CC BY
17
УДК 579.222.4+577.118
РОЛЬ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПОЛИФОСФАТОВ В АДАПТАЦИИ ДРОЖЖЕЙ К ПЕРЕКИСНОМУ СТРЕССУ
Л.В. Трилисенко, Т.В. Кулаковская
Воздействие перекиси водорода на клетки дрожжей приводит к снижению уровня неорганических полифосфатов как в случае культивирования в присутствии этого вещества, так и в случае кратковременного воздействия в неростовых условиях. В неростовых условиях это снижение зависело от количества АТФ в клетках. Предполагается, что неорганические полифосфаты используются в условиях перекисного стресса в качестве источника энергии для адаптации.
Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae, полифосфатаза Pрх1, перекись водорода, неорганические полифосфаты, АТФ.
Неорганические полифосфаты (полиР), линейные полимеры ортофосфорной кислоты, являются универсальными регуляторами множества клеточных процессов, в том числе участниками стрессовой адаптации у микроорганизмов [1]. ПолиР участвуют в адаптационном ответе на стресс, вызванный токсическим воздействием на клетки дрожжей ионов кадмия и марганца, в первую очередь за счет образования комплексов с этими тяжелыми металлами. Это приводит к увеличению содержания полиР в клетках [2, 3]. Существенна также роль полиР в преодолении окислительного стресса. В частности, штаммы бактерий, мутантные по гену полифосфаткиназы и имеющие сниженное количество полиР в клетках, характеризуются уменьшением устойчивости к окислительному стрессу [4].
В условиях пероксидного стресса на среде с низкой концентрацией глюкозы у гриба Purpureocillium lilacinum происходило снижение содержания полиР [5]. Известно, что полиР в условиях окислительного стресса выполняют функцию шаперонов, предотвращая денатурацию некоторых белков у бактерий [6]. Дрожжи имеют значительный пул полиР [1], однако данные о роли этих полимеров в адаптации к стрессовым воздействиям остаются ограниченными. Целью данной работы явилось выявление воздействия окислительного стресса на пул полиР в клетках
дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Материалы и методы
Микроорганизмы. В работе были использованы штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: родительский CRN (MATa ade2 his3 ura3 ppn1D::CgTRP1), нокаут-мутант по гену PPN1, кодирующего
полифосфатазу Ppnl [7], и полученный из него трансформант CRN/PPX1, сверхпродуцент полифосфатазы Ppxl [8].
Условия культивирования. Культуры дрожжей поддерживали на агаризованной селективной среде YNB (2% агар) [9]. Для экспериментов клетки выращивали в жидкой среде YPD, содержащей 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы и 14 мМ KH2PO4. Культивирование проводили в колбах с 200 мл среды на качалках при 29°С и перемешивании со скоростью 140 rpm. При выращивании культур вносили Н2О2 до концентрации в среде 1 мМ.
Изучение зависимости роста штаммов от концентрации Н2О2 проводили в планшетах в среде YPD, содержащей от 1 до 5 мМ Н2О2. Исходная оптическая плотность культур составляла 0,1 ед. ОП. Клетки культивировали при 30°С в течение 22 часов (стационарная стадия) на шейкере. Оптическую плотность измеряли при 594 нм на планшетном фотометре «Эфос 9305» (Россия).
Сбор биомассы. Биомассу собирали на стационарной стадии роста центрифугированием при 3500 g в течение 10 мин, трижды промывая холодной дистиллированной водой.
Влияние Н2О2 на содержание АТФ и полиР. Изучение влияния Н2О2 на содержание АТФ и полиР в клетках дрожжей проводили в модельных опытах. Использовали 3 варианта среды: вода, вода и 2% глюкозы и вода, 2% глюкозы и 2,5 мМ Н2О2. В микропробирки на 2 мл, содержащие инкубационную среду, вносили 200 мг сырой биомассы клеток в виде водной суспензии. Общий объем смеси составлял 1,75 мл. Инкубацию проводили на шейкере в течение 60 минут при 30°С и 850 rpm. После инкубации клетки осаждали 1 мин при 12000 g, промывали водой и использовали для определения АТФ и полиР.
Определение АТФ. Для экстракции АТФ к 100 мг клеток добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) до объема 350 мкл, суспендировали и хранили при -20°С. Экстрагированную из клеток АТФ определяли с помощью препарата люциферин-люциферазы («Sigma", США). Измерение проводили на люминометре 1250 («LKB-1250», Швеция).
Экстракция полиР. Из клеток получали кислоторастворимую (полиР1) и кислотонерастворимую (полиРП) фракции полиР. Для получения кислоторастворимой фракции к образцам клеток (200 мг сырой биомассы) добавляли 0,2 мл 1 М HCIO4 и 1,5 мл 0,5 М HCIO4. Экстракцию проводили при 0°С в течение 15 мин на ротомиксере. Затем отделяли супернатант центрифугированием 2 мин при 12000 g. Операцию повторяли дважды. Супернатанты объединяли.
