CC BY
216
Вестник Челябинского государственного университета. 2015. № 21 (376). Биология. Вып. 3. С. 78-83.
УДК 575:614.8:616.4 ББК 28.04-28.071-51.20
ДВУНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК И РЕПАРАЦИЯ У ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧЁННЫХ НА РЕКЕ ТЕЧА ЛИЦ
1 2 Е. И. Пастухова , В. В. Олейникова
ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет», Челябинск, Россия 2ГБУЗ «Областной перинатальный центр», Челябинск, Россия
Исследовалось влияние хронического облучения на возникновение двунитевых разрывов ДНК и эффективность репарации в лимфоцитах периферической крови человека. Было обследовано 20 человек, подвергшихся действию хронического облучения в 1950-1960 гг. в результате загрязнения радиоактивными отходами ПО «Маяк» бассейна р. Теча (средняя доза на ККМ 0,68±0,32 Гр), и 10 человек группы сравнения, проживавших на незагрязнённых территориях. Оценка частоты двунитевых разрывов и эффективности репарации ДНК проводилась с использованием метода ДНК-комет по показателю доли ДНК в хвосте кометы на исходном уровне, сразу после дополнительного облучения лимфоцитов в дозе 10 Гр и через 1, 2 и 4 ч после облучения. Отмечено достоверное снижение частоты двунитевых разрывов сразу после дополнительного облучения в дозе 10 Гр у облучённых лиц по сравнению с группой контроля. Не отмечено достоверных отличий в репарации ДНК лимфоцитов периферической крови облучённых лиц по сравнению с группой контроля. Показатели фрагментации ДНК в лимфоцитах периферической крови обследованных лиц не демонстрируют влияние возраста на количество двунитевых разрывов.
Ключевые слова: двойные разрывы ДНК, репарация ДНК, метод ДНК-комет, хроническое ионизирующее излучение, река Теча, лимфоциты периферической крови.
Введение. Метод ДНК-комет (DNA-comet assay) был предложен Ostling и Johansson в 1984 г. [6]. Данный метод является быстрым и весьма чувствительным методом регистрации повреждений ДНК и изучения репарации ДНК на уровне одиночных клеток [2]. Данное обстоятельство по -вышает чувствительность метода и обусловливает значительный круг областей его применения.
Прежде всего по степени фрагментации можно определить уровень возникновения разрывов ДНК: двунитевых разрывов (ДР) при использовании нейтрального варианта метода (pH 7-8) и однонитевых при использовании щелочного (при pH 12,1-12,4).
Метод ДНК-комет нашёл значительное применение в радиобиологии как способ оценки ради-ационно-индуцированных повреждений в ДНК, а также репарации данных повреждений [5].
Цель работы: исследовать влияние хронического облучения на возникновение двунитевых разрывов ДНК и эффективность репарации в лимфоцитах периферической крови хронически облучённых на р. Теча лиц.
Задачи исследования:
1. Сравнить показатели фрагментации ДНК лимфоцитов периферической крови лиц, подвергшихся хроническому облучению, и у необлучён-
ных лиц, непосредственно после выделения клеток (исходный уровень), а также через 15 мин, 1, 2 и 4 ч после дополнительного облучения in vitro в дозе 10 Гр.
2. Оценить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови у лиц, подвергшихся хроническому облучению, и у необлучённых лиц через 1, 2 и 4 ч после дополнительного облучения in vitro в дозе 10 Гр.
3. Оценить влияние фактора возраста на фрагментацию ДНК лимфоцитов.
Материалы и методы. В ходе работы было обследовано 30 чел.: 20 чел. основной группы и 10 чел. группы сравнения. Группы были сформированы по принципу случайной выборки. Кровь на исследования забиралась по стандартной методике из локтевой вены в период 2010-2012 гг. В основную группу вошли люди, подвергшиеся действию хронического облучения в 19501960 гг. в результате загрязнения радиоактивными отходами ПО «Маяк» бассейна р. Течи. Средняя доза на ККМ составила 0,68±0,32 Гр. В группу сравнения вошли люди, проживающие на близлежащих территориях, не подвергшиеся радиоактивному загрязнению и имеющие сходные социальные и медицинские характеристики. В обоих случаях обследовались люди, не име-
ющие тяжёлых соматических заболеваний, таких как злокачественные новообразования, сахарный диабет, туберкулёз. Группы сопоставимы по полу, возрасту и национальному составу, о чём свидетельствуют данные, представленные в таблице.
Оценка частоты ДР и эффективности репарации ДНК проводилась с использованием метода ДНК-комет на основе методики разработанной в клинико-физиологической, лаборатории Уральского научно-практического центра радиационной медицины.
