Изучение краткосрочных эффектов воздействия ионизирующего излучения на лимфоциты периферической крови больных неходжкинскими лимфомами in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ИЗУЧЕНИЕ КРАТКОСРОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЛИМФОЦИТЫ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ НЕХОДЖКИНСКИМИ ЛИМФОМАМИ

IN VITRO

Т.М. КУЛИНИЧ, В.К. БОЖЕНКО, И.Е. СЕРГЕЕВ, В.М. СОТНИКОВ,

Е.В. ХМЕЛЕВСКИЙ, А.М. ШИШКИН

Российский научный центр рентгенорадиологии М3 РФ. 117837, Москва, ул. Профсоюзная, д. 86

Методом проточной цитофлуоромстрии исследовали уровень спонтанного и радиоиндуцитованного апонтоза (PI +Annexm V(FITC)) через 0, 2 , 24 и 48 часов после облучения лимфоцитов in vitro в дозе 1, 2,

3 или 4 Гр. Показано, что уровень спонтанного апонтоза и некрозау больных HXJI не отличается от уровня в контрольной группе. Однако уровень радиоиндуцированного апопгоза (через 24 и 48 часов) у больных НХЛ достоверно выше. При этом группа больных НХЛ, резистентная к химиотерапии, имела показатели апопгоза, не отличающиеся от контроля, a группа с хорошим эффектом (полная или частичная ремиссия) имела повышенный уровень радиоиндуцированного апопгоза.

Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ, проект № 03-01-00503.

Ключевые слова: апоптоз, лимфоцигы, злокачественные неходжкинские лимфомы.

Злокачественные лимфомы занимают одно из ведущих мест в структуре онкологических заболеваний и представляют собой серьезную медицинскую проблему в силу их распространенности и социально-экономического ущерба, обусловленного заболеваемостью и смертностью лиц трудоспособного возраста [1,2].У большинства больных злокачественными неходжкинскими лимфомами лучевая терапия является необходимым компонентом программы лечения [3]. При определении показаний к лучевой терапии и ее параметров учитывается целый ряд прогностических факторов: морфологическая характеристика опухоли, стадия заболевания, эффект предшествующей химиотерапии [4]. Для достижения максимальной эффективности лучевой терапии необходим индивидуальный подбор ее программы. Одним из значимых, но менее изученных факторов, необходимых для подбора условий лучевой терапии, является индивидуальная радиочувствительность [2]. Опубликовано большое количество работ [5,6,7], в которых найдены корреляции между радиочувствительностью клеток и показателями, характеризующими механизмы апоптоза. Наличие таких корреляций свидетельствует, что радиочувствительность нормальных и опухолевых клеток зависит от состояния сигнальной системы клетки, принимающей решения о форме ответа на лучевое повреждение. Комплексное изучение этой системы может привести к разработке новых методов оценки радиочувствительности клеток и к совершенствованию методов лучевой терапии опухолей [8,9].

Целью данной работы было сравнение индивидуальных параметров радиочувствительности периферических лимфоцитов с эффектом лучевой терапии у больных неходжкинскими лимфомами (НХЛ).

Материалы и методы.

Исследовалась периферическая кровь 20 первичных больных НХЛ и 16 онкологических больных с солидными опухолями в анамнезе, находящимися в длительной (более 2 лет) ремиссии (контрольная группа). Возраст пациентов варьировал от 21 до 64 лет (средний возраст 52 года), возраст в контрольной группе - 23-60 лет (в среднем 48 лег). Больные НХЛ на момент взятия крови никакого лечения не получали. В последующем им было проведено лечение, включавшее в себя курсы полихимиотерапии и лучевую терапию.

Из 10 мл крови выделяли фракцию мононуклеарных клеток на градиенте фиколл -урофафин (р = 1,077). Полученные клетки отмывали 2 раза в среде RPM1-1640, а затем ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки, 80 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/л глютамина. Полученная суспензия содержала 5х 10й клеток/мл. Клеточную суспензию распределяли в эппендорфы но 1,2 мл и подвергали воздействию у-излучения б0Со в дозах 1 Гр, 2Гр, ЗГр и 4Гр (мощность дозы - 1,2 Гр/мин). Отрицательным контролем являлся необлученный образец.