Для определения содержания кислотнерастворимых полиР осадок обрабатывали 0,2 мл 1 М HCIO4 и 1,5 мл 0,5 М HCIO4 при 90°С в течение 20 мин. Супернатант отделяли центрифугированием 2 мин при 12000 g. Операцию повторяли дважды, супернатанты объединяли.
Определение фосфата. Аликвоты фракций полиР подвергали гидролизу в 1 М HCl на кипящей бане в течение 10 мин. О содержании полиР во фракциях судили по образовавшемуся в результате гидролиза ортофосфату, который определяли по методу Хейнонена и Лахти [10].
Результаты и обсуждение
В качестве экспериментальной модели были выбраны два штамма дрожжей S. cerevisiae, различающихся по чувствительности к перекиси водорода. На рис.1 показано, что чувствительность штамма CRN/PPX1, суперпродуцента полифосфатазы Ррх1, к различным концентрациям Н2О2 выше, чем у родительского штамма. Концентрации, вызывающие полное подавление роста, составили 2 и 3 мМ Н2О2 для штаммов CRN и CRN/PPX1, соответственно.
0 1 2 3 4 5
Н,02, мМ
Рис. 1. Оптическая плотность штаммов на стационарной стадии роста при культивировании в среде с разной концентрацией Н2О2:
1 - CRN, 2 - CRN/PPX1
В следующем эксперименте была проведена оценка содержания ортофосфата (Р^ и полиР в клетках, выращенных до стационарной стадии роста в контрольных условиях и в условиях добавления при засеве 1 мМ Н2О2. Эта концентрация оказывала незначительное влияние на рост и содержание полиРП (табл. 1).
Однако эта концентрация Н2О2 вызывала снижение содержания полиР! Это снижение более выражено у штамма CRN/PPX1. У штамма-суперпродуцента Ррх1 отмечено также увеличение содержания ортофосфата, что может быть связано с усилением гидролиза полиР полифосфатазой Ppx1 в этих условиях. Отметим, что у штамма CRN не только отсутствует полифосфатаза Ppn1, но и на порядок снижена
активность полифосфатазы Ррх1 [11]. Тем не менее, снижение уровня полиР1 у штамма является заметным и, по-видимому, осуществляется в условиях окислительного стресса другими полифосфатазами, которые имеются в клетках дрожжей [12].
Таблица 1
Оптическая плотность, Р( и фракции полиР (мкмоль Р/г сырой биомассы) на стационарной стадии роста штаммов CRN и CRN/PPX1, выросших в присутствии и в отсутствие (контроль) 1 мМН2О2
Штамм Условия ОП530 R полиР I полиР II
CRN Контроль 2,46±0,1 37,9±1,1 52±4,78 34,4±1,88
1мМ Н2О2 2,44±0,09 39,7±4,95 43,5±1,98 32,5±2,12
CRN/PPX1 Контроль 2,57±0,04 37,9±0,56 57,3±0,99 38,4±0,99
1мМ Н2О2 2,52±0,08 55,2±1,06 29,9±0,28 42,4±2,47
ПолиР как и АТФ являются макроэргическими соединениями. Метаболизм полиР и АТФ, как макроэргических соединений тесно связан между собой [1]. Мы обнаружили, что штамм CRN/PPX1 характеризуется необычно высоким уровнем АТФ в стационарной стадии роста: он составил 176 нмоль АТФ/г сырой биомассы против 27 нмоль АТФ/г сырой биомассы у родительского штамма.
Для оценки воздействия более высокой концентрации Н2О2 на содержание ортофосфата, полиР и АТФ клетки в течение 60 минут инкубировали в модельных условиях, когда рост блокирован отсутствием источника азота. В качестве контроля использовали инкубацию в воде. При этом содержание полиР оставалось почти таким же, как и в исходных клетках (контрольные данные в таблицах 1 и 2). Гликолиз в этих условиях приводит к значительному увеличению уровня АТФ у родительского штамма, тогда как у штамма-суперпродуцента Ррх1, из-за высокого исходного уровня АТФ это увеличение незначительно (рис. 2). При этом у штамма-суперпродуцента Ррх1 прирост уровня полиР более выражен. По-видимому, избыток АТФ в исходных клетках используется для синтеза этого полимера. При воздействии перекиси уровень и полиР, и АТФ снижался у обоих штаммов (рис.2).
Контроль Глюкоза Глюкоза Контроль Глюкоза Глюкоза
Рис. 2. Содержание АТР, Р[ и суммы полиР в клетках штаммов CRN и CRN/PPX1 при инкубации в различных средах в течение 60 минут при 30°С: 1 - Р,, 2 - сумма полиР, 3 - АТР
Мы также проанализировали изменения содержания двух фракций полиР у обоих штаммов и обнаружили накопление кислотонерастворимых полиРП в данных условиях (табл. 2). В присутствии глюкозы происходило накопление кислотонерастворимых полиРП и уменьшение содержания фракции кислоторастворимых полиР! (таблица 2). Наличие перекиси в среде приводило к снижению накопления полиРП у обоих штаммов. Уменьшение содержания полиР! в присутствии перекиси было невелико.
