CC BY
80
АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ЛИЦ, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
При использовании нейтрального варианта метода ДНК-комет оценивалась эффективность репарации ДНК и регуляции апоптоза в лимфоцитах периферической крови у людей, подвергшихся хроническому облучению, а также способность лимфоцитов этих людей формировать адаптивный ответ. В группе облученных по сравнению с контролем отмечена тенденция к снижению уровней всех параметров комет и частоты апоптоза. Как в контроле, так и в опыте не было отмечено достоверных изменений степени фрагментации ДНК в пробах до облучения клеток в дозе 1 Гр, непосредственно после облучения и два часа спустя. Однако в обеих группах наблюдались отдельные случаи достоверного адаптивного ответа или повышения радиочувствительности в вышеуказанные моменты времени после облучения. Высказано предположение, что в каждом отдельном случае активность защитных систем репарации и регуляции апоптоза различна и зависит от тех или иных индивидуальных особенностей обследованного человека.
В результате загрязнения реки Течи радиоактивными отходами ПО «Маяк» около 30 ООО человек, проживавших в прибрежных селах в 1950-1960 гг., подверглись хроническому радиационному воздействию [1; 2]. Многолетние медицинские и эпидемиологические исследования позволили выявить у этих людей ряд отдаленных последствий облучения, выражающихся в изменении различных гематологических параметров, а также в изменении частоты опухолеобразования [1; 2]. Эти данные особенно актуальны в связи с возросшим в настоящее время интересом к так называемым эффектам малых доз и последствиям хронического низкоинтенсивного воздействия радиации. Открытие таких эффектов малых доз (ЭМД), как адаптивный ответ (АО) и повышение радиочувствительности (ПЧ) после облучения в малых дозах, эффект свидетеля и нестабильность генома, привели к возникновению новых взглядов на формирование отдаленных эффектов малых доз радиации. Предполагается, что наряду с непосредственным повреждением ДНК в результате воздействия излучения на клетку важную роль в реализации последствий облучения и формирований отдаленных эффектов играет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза [3-5]. ™
Одной из важнейших таких систем, участвующих в формировании АО и других о>мд шляется система репарации, и в первую очередь механизмы репарации двунитевых разрывов (ДР) ДНК. Согласно одной из гипотез, именно инициация репарации ДР является ключевым событием в формировании АО [б]. Другая гипотеза решающую Р^ь в формировании АО отводит селективной гибели наиболее радиочувствительных клеток по
механизму апоптоза [7]. ттщ- «петки
Как апоптоз, так и репарация непосредственно опвн с; поврещш
4X0 позволяет использовать для их оценки метод ДНК-ком [, ]. АугоспИОШТООВаНИЯ основании степени фрагментации ДНК оценивалась зффектин! ^ пешфешческ0й кро-
««низмов репарации ДНК и регуляции «ям» опособ^1гЬ лимфоцитов
и У людей, подвергшихся хроническому облучению,
ЭТИх людей формировать АО. 95
Материалы и методика. В ходе эксперимента была обследована группа из 21 человека. Из них 11 составили группу лиц, подвергшихся хроническому облучению, 10 — группу сравнения.
Первая группа была представлена людьми, проживающими в окрестностях реки Течи и имеющими реконструированную дозу облучения красного костного мозга (КЕМ). В состав группы сравнения входили лица, проживающие на близлежащих территориях, не подвергшихся радиоактивному загрязнению и имеющие сходные социальные и медицинские условия с первой группой. Обе группы сопоставимы по национальному составу (преобладало тюркское население) и среднему возрасту (66,4 года—группа облученных и 68,2 года — контрольная группа). Группа облученных состояла из 9 женщин и 2 мужчин, контрольная группа — из 10 женщин. Средняя доза облучения на красный костный мозг для группы облученных людей составляла 1,07 ± 0,22 Гр, при этом минимальная доза— 0,08 Гр, а максимальная — 2,26 Гр.
Используя нейтральный вариант метода ДНК-комет (Comet assay) или гель-электрофореза единичных клеток [8; 9], оценивали степень фрагментации ДНК, а следовательно, и количество двунитевых разрывов ДНК, в лимфоцитах крови.