Кровь для исследования забиралась у доноров утром натощак из локтевой вены в стерильный шприц с гепарином. Производили выделение лимфоцитов периферической крови путём центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин (р = 1,077) с последующей отмывкой фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Из выделенных лимфоцитов периферической крови готовили клеточную суспензию со средой RPMI и сывороткой крупного рогатого скота. 200 мкл клеточной суспензии использовали для определения исходного уровня ДР ДНК, 1, 2 мл — для облучения в дозе 10 Гр. Облучение проб проводилось на установке ИГУР-1 гамма-излучением мощностью 0,7 Гр/мин.
Для изучения репарации ДНК приготовление слайдов производилось непосредственно после облучения проб (точка 15 мин), а также через 1, 2 и 4 ч после облучения проб.
Приготовление слайдов с агарозным гелем. Клеточную суспензию смешивали с 1 %-м раствором легкоплавкой агарозы в ФСБ при температуре 37 °С в соотношении 1:1 и распределяли на предметные стёкла, предварительно покрытые 1 %-м раствором агарозы универсальной. Накрывали покровным стеклом и помещали в холодильник на 3-5 мин. По истечении времени покровное стекло снимали и слайды помещали в лизирующий раствор (2,5 М NaCl; 100 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl; 1 % Triton Х-100; 10 % DMSO; pH = 10) на 1 ч.
Процедура электрофореза в постоянном электрическом поле. Слайды извлекали из ли-зирующего раствора и ополаскивали 3 раза по 5 мин нейтральным буфером (90 mM TRIS; 90 mM борная кислота; EDTA). Затем слайды помещали в камеру для электрофореза, заполненную нейтральным буфером. Проводили электрофорез в течение 10 мин при напряжённости электрического поля 1-0,9 В/см. После электрофореза слайды извлекали из камеры и помещали в 90 %-й раствор этилового спирта, затем сушили на фильтровальной бумаге.
Определение степени фрагментации ДНК. Высушенные препараты окрашивали акридиновым оранжевым (рабочая концентрация 15 мг/ мл). Визуализацию ДНК-комет проводили на микроскопе Axioscope с фильтрами возбуждающим 515-560 нм и торможения 590 нм. На каждом пре -парате регистрировали не менее 50 комет и фотографировали с использованием видеосистемы на основе цифровой камеры. Полученные изображения анализировали при помощи программного обеспечения Comet Imager 2.2 (Меtasystems, Германия). Оценивались параметры: доля мигрировавшей ДНК (плотность хвоста), длина хво -ста и интегральный показатель — момент хвоста. При дальнейшем анализе выяснилось, что результаты по трём исследованным параметрам демонстрируют идентичные тенденции. По рекомендации Международного семинара по процедурам генотоксических тестов в Сан-Франциско (2005), где доля (в %) ДНК в хвосте была сочтена наиболее подходящим показателем для анализа данных о количестве разрывов ДНК [3], были использованы данные только по доле мигрировавшей ДНК (плотности хвоста).
Методы статистической обработки данных. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с использованием пакета статистического анализа SigmaPlot 11.0.
При анализе результатов вычисляли для каждого человека среднее значение доли (в %) мигрировавшей ДНК для каждой точки исследо-
Половой, возрастной и национальный состав исследованных групп
Группа наблюдения Национальность Половой состав Средний возраст, лет (min-max)
Тюркиты Славяне Женщины Мужчины
Чел. % Чел. % Чел. % Чел %
Основная группа, N = 20 Группа сравнения, N = 10 14 7 70 70 6 3 30 30 9 6 45 60 11 4 55 40 65,6 (59-75) 64,0 (57-73)
вания, и в дальнейшем проводился анализ этих средних.
Анализ при помощи теста Колмогорова — Смирнова показал, что значения доли мигрировавшей ДНК соответствуют нормальному распределению в исходном состоянии (Р = 0,114) и не соответствуют нормальному распределению через 15 мин (Р < 0,001), через 1 ч (Р < 0,001), 2 ч (Р < 0,001) и 4 ч (Р = 0,013) после дополнительного облучения в дозе 10 Гр. Отклонение распределения плотности хвоста от нормального распределения является достаточно типичным для метода комет [4]. Относительные значения доли мигрировавшей ДНК через 1, 2 и 4 ч по сравнению с 15 мин подлежат нормальному распределению через 1 ч (Р = 0,462) и не соответствуют нормальному распределению через 2 ч (Р = 0,012) и через 4 ч (Р = 0,002) после дополнительного облучения в дозе 10 Гр.
Для данных характерна асимметрия, поэтому данные представлялись не в виде среднего, а в виде медианы. Так как в большинстве случаев распределение не соответствовало нормальному, для сравнения групп был применён непараметрический ^-критерий Манна — Уитни.
