CC BY
12
УДК 577.128 + 579.222.3 DOI: 10.24412/2071-6176-2021-2-22-28
ВЛИЯНИЕ НОКАУТА ГЕНА VTC4 НА НЕОРГАНИЧЕСКИЕ
ПОЛИФОСФАТЫ МИТОХОНДРИЙ SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
А.А. Томашевский
Изучено значение Vtc4 для синтеза полифосфатов митохондрий. Показано, что полифосфаты митохондрий важны для перехода метаболизма дрожжей с гликолиза на окислительное фосфорилирование.
Ключевые слова: VTC4, неорганические полифосфаты, митохондрии, Saccha-romyces cerevisiae.
Неорганические полифосфаты (полиР) - линейные полимеры, содержащие от нескольких до нескольких сотен ортофосфатных остатков и выполняющие в клетке многочисленные функции, включая резервирование фосфата и энергии, связывание катионов, образование мембранных каналов, участие в формировании и функционировании клеточной оболочки, регуляцию экспрессии генов и активности ферментов и приспособление к стрессовым условиям [1-4]. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются удобной моделью для исследования метаболизма этих биологически активных полианионов. Основным ферментом, обладающим полифосфатсинтетазной активностью является Vte4, транспортный шаперон вакуолярной АТФазы, синтезирующий полиР c использованием энергии АТФ [5] и нуждающийся в электрохимическом потенциале на вакуолярной мембране [6]. У штамма-нокаута по гену VTC4 [7] так же как и у мутантов по генам, кодирующим субъединицы вакуолярной АТФазы, имеющих резко сниженный электрохимический потенциал на вакуолярной мембране [8], уровень полиР в клетках дрожжей в несколько раз меньше, чем у штаммов дикого типа. Сохранение небольшого количества полиР в клетках таких штаммов позволяет предполагать существование альтернативных путей синтеза полиР [1]. Хорошо известно, что у Avtc4 штаммов полифосфаты в вакуолях полностью отсутствуют [6]. Поэтому возникает вопрос о локализации этих минорных фракций полифосфатов. Одним из предполагаемых компартментов, в которых могли бы работать альтернативные пути биосинтеза полиР, являются митохондрии. Получены доказательства в пользу того, что в митохондриях млекопитающих синтез полиР осуществляет F0F1-АТФаза [9]
Целью данной работы было выявить влияние нокаут-мутации по VTC4 на полифосфаты митохондрий и их значение для роста дрожжей на этаноле.
Материалы и методы
Микроорганизмы. В работе был использован родительский штамм YSC-1048 (WT) и мутантный штамм VTC4-6780 с нокаутом гена VTC4 (Avtc4), полученные из коммерческой коллекции Dharmacon.
Условия культивирования. Культуры дрожжей поддерживали на агаризованной среде YPD (2% агара), содержащей 1 % дрожжевого экстракта, 2 % пептона и 2 % глюкозы. Для работы клетки выращивали на жидкой среде YPD, содержащей 2%-ную глюкозу либо 1 %-ный этанол в качестве источника энергии. Для снятия кривых роста клетки растили до стационарной стадии и пересевали на новую среду с высокой плотностью культуры.
Выделение митохондрии. Производили методом дифференциального центрифугирования [10].
Определение полифосфатов. Во льду к суспензии митохондрий добавляли 1 мл 1 М HClO4 , инкубировали 15 минут при перемешивании, осаждали центрифугированием 10000 g 10 минут. В супернатанте измеряли орфтофосфат и лабильный фосфор (после обрабоки 1 М HCl при 100 оС в течении 10 минут) с использование молибдата аммония [11]. К осадку добавляли 800 мкл 0,5 М HClO4 и инкубировали при перемешивании 25 минут при 100 оС. Осаждали в том же режиме. В супернатанте измеряли фосфор. Полифосфаты определяли по разности лабильного фосфора и ортофосфата.
Определение белка. Производили по методу Брэдфорда, используя реагент Coomassie Plus (Pierce) согласно протоколу производителя. В качестве стандарта использовали БСА.
Определение ферментативных активностей. АТФазную активность определяли по скорости высвобождения Pi при 30 °C в течение 30 мин в 1 мл реакционной смеси, содержащей 1 мМ MgSO4 и 1 мМ АТФ в 50 мМ Tris-HCl с pH 8,5, 7,2 и 6,5. Pi измеряли как описано выше.