Критериями оценки состояния ДНК в клетке являлись длина хвоста кометы, доля мигрировавшей ДНК и интегральный показатель — момент хвоста. Анализировалась также частота апоптоза; апоптотическими считались кометы, доля мигрировавшей ДНК в которых превышала 40 %.
Оценивали фоновые уровни данных показателей, уровни в активированных ФГА лимфоцитах непосредственно после облучения клеток in vitro в дозе 1Гр у-излучения (Csl37; мощность дозы — 0,71 Гр/мин), а также спустя 2 и 24 ч после него. В те же интервалы времени анализировали пробы, предварительно, за 4 ч до воздействия дозы в 1 Гр, облученные в дозе 0,05 Гр. Оценивались и исходные уровни фрагментации на первые и вторые сутки инкубации лимфоцитов, а также непосредственно после облучения в дозе
0,05 Гр и спустя 2,4 и 24 ч. Статистическая обработка материала осуществлялась с использованием программы Statistica 6.0, а также пакета статистического анализа MS Excel. Сопоставление средних величин оцениваемых параметров комет производилось по критерию Уилкоксона-Манна. *
Достоверность различий между величинами какого-либо из параметров комет или частотами апоптоза в различные сроки после облучения в дозе 1 Гр в пробах, предварительно облучённых в дозе 0,05 Гр, и пробах, не подвергавшихся такому облучению, служила критерием наличия у человека адаптивного ответа или повышения радиочувствительности. Сопоставление групп по количеству случаев тех или иных типов адаптивных реакций осуществлялось с использованием критерия Пирсона (Хи-квадрат).
Результаты и обсуждение. Было выявлено, что фоновые величины таких параметров, как длина и момент хвоста ДНК-комет, в группе облученных достоверно ниже, чем в контрольной группе. Это хорошо согласуется с достоверно более низкими фоновыми значениями апоптоза у облученных.
Средние значения длины хвоста и момента хвоста спустя 2 ч после облучения в дозе 1 Гр в группе облученных также достоверно ниже аналогичных показателей в контроле. Однако достоверных отличий по частоте апоптоза в тот же период после воздействия дозы 1 Гр не выявлено.
— ' ---Р-1--—^ ^ ХЛ 1А V*
сутки инкубации ни по одному из показателей достоверных отличий между опытом й контролем обнаружено не было.
96
в Группе лиц, подвергшихся Хроническому облучению, уровни показателей непосредственно после облучения лимфоцитов в дозе 1 Гр и через 2 ч после ее воздействия не отличались друг от друга, а также от исходного уровня в первые сутки инкубации клеток. Однако эти уровни достоверно ниже тех, что наблюдаются через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр. Кроме того, исходные уровни мигрировавшей ДНК, величины момента хвоста, частота апоптоза, а также уровни этих показателей, наблюдаемые спустя 2 ч после воздействия, 1 Гр у-излучения были достоверно ниже исходных на вторые сутки инкубации. Частота апоптоза на вторые сутки инкубации также была достоверно выше уровня, наблюдавшегося непосредственно после облучения в дозе 1 Гр. При этом ни для одного из показателей в исходной пробе на вторые сутки не было выявлено достоверных отличий от уровня через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр. По всей видимости, в случае с лимфоцитами, взятыми из периферической крови людей, подвергшихся хроническому облучению, основное влияние на величины оцениваемых показателей комет на вторые сутки инкубации лимфоцитов независимо от наличия или отсутствия за 24 ч до этого острого облучения в дозе 1 Гр оказывают сами условия инкубации.
Подобное влияние инкубации на оцениваемые показатели для клеток, взятых у лиц контрольной группы, имеет менее выраженный характер. Как и в группе облученных лиц, уровни в первые сутки, а также непосредственно после облучения в дозе 1 Гр и спустя 2 ч после этого не имели достоверных отличий, однако в контроле не наблюдалось отличий между показателями в данных пробах и исходными уровнями на вторые сутки инкубации. Такие отличия имели место лишь при сопоставлении с величинами, наблюдавшимися через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр, где все показатели оказались значимо выше, нежели в упомянутых пробах. При этом уровни через сутки после облучения клеток не отличались достоверно от уровней на вторые сутки инкубации.
Оценка параметров комет и частоты апоптоза для клеток, подвергшихся облучению в дозе 0,05 Гр, выявила достоверно более низкие величины длины и момента хвоста по сравнению с контролем непосредственно после облучения, а спустя два часа после воздействия дозы 0,05 Гр достоверно более низкие по сравнению с контролем величины отмечались для всех оцениваемых показателей.
Отличия от контроля наблюдались и после 4 ч инкубации лимфоцитов облученных в дозе 0,05 Гр, и после их повторного облучения в дозе 1 Гр, а также спустя 2 ч после воздействия повторной дозы. Во всех трех случаях у лимфоцитов людей, подвергшихся хроническому облучению, отмечались достоверно меньшие величины длины хвоста комет, а непосредственно после облучения отмечались также достоверно меньший процент мигрировавшей ДНК и более низкая частота апоптоза, нежели в контроле,
в группе лиц, подвергшихся хроническому облучению, было отмечено, что для клеток, предварительно облученных в дозе 0,05 Гр, уровни всех оцениваемых показателей через 24 Ч после облучения в дозе 1 Гр достоверно выше уровней через 4 ч после Облучения в дозе 0,05 Гр, а также уровней непосредственно и через 2 ч после воздействия облучения в дозе 1 Гр. Аналогичная картина наблюдалась и в контрольной группе.
Более высокие уровни по всем показателям по сравнению с уровнтч^ез облучения в дозе 0 05 Гр. а также непосредственно после воздействия уч д
* Гр отмечались и чер^24 ч после облучения в дозе 0,05
ад Гр йс£ш Облучения в дозе 1 Гр. Как
в контроле, так и в опыте показатели комет всех инкубированных лимфоцитов независимо от наличия или отсутствия дополнительного острого облучения с высокой степенью достоверности отличались от фоновых уровней.
Сравнение средних величин оцениваемых показателей в разные сроки после облучения в дозе 1 Гр в Пробах, подвергавшихся предварительному облучению в дозе 0,05 Гр и не подвергавшихся такому воздействию, не выявило достоверных отличий ни в группе облученных лиц, ни в контрольной группе.
Отдельные случаи адаптивного ответа или повышения радиочувствительности по различным критериям в различные сроки после воздействия разрешающей дозы 1 Гр отмечались в обеих группах. Однако ни по одному из критериев не было выявлено достоверных отличий между частотой случаев данных адаптивных реакций в группе лиц, подвергшихся хроническому облучению, и в контрольной группе в рассмотренные промежутки времени после воздействия разрешающей дозы 1 Гр.
Таким образом, результаты данной работы указывают на наличие достоверно более низких фоновых показателей длины хвоста и момента хвоста в группе облученных по сравнению с контролем. Подобные же отличия по частоте апоптоза позволяют предположить, что именно апоптотические клетки оказывают основное влияние на средние величины фонрвых параметров комет.
Тенденция к сохранению более низких уровней оцениваемых показателей в группе облученных отмечалась во всех пробах по всем параметрам комет и частоте апоптоза. Чаще всего достоверные отличия выявлялись по длине хвоста комет.
Вероятно, на анализируемые параметры оказывают влияние и условия инкубации. На вторые сутки все показатели в обеих группах превышают уровни в первые сутки независимо от наличия или отсутствия дополнительного острого облучения. Следует также отметить, что уровни во всех анализируемых пробах значительно выше фоновых. Здесь, по-видимому, имеет место эффект стимуляции инкубируемых лимфоцитов ФГА.