Сразу после облучения клетки культивировались в С02 инкубаторе (5% С02) при 37°С . Через 2 часа после облучения, в стерильных условиях отбирали по 400мкл из каждого флакона. 200мкл ( -2,0x105 клеток) из них шли на фиксацию в спирте для дальнейшего определения клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, а 200 мкл (1,7хЮ5 клеток) - для определения апоптоза и некроза клеток с помощью двойной метки Annexin V-FITC - пропидий йодид (Р1). Такой же забор материала проводился через 24 и 48 часов после облучения.

Определение доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК.

Метод основан на регистрации апоптозных тел, содержащих фрагментированную ДНК. Клетки предварительно фиксировали спиртом в соотношении I часть фосфатносолевого буфера (ФСБ) на 3 части 70% спирта. Фиксированные образцы центифугиро-вали при 300g в течение 10 минут. Удалив супернатант, клетки отмывали с 1 мл ФСБ. К осадку добавляли 100 мкл ФСБ и ресуспендировали. Для предотвращения связывания пропидия йодида с РНК исследуемую клеточную суспензию инкубировали с 20 мкл РНКазы А (1 мг/мл, R - 4875, Sigma) при 37°С в течение 30 мин. После окончания инкубации суспензию окрашивали PI в течение 40 мин при комнатной температуре. Анализ осуществлялся на проточном цитофлуориметре DAKO Galaxy, программа Flomax. Количество клеток, перешедших в аиоптоз, оценивали по доле клеток, формирующих гиподи-плоидную область при окрашивании образцов PI (рис.1).

Определение доли клеток, связывающих Annexin V.

200 мкл нефиксированной клеточной суспензии дважды отмывали в ФСБ (1 мл ФСБ, 300g). К полученному осадку клеток добавляли 10 мкл среды RPMI-1640 и 100 мкл связывающего буфера, ресуспендировали. Полученную суспензию инкубировали с 5 мкл Annexin V (PharMingen №65874Х) и 2 мкл PI (2 шМ/1) в темноте при комнатной температуре в течение 40 мин, затем анализировали на проточном цитофлуориметре. Интактны-ми считали клетки отрицательные и по Annexin V, и по пропидию йодиду; клетки, находящиеся в «раннем» аноптозе -положительные по Annexin V и отрицательные по пропидию йодиду; а клетки, находящиеся в «позднем» апоптозе или в некрозе, считали положительными и по Annexin V, и по пропидию йодиду (рис.2).

У всех пациентов перед выделением лимфоцитов проводили клинический анализ крови и методом проточной цитометрии определяли субпопуляционный состав лимфоцитов: долю Т- и В- клеток, Т - хелперных и Т - супрессорных/ цитотоксических лимфоцитов.

рлш-.m*4»:rtw_<aiмитцц-те шжиот-л Ршожтззт

Рис.1. Количество клеток, перешедших в апонтоз при окрашивании образцов Р1, апоптотические клетки формируют гиподиплоидную область

ПИК nw. ПМ1Г.«ЖЧ.'Мк «СЧ-ЛШ

*

S ® > О S £ S •& 5 >0 33 Р я

о < о ^ 5 S я S о Я я

X

5

Рис.2. Точечный график распределения лимфоцитов по интенсивности флуоресценции с AnnexinV (ранний апопт'оз), Annexin V+P1 (поздний апоптоз) и PI (некроз)

Результаты и обсуждение.

Исследование уровня апоптоза.

До недавнего времени различия в радиочувствительности опухолей связывали в основном с двумя факторами: степенью оксигенации клеток опухоли и способностью их к репарации радиационных повреждений. В течение последних 10-15 лет значительно изменился взгляд на природу и механизмы радиационной гибели клеток. Было показано существование в клетке сигнальной системы, выявляющей повреждения ДНК ( ATM, ATR), что приводит к активации гена р53, ответственного за апоптоз, либо останавливает продвижение клеток по циклу для репарации пострадиационных повреждений за счет активации генов INK4a/ARF, CIP/K1P и экспрессии ингибиторов циклиновых киназ (р21, р 16) [5,6,7]. Известно, что у онкологических больных часто обнаруживаются дефекты различных этапов активации апоптоза. Исходя из этих данных, мы предположили наличие изменений в процессе апоптоза у больных НХЛ.

Доля клеток, гибнущих по пути апоптоза в контрольной группе, пропорциональна дозе облучения и времени инкубации (рис. 3). Показатель не зависит от пола, возраста, данных клинического анализа крови и субпопуляционного состава лимфоцитов.

Ой 1(1 2С эс в_3:48

Доав, Гр

Рис.З. Зависимость доли клеток в апоптозе в контрольной группе от дозы облучения и

времени инкубации

Уровень спонтанного апоптоза в контрольных образцах после 2 часов инкубации в среднем составил 6,04% (0,86% - 12,65%), что соответствует литературным данным [9]. В группе больных НХЛ уровень спонтанного апоптоза составил от 1,28% до 22,48%, в среднем 7,79% (различия с контрльной группой недостоверно р>0,05). После 24 часов инкубации различия в уровне спонтанного апоптозау пациентов с НХЛ (15,71%) и в контрольной группе (13,59%) приближались к достоверным (р-0,08).

Уровень спонтанного апоптоза увеличивается пропорционально времени инкубации. Прирост аиоптотических клеток в необлученных образцах возможно объясняется тем, что условия in vitro, хотя и подбираются максимально приближенные к организмешшм, не могут полностью соответствовать таковым.

Уровень радиоиндуцированного апоптоза для группы больных HXJI выше, чем для контрольной группы (рис.4). Так, при дозе облучения ЗГр и времени инкубации 24 часа для здоровых доноров уровень апоптоза составил 17,85±1,53%, а в группе больных НХЛ 27,84+2,17%; достоверность отличий р=0,006. Это может быть связано с нарушениями в системе репарации клетки у больных злокачественными новообразованиями. В группе больных НХЛ был обнаружен значительный разброс уровня апоптоза, который можно объяснить тем, что процесс запуска апоптоза зависит от многих факторов. Поэтому повреждение тех или иных механизмов его запуска может приводить как к снижению толерантности клеток к внешним воздействиям, так и к повышению порога чувствительности.

ж

5

е

СС

?Н

48Н

Нолькые НХЛ

ZH 48Н

Здоровые доноры

GRCY

G_1:0

GREY

G_2.1

GRfcY

GJ3:2

GREY

G_4'3

GREY

G

Рис.4. Зависимость доли аиоптотических клеток от дозы облучения и времени инкубации в контрольной группе и группе больных 11ХЛ

В группе больных НХЛ, так же, как и в контрольной группе, показатели уровня спонтанного и радиоиндуцированного апоптоза не связаны с полом, возрастом, показателями клинического анализа крови.

Исследование уровня некроза.

Уровень некроза в образцах, не подвергшихся воздействию гамма-излучения, после 2 часов инкубации составил 2,30+0,38% для группы больных НХЛ и 1,81±0,83% для контрольной группы, достоверных различий в уровне спонтанного некроза не получено (р=0,759). Уровень клеток, гибнущих некрозом, увеличивается при инкубации. Возрастание доли некротизированных клеток в необлученных образцах, как и возрастание доли апоптотических клеток, возможно, объясняется переменой условий существования, но почему клетки выбирают тот или иной путь гибели остается неясным. Предпологаем, что в клетках, гибнущих некрозом, изначально имелись повреждения, вызванные, например, травматизацией во время центрифугирования, которые прогрессировали в условиях инкубации и способствовали гибели по пути некроза.

Доля некротизированных клеток в группах больных НХЛ и контрольной возрастает пропорционально дозе облучения. Спустя 24 и 48 часов после облучения уровень погибших некрозом клеток в группе больных НХЛ выше, чем в группе здоровых доноров. Средние 'значения уровня некроза составили 10,45±2,86% для здоровых доноров и 17,4±3,54% для группы больных НХЛ для образцов, облученных в дозе ЗГр после 24 ча-

сов инкубации. Но полученные значения отличаются недостоверно (р=0,091) и могут иметь случайный характер.

Исследование доли выживших клеток.

Доля выживших клеток в образцах обеих групп снижается в зависимости от дозы облучения и времени инкубации. Гак, в необлученных образцах при времени инкубации 2 часа средний показатель доли живых клеток для контрольной группы составил 93,3%±4,08% и для группы больных НХЛ 89,45%±4,21%. По прошествии 48 часов после облучения в тех же образцах доля живых клеток составила 66,49%±3,89% и 40,83%±3,01% соответственно. А при дозе облучения ЗГр через 48 часов доля живых клеток составляла 41,56%±3,02% и 15,51%+!,73% для контрольной группы и группы больных НХЛ соответственно. Полученная зависимость выживших клеток от дозы облучения имеет вид экспоненциальной кривой. Причем, зависимость доли выживших клеток для контрольной группы имеет вид более приближенный к экспоненциальной кривой, чем зависимость для больных НХЛ. Этот может быть связано как с нарушениями в системе репарации клетки, так и в системе распознавания повреждений ДНК.

