки
высокоинтенсивного тормозного излучения "Ангара-5-1", были минимальны. В данной культуре уровень апоптоза при любом воздействии не превышал 6%, а уровень спонтанного апоптоза, в культуре, не подвергшейся воздействию гамма-излучения, составлял 4%. Таким образом, культура клеток линии НСТ-116 оказалась радиорезистентной в использованном диапазоне доз.
Таким образом, при сравнительном исследовании влияния высокоинтенсивного тормозного излучения на культуры клеточных линий и лимфоциты периферической крови человека, установлено:
- уровень апоптоза в суспензии лимфоцитов здоровых доноров после воздействия высокоинтенсивного тормозного излучения "Ангара-5-1" выше, чем при воздействии излучения в эквивалентных дозах на терапевтическом гамма-аппарате "Рокус-АМ".
- высокоинтенсивное тормозное излучение обладает выраженным проапоптотическим эффектом в отношении ряда клеточных линий злокачественных новообразований человека.
Список литературы
1. Альбиков З.А., Велихов Е.П., Веретенников А.И. и др. Импульсный термоядерный комплекс Ангара-5-1. Атомная энергия. 1990. Т. 68. № 1. С. 26-35.
2. Auer S., Hable V., Greubel C., et al. Survival of tumor cells after proton irradiation with ultrahigh dose rates. Radiat Oncol. 2011. V. 6. P. 139.
3. Buontempo F., Isolan L., Ziron I., et al. Characterization of biological effects in radiotherapy applications of ultra-high dose rate pulses from a plasma focus device. European Journal of Cancer. 2016. V. 61. Suppl. 1. P. S9-S218.
4. Favaudon V., Caplier L., Monceau V., et al. Ultrahigh dose-rate FLASH irradiation increases the differential response between normal and tumor tissue in mice. Sci Transl Med. 2014. V.6. N. 245.
5. Konopacka M., Rogolinski J., et al. Can high dose rates used in cancer radiotherapy change therapeutic effectiveness? Contemp Oncol (Pozn). 2016. V. 20. N. 1. P. 449-452.
6. Michels J.J., Duigou F., Marnay J. Flow cytometry in primary breast carcinomas. Prognostic impact of proliferative activity. Breast Cancer Res Treat. 2000. V. 62. N. 2. P. 117-26.
7. Wilson P., Jones B., Yokoi T., et al. Revisiting the ultra-high dose rate effect: implications for charged particle radiotherapy using protons and light ions. Br J Radiol. 2012 V. 85 N. 1018. P.e933-e939.
8. Schüler E., Trovati S., King G., et al. Experimental Platform for Ultra-high Dose Rate FLASH Irradiation of Small Animals Using a Clinical Linear Accelerator. International Journal of Radiation Oncology. 2017. V. 97. N. 1. P. 195-203.
9. Shinohara K., Nakano H., Miyazaki N., et al. Effects of single-pulse (< or = 1 ps) X-rays from laser-produced plasmas on mammalian cells. J Radiat Res. 2004. V. 45. N. 4. P. 509-14.
10. Tillman C., Grafström G., Jonsson A.C., et al. Survival of mammalian cells exposed to ultrahigh dose rates from a laser-produced plasma x-ray source. Radiology. 1999. V. 213. N. 3. P. 860-5.
11. Zackrisson B. Biological effects of high energy radiation and ultra high dose rates. Umeâ university medical dissertations, New series No 315. Umeâ, 1991. 48pp.