Как в контроле, так и в опыте не было отмечено достоверных изменений степени фрагментации ДНК в пробах до облучения в дозе 1 Гр, непосредственно после и 2 ч спустя. Это говорит либо об отсутствии ДР в ДНК облученных клеток (что идет вразрез с литературными данными [10; 12]), либо о невозможности зафиксировать их вследствие быстрой репарации. Однако репарация данного типа повреждений требует большого количества времени [10—12]. Можно предположить, что в каждом отдельном случае активность защитных систем репарации и регуляции апоптоза различна и зависит от тех или иных индивидуальных особенностей человека. Об этом свидетельствуют наблюдаемые как в контроле, так и в опыте случаи достоверного адаптивного ответа или повышения радиочувствительности в указанные моменты времени после облучения.
Список литературы
1. Аклеев, А. В. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча / А. В. Аклеев, М Ф, Киселев. М. : Медбиоэкстрем, 2001.531 с.
2. Krestinina, L. Yu. Protracted Radiation Exposure and Cancer Mortality in the Techa River Cohort / L. Yu. Krestinina [et al.] // Radiation Research. 2005. Vol. 164. P. 602-611.
3. Пелевина, И. И. Феномен повышения радиочувствительности после облучения лимфоцитов в малых адаптирующих дозах / И. И. Пелевина [и др.] // Радиационная биология, Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 5. С. 544-548.
4. Аклеев, А. В. Адаптивные способности лимфоцитов крови у жителей Южного рала, подвергшихся хроническому облучению / А. В. Аклеев [и др.] // Радиационная
биология. Радиоэкология. 2004, Т. 44, № 4. С. 426-431.
98
5. Серебряный, А. М. О новом механизме формирования адаптивного ответа
/А. М. Серебряный [и др.] // Радиационная биология. Радиоэкология 2004 Т 44 X« 6 С 653-656. ■ > - ■
6. СпитковскиЙ, Д. М. Теоретические и экспериментальные подходы к проблеме индуцируемых адаптирующими дозами ионизирующей радиации изменений функциональных возможностей клеток / Д. М. СпитковскиЙ, И. В. Кузьмина // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5, С. 599-605.
7. Бондарчук, И. А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих /И. А. Бондарчук // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43, № 1. С 19-28.
8. Тронов, В. А. Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Принцип и применение метода / В. А. Тронов, И. И. Пелевина // Цитология. 1996. Т. 38, № 4/5. С. 427-439,
9. Тронов, В. А. ДНК-кометы как маркер клеточной гибели / В. А, Тронов [и др.] //Биофизика. 1999. Т. 44, № 2. С. 288-295.
10. Газиев, А. И. Повреждение ДНК в клетках под действием ионизирующей радиации / А. И. Газиев // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 6. С. 175— 183.
И. Шарова, Н. П. Как клетка восстанавливает повреждённую ДНК? / Н. П. Шарова //Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 3.
12. Пелевина, И. И. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК / И. И. Пелевина [и др.]. М., 1985.
Е. А. Блинова, Г. А. Веремеева
АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙКРОВИ У ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧЁННЫХ ЛЮДЕЙ
На основе анализа литературных данных и результатов собственных исследований рассмотрено влияние хронического облучения человека на апоптоз лимфоцитов периферической крови. Исследованы методом TUNEL с использованием проточной цитофлуориметрии исходный уровень апоптоза и уровень апоптоза после дополнительной нагрузки (инкубация 24 часа, инкубация 24 часа и о лучение в дозе 1 Гр). Отмечено увеличение исходного уровня апоптоза и уровня апоптоза после 24-часовой инкубации в группе лиц, подвергшихся хроническому ра иацион ному воздействию, по сравнению с контролем.
Апоптоз способствует защите организма от пролиферацш клето^ п
Циально опасные для организма генетические изменения [ 3* важным барьерам,
таегся основным событием канцерогенеза, апоптоз можно ошес^ ^ Показано,
поящим на пути канцерогенеза, в частности вероятность развития он-
ч*> хроническое облучение организма человека увеличивает вероятность р
копатологии [2]. ^ спонтанного уровня в изучаемой
Исследование апоптоза предусматривает оценку дополнительных стан-
популяции людей и резервов, которые могут быть выявлены при доп
дартных нагрузках (облучение и производственной деятельности
В районе реки Течи, начиная с 1949 обдуЧения населения в широком
ПО «Маяк» сложились аварийные условия много 99