Исследование уровня апоптоза в зависимости от ответа на проводимую терапию.

В зависимости от ответа на комплексную терапию группа больных НХЛ была разделена на две подгруппы: пациенты с хорошим ответом на проводимую терапию (полная или частичная ремиссии) и пациенты, не отвечающие на лечение.

Из двух подгрупп больных НХЛ подгруппа пациентов, хорошо отвечающих на терапию, имеет более высокий уровень спонтанной гибели клеток, основная часть из которых - клетки, гибнущие апоптозом. Среднее значение спонтанного апоптоза для подгруппы с хорошим терапевтическим эффектом составляет 9,66%±2,53% и для подгруппы с плохим терапевтическим эффектом - 6,11%±1,48% (р=0,056). Уровень радиоиндуциро-ваного апоптоза также был выше в подгруппе с хорошим ответом на терапию (33,21%±3,53% и 20,52%±3,41%; р=0,008). Разница в ответе на проводимое лечение и уровень спонтанного и радиоиндуцированного апоптоза в группе больных НХЛ возможно объясняется индивидуальными особенностями в системе распознавания повреждений (система ДНК-протеинкиназ) и/или в системе генов, ответственных за процессы апоптоза (р53, с-шус, Вс1-2, Вах).

Можно предположить, что пациенты с хорошим терапевтическим эффектом имеют дефекты в системе репарации, но у них не изменены гены, контролирующие апоптоз, и система детекции повреждений. Следовательно, при воздействии повреждающими агентами типа химиопрепаратов или гамма-излучения в клетках таких пациентов будут накапливаться повреждения. При исправной работе этих генов и систем распознования повреждений эти поломки будут фиксироваться системой детекции, но т.к. система репарации изменена и не может адекватно исправить повреждения, клетки будут умирать по пути апоптоза.

Низкий уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови в группе больных НХЛ с плохим терапевтическим эффектом возможно объясняется незначительными изменениями в генах, контролирующими апоптоз, или в системе детекции повреждений при характерных для больных злокачественными новообразованиями повреждениях в системе репарации. Так, на мутантных клеточных линиях было показано, что в клетках радио-резистентной линии карциномы человека (11-1810) имеются изменения соотношения экспрессии генов Вс1-2/Вах и уровень пострадиационного апоптоза этой линии ниже, чем для радиочувствительной 11-1285. Возможно, из-за этих изменений в подгруппе пациентов с плохим терапевтическим эффектом при повреждениях клеток в результате проводимой терапии или при воздействии направленного гамма-излучения, уровень апоптоза ниже, чем в группе с хорошим терапевтическим эффектом. Вероятно, повреждения частично не улавливаются системой детекции, либо клетки с неисправленными повреждениями не уходят в апоптоз из-за дефектов в апоптотических генах. Далее эти не элиминированные клетки могут вступать в митоз и давать потомство с закрепленными

генетическими дефектами. Что объясняет как низкий уровень пострадиационного апоп-тоза, так и низкий терапевтический эффект.

То, что у больных НХЛ нарушены системы репарации, подтверждает и тот факт, что их лимфоциты легче вступают в радиоиндуцированный апоптоз, среднее значение доли апоптотических клеток у больных НХЛ и здоровых доноров при дозе облучения ЗГр составляет 27,85%±3,62% и 18,20% ± 2,81%. В двух подгруппах больных НХЛ радиоиндуцированный апоптоз ниже у подгруппы с низким терапевтическим эффектом (рис.5), что свидетельствует о нарушении механизмов элиминации клеток с поврежденной ДНК. Высокий уровень радиоиндуцированного апоптоза у подгруппы с хорошим ответом на терапию можно объяснить лабильностью генома у больных злокачественными новообразованиями и повышенной пролиферацией. Так как в комплексное лечение НХЛ входит лучевая терапия, а апоптотическая гибель облученных лимфоцитов коррелирует с ответом на терапию, по этому показателю возможно определение индивидуальной радиочувствительности и прогнозирование эффекта лучевой терапии.

х

и

S

о

а

1G ZG 3G AG HOUR: Н 2

OG 1G ZG 3G 4G HOUR: H_2A Врсия инкубации, Ч Доза облучения, Гр

DG 1G 3G АС HOUR: Н_4В

-о- LYMPJ G„1:1 •-Q- LYMP 1 G 2:2

Рис.5. Зависимость доли апоптотических клеток от дозы облучения для группы больных НХЛ (1) и контрольной группы (2). Время инкубации 1 график - 2 часа, 2 график - 24 часа, 3 график - 48

часов

Выводы.