Результаты и их обсуждение
Для выделения митохондрий клетки дрожжей выращивали до стационарной стадии роста на среде с глюкозой, поскольку в условиях катаболитной репрессии митохондрии содержат существенное количество полиР [12]. В препаратах митохондрий была измерена АТФазная активность в присутствии и отсутствии азида натрия (ингибитор митохондриальной АТФазы) ортованадата натрия (ингибитор АТФазы плазматической мембраны) и нитрата калия (ингибитор вакуолярной АТФазы). Данные представлены в табл. 1. Степень ингибирования говорит о достаточной чистоте препарата. Из препарата была проведена экстракция и измерение содержания ортофосфата и полифосфатов, данные представлены в табл. 2. Как видно из табл. 2, в митохондриях мутантного штамма крайне мало полиР. Следует отметить, что активность
митохондриальной АТФазы у мутантного штамма снижена всего лишь на 25 %. Следовательно, почти полное отсутствие полиР в данном случае не связано с АТФазой митохондрий. Можно сделать вывод, что полиР митохондрий синтезируются У^с4. Наиболее вероятным является их синтез УТС комплексом эндоплазматического ретикулюма [6] и доставка в митохондрии посредством везикулярного траффика что позволяет предположить, что полифосфаты митохондрий в дрожжах синтезируются не в самих митохондриях, а и доставляются в митохондрии везикулярным трафиком. Хорошо известно, что, например, значительная часть митоходриальных белков кодируется в ядре и попадает в митохондрии именно посредством транспорта с помощью везикул.
Таблица 1
А ТФазные активности в препарате митохондрий
Штамм ^-чувствительная АТФазная активность, Е / мг белка Ингибирование в %
N3 У04 N03
WT 1,12 74 34 15
Шс4 0,85 80 37 23
Таблица 2
Полифосфаты митохондрий. Мкмоль Pi/ мг белка_
Штамм Ортофосфат Кислотораст-воримые полиР Кислотонераст-воримые полиР Суммарное содержание полиР
ШТ 1,8 1,7 1,4 3,1
Шс4 0 0 0,18 0,18
Итак, штамм /\vtc4 является удобным инструментом для оценки влияния отсутствия полиР в митохондриях на особенности, физиологии дрожжей. При культивировании на глюкозе разницы в кривых роста не обнаружено. Для оценки влияния полиР на функционирование митохондрий были сняты кривые роста родительского и мутантного штаммов на среде с этанолом в качестве источника энергии (рис. 1). Как видно из рисунка мутантный штамм успешно растёт на среде с этанолом, что свидетельствует о нормальном функционировании его митохондрий. Однако скорость роста и оптическая плотность на стационарной стадии
несколько снижена. Механизм этого снижения пока неясен, но одной из причин могут быть неизвестные на данный момент регуляторные функции полиР.
Рис. 1. Кривые роста на среде с этанолом: 1 - родительский штамм,
2 - мутантный штамм
Известно, что при росте на этаноле или лактате уровень полиР в митохонриях очень низкий [12]. Очевидно, что полиР для окислительного фосфорилирования у дрожжей не являются необходимыми. Представляет интерес вопрос. Не являются ли полиР фактором, важным для перехода дрожжей от гликолиза к окислительному фосфорилированию. Чтобы оценить значение полифосфатов митохондрий для адаптации дрожжей к потреблению этанола были построены кривые роста после пересева на новую среду в четырёх моделях (рис.2). Как видно из рис. 2, при переходе с глюкозы на этанол, и соответственно с гликолиза на окислительное фосфорилирование, у мутанта наблюдается задержка возобновления роста по сравнению с WT штаммом.
Данное наблюдение позволяет предположить, что полиР митохондрий являются значимым фактором для уменьшения длительности лаг-фазы при переключении метаболизма с гликолиза на окислительное фосфорилирование.
Таким образом можно заключить, что полиР митохондрий дрожжей синтезируется а отсутствие этих полиР приводит к ухудшению роста на этаноле.