Результаты и обсуждение. На рис. 1 представлены значения доли мигрировавшей ДНК лимфо -цитов периферической крови у обследованных лиц основной и контрольной групп.
Плотность хвоста кометы была статистически достоверно выше в группе сравнения, чем в группе облучённых лиц через 15 мин (Р = 0,005), 1 ч (Р = 0,015) и 2 ч (Р = 0,033) после дополнительного облучения в дозе 10 Гр. Для исходного уровня и точки 4 ч после облучения значения данного показателя в контроле также превышают значения у облучённых лиц, но различия статистически не значимы (Р > 0,05).
Результаты данного исследования совпадают с результатами работы [1], в которой исследовали репарацию повреждений ДНК и апоптоз лимфоцитов периферической крови у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на ККМ в диапазоне доз от 0,21-1,42 Гр на р. Тече. При анализе степени фрагментации ДНК было показано, что исходное количество ДР, а также уровни данного показателя после первых суток инкубации лимфоцитов у подвергшихся хроническому облучению людей достоверно снижены по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе, также это было отмечено и для частоты апоптоза лимфоцитов.
Возможно, воздействие внешнего и внутреннего облучения имеет преадаптирующий эффект на лимфоциты периферической крови даже в отдалённые сроки после радиационного воздействия.
25 -
20 -
15 -
10 -
*Р = 0,005
*Р = 0,033
*Р = 0,015
1
I
111
Исходный 15 мин уровень
1 ч
2 ч
4 ч
Н Основная группа О Группа сравнения
Рис. 1. Доля мигрировавшей ДНК лимфоцитов периферической крови облучённых и необлучённых лиц, %о
Для оценки эффективности репарации уровень повреждений ДНК в лимфоцитах через 15 мин после облучения считали за 100 %, значения показателя, соответствующие 1, 2 и 4 ч после облучения в дозе 10 Гр, рассматривали как доли оставшихся повреждений. Эффективность репарации оценивали исходя из изменений исследуемых по -казателей (рис. 2).
Статистически значимых различий между исследуемыми показателями в группах облучённых лиц и контроля выявлено не было. В работе [1] также не было выявлено отличий по эффективности процессов репарации ДР облучённых лиц от контроля.
Большой интерес представляют данные о накоплении повреждений ДНК и изменении эф-
фективности процессов репарации с возрастом. Метод ДНК-комет может быть использован для оценки возрастных отличий в уровне повреждения ДНК клеток организма [7; 8]. Ряд теорий старения предполагает нарастание повреждений ДНК с возрастом за счёт накопления мутаций, действия свободных радикалов и нарушения в системах восстановления клетки.
Для определения влияния возраста на количество ДР ДНК лимфоцитов периферической крови обследованные люди — и подвергшиеся хроническому облучению, и необлучённые — были разделены на две возрастные группы: 1) младше 65 лет (средний возраст 61,06 года, N = 18), 2) 65 и старше лет (средний возраст 70,17 года, N = 12). На рис. 3 представлены полученные значения
180 160140120 1008060 4020-
1 ч
Основная группа
2 ч 4 ч
I I Группа сравнения
Рис. 2. Изменение показателя доли мигрировавшей ДНК лимфоцитов периферической крови обследованных лиц после дополнительного облучения, %
20 -,
15
10
0
т у у у Т -
№ и 1 1II иг
Исходный 15 мин уровень
1
2 ч
4
I Лица моложе 65 лет Лица 65 лет и старше Рис. 3. Доля мигрировавшей ДНК лимфоцитов крови у лиц разного возраста, %
О
ч
плотности хвоста комет лимфоцитов периферической крови исследуемых лиц указанных возрастных групп. Хотя показатели доли мигрировавшей ДНК в группе лиц старше 65 лет в среднем выше, чем в группе более молодых лиц, статистически значимых различий между группами выявлено не было.
Выводы:
1. Отмечено достоверное снижение доли мигрировавшей ДНК лимфоцитов периферической
крови через 15 мин, 1 и 2 ч после дополнительного облучения в дозе 10 Гр у облучённых лиц по сравнению с группой контроля.
2. Не отмечено достоверных отличий в репарации ДНК лимфоцитов периферической крови облучённых лиц по сравнению с группой контроля.
3. Показатели фрагментации ДНК в лимфоцитах периферической крови обследованных лиц не демонстрируют влияние возраста на количество двунитевых разрывов.
Список литературы
1. Пушкарёв, С. А. Роль репарации повреждений ДНК и апоптоза в формировании адаптивного ответа у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию : автореф. дис. ... канд. биол. наук / С. А. Пушкарёв. - М., 2008. - 22 с.
2. Сорочинская, У. Б. Применение метода ДНК-комет для оценки повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды / У. Б. Сорочинская, В. М. Михайленко // Онкология. - 2008. -Т. 10, № 3. - С. 303-309.
3. Burlinson, B. Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo comet assay workgroup / B. Burlinson [et al.] // Mutation Research. - 2006. - Vol. 627. - P. 31-35.
4. Duez, P. Statistics of the Comet assay: a key to discriminate between genotoxic effects / P. Duez [et al.] // Mutagenesis. - 2003. - Vol. 18, № 2. - P. 159-166.
5. Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology / P. L. Olive // Mutation Research. - 2009. -Vol. 681. - P. 13-23.
6. Ostling, O. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells / O. Ostling, K. J. Johanson // Biochemical аnd Biophysical Research Communications. - 1984. - Vol. 123, № 1. - P. 291-298.
7. Sauvaigo, S. DNA repair capacities of cutaneous fibroblasts: effect of sun exposure, age and smoking on response to an acute oxidative stress / S. Sauvaigo [et al.] // British J. of Dermatology. - 2007. - Vol. 157, № 1. -P. 26-32.
8. Singh, N. P. Basal DNA damage in individual human lymphocytes with age / N. P. Singh [et al.] // Mutation Research. - 1991. - Vol. 256. - P. 1-6.
Сведения об авторах
Пастухова Елена Игоревна — кандидат биологических наук, доцент кафедры радиационной биологии Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. pastuel@yandex.ru
Олейникова Виктория Витальевна — биолог Областного перинатального центра, Челябинск, Россия. viol2292@mail.ru
Bulletin of Chelyabinsk State University. 2015. No. 21 (376). Biology. Issue 3. Pp. 78-83.
DNA DOUBLE-STRAND BREAKS AND REPAIR IN PEOPLE CHRONICALLY EXPOSED AT TECHA RIVER
Е. I. Pastukhova
Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. pastuel@yandex.ru
V. V. Oleynikova
Regional Perinatal Centre, Chelyabinsk Russia. viol2292@mail.ru
The influence of chronic exposure on the occurrence of DNA double-strand breaks and reparation efficiency was studied in human peripheral blood lymphocytes. The examined group consisted of 20 people exposed
to the chronic exposure in 1950-1960 as a result of contamination Techa river basin with radioactive waste of "Mayak" working facility (average dose to the red bone marrow was 0,68 ± 0,32 Gy), and 10 people of the comparison group living in noncontaminated areas. The assessment of DNA double strand breaks frequency and reparation efficiency was carried out using the DNA-comet assay through the analysis of the DNA percent in the tail of the comet on the base level, immediately after the additional exposure of lymphocytes in a dose of 10 Gy and after 1, 2 and 4 hours after exposure. There was a significant decrease in the frequency of doublestrand breaks immediately after the additional exposure in a dose of 10 Gy in exposed individuals compared with the control group. There were no significant differences in DNA reparation in peripheral blood lymphocytes of exposed individuals compared with the control group. Levels of DNA fragmentation in the peripheral blood lymphocytes do not show the effect of age on the frequency of double-strand breaks.
Keywords: DNA double-strand breaks, DNA repair, DNA-comet assay, chronic ionizing radiation, Techa river, peripheral blood lymphocytes.
References
1. Pushkaryev S.A. Rol' reparacii povrezhdeniy DNK i apoptoza v formirovanii adaptivnogo otveta u lits, podvergshihsya khronicheskomu radiatsionnomu vozdeystviyu [The role of reparation of DNA damage and apoptosis in adaptive response in persons exposed to chronic radiation. Abstract of thesis]. Moscow, 2008. (In Russ.).
2. Sorochinskaya U.B., Mikhaylenko V.M. Primeneniye metoda DNK-komet dlya otsenki povrezhdeniy DNK, vyzvannykh razlichnymi agentami okruzhayushhey sredy [Application of the comet assay for the DNA damage assessment caused by different environmental agents]. Onkologiya [Oncology], 2008, no. 10 (3), pp. 303-309. (In Russ.).
3. Burlinson B. et al. Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo comet assay workgroup. Mutation Research, 2006, vol. 627, pp. 31-35.
4. Duez P. et al. Statistics of the Comet assay: a key to discriminate between genotoxic effects. Mutagenesis, 2003, vol. 18, no. 2, pp. 159-166.
5. Olive P.L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutation Research, 2009, vol. 681, pp. 13-23.
6. Ostling O., Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1984, vol. 123, no. 1, pp. 291-298.
7. Sauvaigo S. et al. DNA repair capacities of cutaneous fibroblasts: effect of sun exposure, age and smoking on response to an acute oxidative stress. British Journal of Dermatology, 2007, vol. 157, no. 1, pp. 26-32.
8. Singh N.P. et al. Basal DNA damage in individual human lymphocytes with age. Mutation Research, 1991, vol. 256, pp. 1-6.