1. Различия в уровне спонтанного апоптоза периферических лимфоцитов крови у пациентов с неходжкинскими лимфомами (11,88%) и контрольной группой (12,25%) имеют достоверность р=0,08.

2. Достоверных отличий в уровне спонтанного и радиоиндуцированного некроза между контрольной группой и больными неходжкинскими лимфомами не получено (рЮ,759; р=0,091).

3. Обнаружено, что уровень радиоиндуцированного апоптоза в группе больных неходжкинскими лимфомами выше, чем в группе контрольной группе (р=0,006). Показатели уровня радиоиндуцированного апоптоза и доли выживших клеток у больных неходжкинскими лимфомами коррелируют с ответом больного на проводимую терапию (р=0,008 - для радиоиндуцированного апоптоза; р=--0,003 - для доли живых клеток ). В подгруппе больных с хорошим терапевтическим эффектом (полная или частичная ремиссия) проведенного химиолучевого лечения, уровень апоптоза достоверно выше, чем в подгруппе с плохим терапевтическим эффектом.

4. Установленная зависимость между уровнем радиоиндуцированного апоптоза и ответом на проводимую терапию у пациентов с нехождкинскими лимфомами возможно

позволит использовать данный показатель как фактор прогноза при составлении индивидуальных программ лечения больных неходжкинскими лимфомами.

Литература

1. Беркоу Р. Руководство по медицине. - М. Мир.1997. - т.1.-С.847-851.

2. Wasserman Т.Н., Tubiana М. Lymphoma: radiation therapy in lymphoma treatment.// Int. J. Radiat. Oncol. Biol., Phys. - 1988. - V.14. №2. - P. 187-201.

3. Камаев C.B., Смирнова О С. Роль лучевой терапии в лечении неходжкинских лимфом.//Современные методы диагностики и лечения злокачественных лимфом: Тез. симп.. Псков, 2-3 июня 1992. - СПб. - 1992. -С.64-65.

4. Dumontet С., Bastion G. Prognostic factors, late relapse and outcome of patients with aggressive malignant lymphoma: long term Tesultse of LMH-80 protocol.// Bull Cancer. - 1992,- V.79.№10. - P.979-989.

5. Копнин БП. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцрогенеза.//Биохимия.-2000.- №65(1).- С.5-33.

6. Чумаков ИМ. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью.//Биохимия,- 2000.- №65(1).- С.34-

47.

7. Kastan M.S., Lim Dae.-sik. The many substrates and functions of ATM.//Nature Reviews Molecular Cell Biology.- 2000,- №1. -P.179-186.

8. Miillauer L, Gruber P., Sebinger D. et al.. Mutations in apoptosis genes: a pathogenetic factor for human disease.//Mutation Research.-2001.- V. 488.- P.211-231.

9. Zdzienicka M.Z. Molecular processes and radiosensitivity // Strahlenter Onkol.. - 1997. -V.173.- № 9. - P. 457-461.

10. Mendendelsohn J. et al. The molecular Basis of Canccr. 2lld edition . - 2001. -. P.423-425.

INVESTIGATION OF SHORT-TERM EFFECTS OF Y-IRRADIATION ON PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES OF NON-HODGKIN MALIGNANT LYMPHOMA PATIENTS.

T.M. KULINICH, V.K. BOJENKO, I.E. SERGEEV, V.M. SONIKOV,

E.V. CHMELEVSKIY, A.M. SCHISCHKIN

Russian Scientific Center Roentgenology-Radiology, Moscow, Russia

The level of spontaneous and radio-induced apoptosis within periods of 0, 2, 24 and 48 hours after radiation of lymphocytes in vitro at doses 1, 2, 3 and 4 Gy was studied on the flowcytometer (PI + Annexin V(FITC)). The level of spontaneous apoptosis and necrosis for NHL patients didn't differ from the level of control group. However the level of radio-induced apoptosis ((JiaeyK period of 24 and 48 hours incubation) was higher for NHL patients. The group of NHL patients resistant to chemotherapy had the level of apoptosis which

didn't differ from control one, when the patient's group with partial or full remission demonstrated the higher level of radio-induced apoptosis.

Key words: apoptosis, lymphocyte, Non Hodgkin malignant lymphoma.