о L--1-j-'-!-1-'-'-1-1 О -1-1-1-1-'-'-1-1-1
0123456789 0123456789
Время, ч Время, ч
Рис. 2. Кривые роста после пересева на новую среду: 1 - родительский штамм; 2 - мутантный штамм: А - со среды с глюкозой на среду с этанолом; Б - со среды с глюкозой на новую среду с глюкозой; В - со среды с этанолом на новую среду с этанолом, со среды этанолом на среду с глюкозой
Список литературы
1. Kulaev I.S., Vagabov V.M., Kulakovskaya T.V. The biochemistry of inorganic polyphosphates. Chichester: Wiley, 2004.
2. Rao N.N., Gómez-García M.R., Kornberg A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival // Ann. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78. P.605-647.
3. Denoncourt A., Downey M., Model systems for studying polyphosphate biology: a focus on microorganisms // Curr. Genet. 2021. Vol. 67(3). P. 331-346.
4. Orell A., Navarro C.A., Rivero M., Aguilar J.S., Jerez C.A. Inorganic polyphosphates in extremophiles and their possible functions // Extremophiles. 2012. Vol. 16. P. 573-583.
5. Hothorn M., Neumann H., Lenherr E.D., Wehner M., Rybin V., Hassa P.O., Uttenweiler A., Reinhardt M., Schmidt A., Seiler J., Ladurner A.G., Herrmann C., Scheffzek K., Mayer A. Catalytic core of a membrane-associated eucaryotic polyphosphate polymerase // Science. 2009. Vol. 324. P. 513-516.
6. Gerasimaitè R., Sharma S., Desfougères Y., Schmidt A., Mayer A. Coupled Synthesis and Translocation Restrains Polyphosphate to Acidocalcisome-like Vacuoles and Prevents Its Toxicity // J. Cell Sci. 2014. Vol. 127 (23). P. 5093-5104.
7. Tomashevsky A., Kulakovskaya E., Trilisenko L., Kulakovskiy I.V., Kulakovskaya T., Fedorov A., Eldarov M. VTC4 Polyphosphate Polymerase Knockout Increases Stress Resistance of Saccharomyces cerevisiae Cells // Biology. 2021. Vol. 10. P. 487.
8. Tomaschevsky A.A., Ryasanova L.P., Kulakovskaya T.V., Kulaev I.S. Inorganic polyphosphate in the yeast Saccharomyces cerevisiae with a mutation disturbing the function of vacuolar ATPase // Biochem. Mosc. 2010. Vol. 75. P. 1052-1054.
9. Baev A.Y., Angelova P.R., Abramov A.Y. Inorganic polyphosphate is produced and hydrolyzed in F0F1-ATP synthase of mammalian mitochondria // Biochem J. 2020. Vol. 477(8). P. 1515-1524.
10. Lichko L., Kulakovskaya T., Pestov N., Kulaev I. Inorganic Polyphosphates and Exopolyphosphatases in Cell Compartments of the Yeast Saccharomyces cerevisiae under Inactivation of PPX1 and PPN1 genes // Biosci. Rep. 2006. Vol. 26. P. 45-54.
11. Kulakovskaya T.V., Andreeva N.A., Karpov A.V., Sidorov I.A. Kulaev I.S. Hydrolysis of Tripolyphosphate by Purified Exopolyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae Cytosol: Kinetic Model // Biochemistry (Moscow). 1999. Vol. 64. P. 1180-1184.
12. Pestov N.A., Kulakovskaya T.V., Kulaev I.S. Inorganic polyphosphate in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae at phosphate limitation and phosphate excess // FEMS Yeast Res. 2004. Vol. 4(6). P. 643648.
Томашевский Александр Андреевич, канд. биол. наук, научный сотрудник, tomashevskialexandr25@smail.com, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина ФИЦ ПНЦБИ РАН
EFFECT OF VTC4 GENE KNOCKOUT ON INORGANIC POLYPHOSPHATES OF MITOCHONDRIA OF SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
A.A. Tomashevski
The role of yeast VTC4 polyphosphate polymerase was studied in case of production of inorganic polyphosphates of mitochondria. The work revealed that mitochondrian polyphosphates are important for metabolic shift from glicolysis to OXPHOS.
Key words: VTC4, inorganic polyphosphates, mitochondria, Saccharomyces cere-
visiae.
Tomashevski Alexandr Andreevich, candidate of biological sciences, stuff scientist, tomasSheVsSkialexandr25@gmail.com, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, FRC Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences
