CC BY
76
ПРОГРАММНО-АППАРАТНЫЙ КОМПЛЕКС ОЦЕНКИ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ПО МЕТОДУ «КОМЕТ»
Г.М. Попова, Ю.О. Дружинин, В.Н. Степанов, И.Ф. Дятчина1-1 Г.П. Снигирёва, А.Н. Богомазова, Е.И. Новикова, Н.Н. Новицкая2-^Институт проблем управления им. В.А. Трапезников РАН, Москва. gmpopova@ipu.rssi.ru 2)ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Росздрава», Москва.
Описывается компьютерный анализатор изображений «комет», используемый для определения индивидуальной клеточной радиочувствительности in vitro. При помощи щелочной версии метода «комет» оценивался первоначальный уровень повреждений ДНК и кинетика ДНК-репарации в облученных in vitro лейкоцитах 22 больных радиохирургического отделения РНЦРР до проведения лучевой терапии. Также в этой же группе пациентов выполнялся цитогенетический анализ лимфоцитов, облученных in vitro в дозе 2 Гр на стадии G0. В работе оценивали связь между показателями клеточной радиочувствительности и таким острыми побочными реакциями на лучевую терапию, как лучевой энтероколит и цистит.
Индивидуальная радиочувствительность является важным фактором, определяющим возможность возникновения неблагоприятных радиационных эффектов у онкологических больных, проходящих курс лучевой терапии. При лучевой терапии злокачественных новообразований трудно подвести к опухоли дозу, обладающую терапевтическим эффектом, без облучения близлежащих органов и тканей. Поэтому, кроме подавления роста и разрушения опухоли, лучевая терапия вызывает временные, а иногда и стойкие функциональные или органические нарушения в различных органах и тканях. Возникновение и степень этих изменений зависят, как от дозы ионизирующего излучения и используемых методик лучевой терапии, так и от индивидуальной радиочувствительности пациентов. К сожалению, в широкой клинической практике до настоящего времени не используются радиобиологические методы оценки индивидуальной радиочувствительности, позволяющие выделять пациентов с конститутивно высоким риском постлучевых повреждений. Результаты ряда исследований последнего десятилетия позволяют считать, что одним из таких методов может оказаться тест на индивидуальную радиочувствительность лимфоцитов in vitro. В частности, существуют доказательства того, что по чувствительности клеток к облучению in vitro можно судить о возникновении негативных последствий в нормальных тканях пациента при проведении курса лучевой терапии. Иными словами, прогнозирующие методы оценки индивидуальной радиочувствительности могли бы своевременно определить риск осложнений, обеспечить своевременную профилактику и лечение, помочь усовершенствовать индивидуальный курс лечения как для радиочувствительных пациентов, так и для пациентов, проявляющих устойчивость к облучению.
Одним из наиболее перспективных методов оценки клеточной реакции на облучение является метод «комет» (comet assay или single cell gel electrophoresis -SCGE), позволяющий регистрировать радиационные повреждения молекул ДНК.
В данной работе для определения клеточной радиочувствительности in vitro используются такие биологические параметры, как уровень радиационно-индуциро-ванных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови и способность лейкоцитов крови к репарации радиационных повреждений ДНК, оцениваемая при помощи метода «комет».
Исследования изображений «комет» проводились в компьютерном анализаторе микроизображений, представляющем собой программно-аппаратный комплекс, который позволяет вводить изображения в компьютер с медицинских препаратов, установленных на микроскопе с цветной либо чёрно-белой телевизионной камерой. Специализированные программные средства комплекса
ориентированы на автоматизацию процессов анализа изображений микрообъектов. Анализ включает в себя обработку (фильтрацию, сегментацию, выделение внешнего контура микрообъектов и всех внутренних их частей), морфометрию изображений, численные значения параметров которых используются для классификации, дифференцированного счета всех разнотипных микрообъектов, для оценки состояния медицинских препаратов и мн. др. процедур.
Для анализа была разработана специальная программа-анализатор «комет», позволившая наглядно и эффективно определять и выделять неповреждённые и повреждённые ядра кометообразных структур, которые образуют, как бы «голову» (Г) и «хвост» (Х), а также оценивать морфометрические параметры их изображений. Так как «кометы» представляют собой не области одного цвета, а совокупность точек разной яркости, то для их морфометрии были разработаны специальные методы предварительной обработки и сегментации изображений этих объектов.
Для подготовки изображения к сегментации применяется фильтр размытия по Гауссу с большим радиусом. Оптимальный радиус фильтра эмпирически определен как 1/10 радиуса средней «кометы», но в некоторых случаях может потребоваться изменение его значения пользователем. Например, если «кометы» на препарате находятся близко друг к другу, может потребоваться уменьшение радиуса фильтра размытия, чтобы предотвратить слияние отдельных объектов в один.
Так как изображение «кометы» всегда светлее фона, а сам фон занимает наибольшую площадь изображения, то проводится оптимизация гистограммы с условием «Lmin = положение максимума». В результате сильно размытые точки сливаются в объекты с однородной окраской. Поскольку исследовались только черно-белые изображения (grayscale), то была реализована простая сегментация по гистограмме яркости с автоматическим определением порога (но с возможностью его коррекции пользователем).
Для параметризации всех характерных признаков форменных элементов «комет» (Г и Х), были разработаны программы автоматического определения центра головки «комет» и точки определения начала хвоста. Пользователь имеет возможность отредактировать расположения центра головки вручную, если считает, что он определен не точно.
При морфометрическом анализе оценивались такие характеристики «комет», как длина «хвоста» кометы TL (tail length) и количество ДНК в «хвосте», выраженное в процентах TD (Tail DNA). Длина хвоста кометы TL является довольно изменчивой характеристикой, она сильно зависит от методических вариаций и в первую очередь от условий проведения электрофореза. Показатель TD (процент ДНК в хвосте) является более устойчивым параметром и наиболее часто используется в генотоксилогических исследованиях. Показатель TD вычисляется как отношение сумм интенсивностей свечения точек хвоста и головы кометы. Кроме перечисленных показателей (TL и TD), для характеристики комет используют также такие параметры как «хвостовой момент» TM (tail moment), являющийся произведением двух вышеупомянутых величин, и OTM (Olive tail moment - произведение TD и расстояния между центром головы и максимумом свечения хвоста «кометы»). Вычисление этих параметров было положено в основу морфометрического мониторинга, отслеживающего реакцию онкологических больных до и после лучевой терапии. Вывод результатов морфометрии изображений «комет» осуществляется в таблицу Microsoft Excel по технологии OLE.
Программа-анализатор комет была протестирована в эксперименте по изучению зависимости различных параметров комет от дозы облучения. В этом эксперименте было показано, что показатели TD и TL линейно зависят от дозы при
облучении в диапазоне 0^5 Гр. Выявленную в этом эксперименте высокую степень корреляции (r=0,99, p < 10-6) между дозой и количеством ДНК в хвосте «кометы» можно рассматривать как свидетельство того, что программа корректно определяет параметры комет на всем изученном дозовом диапазоне, т.е. при различной степени лучевого повреждения ядерной ДНК.
Результаты обследования показали связь между клиническими осложнениями у онкологических пациентов при терапевтическом облучении, регистрируемыми непосредственно в период проведения лучевой терапии, и некоторыми показателями клеточной радиочувствительности и репарационного процесса, индуцированного в клетках крови облучением in vitro.
В докладе будут представлены результаты, полученные с помощью цитогенетического метода и метода «комет» при обследовании пациентов радиохирургического отделения Российского научного центра рентгенорадиологии, проходивших курс лучевой терапии по поводу рака органов малого таза и рака молочной железы.
THE SOFTWARE-HARDWARE COMPLEX FOR COMET ASSAY ANALYSIS IN THE ESTIMATION OF INDIVIDUAL RADIOSENSITIVITY OF NORMAL TISSUES OF CANCER PATIENTS
G.M.Popova, Yu.O.Druzhinin, V.N.Stepanov, I.F. Dyatchina, 1)1 G.P.Snigiryova, A.N. Bogomazova, E.I.Novikova, N.N. Novitskaya2)
1)1 Institute of Control Sciences RAS, Moscow. 2) Russian Scientific Center of Roentgenology and Radiology, Moscow
The software-hardware system for comet assay analysis used for estimation of cell radiosensitivity of cancerl patients is described. Initial radiation-induced DNA damage and kinetics of DNA repair in leukocytes from 22 patients of radiosurgical department of RNCRR before radiotherapy, was assessed using alkaline comet assay after exposure to 5 Gy of gamma rays in vitro. The cytogenetic analysis for this group of patients was performed in lymphocytes irradiated in vitro at G0 stage with dose 2 Gy The association between parameters of cells radiosensitivity and acute side reactions to radiotherapy (radiation enterocolitis and cystitis) was evaluated.