Таблица 2
Влияние 2,5% Н2О2 на содержание двух фракций полиР в клетках дрожжей CRN и CRN/PPX1, мкмоль Р/г сырой биомассы_
Штамм Среда инкубации полиР1 полиРП
CRN Контроль 56,1±3,75 30±0,64
Глюкоза 46,2±3,68 53,2±4,17
Глюкоза + Н2О2 38,2±2,19 45,5±0,56
CRN/PPX1 Контроль 64,9±1,41 32,5±0,99
Глюкоза 50,6±2,76 73±7,07
Глюкоза + Н2О2 52,6±5,66 62,6±1,63
Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что полиР являются резервным макроэргическим полимером, который используется клеткой в условиях перекисного стресса. Отметим, что эти результаты не позволяют говорить о прямой взаимосвязи между
повышенной чувствительностью штамма CRN/PPX1 к перекиси и уровнем полиР.
Список литературы
1. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Кулаковская Т.В. Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология. М.: Научный мир, 2005. 215 с.
2. Adaptation of Saccharomyces cerevisiae to toxic manganese concentration triggers changes in inorganic polyphosphates / N. Andreeva, L. Ryazanova, V. Dmitriev [et al.] // FEMS Yeast Res. 2013. V. 13. P. 463-470.
3. Trilisenko L., Kulakovskaya E., Kulakovskaya T. The cadmium tolerance in Saccharomyces cerevisiae depends on inorganic polyphosphate // J. Basic Microbiol. 2017. V. 57. P 982-986.
4. Rao N.N., Gómez-García M.R., Kornberg A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival // Annu. Rev. Biochem. 2009. V. 78. P. 605-647.
5. Исследование механизмов стрессоустойчивости грибов-индикаторов высоких уровней радиоактивного загрязнения Чернобыльской зоны / А. С. Егорова, Н. Н. Гесслер, Л. П. Рязанова [и др.]. // Микробиология. 2015. Т. 84. № 2. С. 184-191.
6. Gray M.J., Jakob U. Oxidative stress protection by polyphosphate-new roles for an old player // Curr. Opin. Microbiol. 2015. V. 24. P. 1-6.
7. Sethuraman A., Rao N.N., Kornberg A.The endopolyphosphatase gene: essential in Saccharomyces cerevisiae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 8542-8547.
8. Сверхэкспрессия гена РРХ1 не влияет на полифосфаты Saccharomyces cerevisiae / Л.П. Личко, М.В. Эльдаров, М.В. Думина [и др.] // Биохимия. 2014. Т. 79. №8. С. 1487-1492.
9. Трилисенко Л.В., Кулаковская Т.В. Полифосфаты как резерв энергии для роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Биохимия. 2014. Т. 79. № 5. С. 605-610.
10. Heinonen J.K., Lahti R.J. A new and convenient colorimetric determination of inorganic orthophosphate and its application to the assay of inorganic pyrophosphatase // Anal. Biochem. 1981. V. 113. P. 313-317.
11. Lichko L., Kulakovskaya T., Kulaev I. Inactivation of endopolyphosphatase gene PPN1 results in inhibition of expression of exopolyphosphatase PPX1 and high-molecular-mass exopolyphosphatase not encoded by PPX1 in Saccharomyces cerevisiae // BBA. 2004. V. 1674. P. 98102.
12. Ppn2 endopolyphosphatase overexpressed in Saccharomyces cerevisiae: comparison with Ppn1, Ppx1, and Ddp1 polyphosphatases / N.
Andreeva, L. Ledova, L. Ryazanova [et al.] // Biochimie. 2019. V. 163(5). P. 101-107. pii: S0300-9084(19)30166-X. doi: 10.1016/j.biochi.2019.06.001.
Трилисенко Людмила Васильевна, канд. биол. наук, научный сотрудник, luvatri@rambler.ru Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г. К. Скрябина ФИЦ ПНЦБИ РАН,
Кулаковская Татьяна Валентиновна, докт. биол. наук, ведущий научный сотрудник, alla@ ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г. К. Скрябина ФИЦ ПНЦБИ РАН
THE ROLE OF INORGANIC POLYPHOSPHATE IS ADAPTATION OF YEAST
TO PEROXYDE STRESS
L. V. Trilisenko, T. V. Kulakovskaya
The treatment of yeast cells by hydrogen peroxide leads to a decrease in the level of inorganic polyphosphates both in the case of short-term exposure and cultivation in the presence of H2O2. Under non-growth conditions, this decrease depended on the amount of ATP in the cells. We suggest the inorganic polyphosphates are energy source under adaptation to peroxide stress.
Key words: Saccharomyces cerevisiae, polyphosphatase Ppxl, hydrogen peroxide, inorganic polyphosphate, ATP.
Trilisenko Ludmila Vasilevna, candidate of biological science, stuff scientist, luvatri@rambler.ru, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, FRS Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences,
Kulakovskaya Tatiana Valentinovna, doctor of biological sciences, leading researcher, alla@,ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, FRS Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences
