CC BY
11
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.36 + 582.282.23
РОЛЬ ПРОТОННОЙ АТФАЗЫ PMA2 В СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ У ДРОЖЖЕЙ
А.А. Томашевский, А.Н. Звонарев
Изучено значение H+-АТФазы плазматической мембраны дрожжей, кодируемой геном PMA2 для адаптации к различным стрессовым факторам среды, таким, как тяжелые металлы, солевой, окислительный и щелочной стресс. Показано, что фермент важен для адаптации к щелочному стрессу, но не является необходимым.
Ключевые слова: H+АТФаза плазматической мембраны, PMA2, Saccharomyces cerevisiae.
И+-АТФаза плазматической мембраны дрожжей является жизненно важным ферментом [1]. Будучи протонной помпой, она создаёт электрохимический градиент ионов водорода (Д^Н+), который используется для активного транспорта веществ в клетку и участвует в поддержании ионного гомеостаза и внутриклеточного pH [2,1]. В обычных условиях у Saccharomyces cerevisiae экспрессируется АТФаза плазматической мембраны, кодируемая геном PMA1 [1]. Однако в геноме этих дрожжей имеется ген PMA2 на 89% идентичный PMA1 и кодирующий фермент, функционально аналогичный PMA1 [3]. Уровень экспрессии гена PMA2 в нормальных условиях роста в 300 раз меньше, чем PMA1 [4], и функции этой АТФазы мало изучены. Показано, уровень экспрессии PMA2 значительно возрастает при адаптации дрожжей к токсическим концентрациям марганца, а способность нокаут-мутанта по этому гену к такой адаптации снижена [5]. Целью данной работы было выявить влияние нокаут-мутации по PMA2 на адаптацию клеток дрожжей к таким факторам, как токсическая концентрация ионов кадмия, солевой, окислительный и щелочной стрессы.
Материалы и методы
Микроорганизмы. В работе был использован родительский штамм BY4743 (WT) и мутантный штамм YPL036W с нокаутом гена PMA2 (Apma2), полученные из коммерческой коллекции Dharmacon.
Условия культивирования. Культуры дрожжей поддерживали на агаризованной среде YPD (2% агара), содержащей 1% дрожжевого экстракта, 2 % пептона и 2 % глюкозы. Для работы клетки выращивали на жидкой среде YPD, содержащей 2%-ную глюкозу либо 1%-ный этанол в
качестве источника энергии. Для культивации в условиях щелочного стресса в 200 мл среды с глюкозой добавляли 700 мкл 10 М KOH.
Определение АТФазной активности. Клетки осаждали, дважды промывали водой. 1 г клеток ресуспендировали в 10 мл буфера (0,01 M MES-NaOH, pH 6,5, 0,1 M KCl, 0,004 M MgSO4), после чего добавляли 0,5 мл 1%-ного раствора Тритона Х-100, разливали по 1 мл в пробирки и замораживали. Перед определением АТФазной активности пробы оттаивали во льду, осаждали клетки и ресуспендировали их в 200 мкл того же буфера без добавления Тритона Х-100. Аликвоты (0,05 мл) суспензии клеток добавляли к 0,95 мл того же буфера, содержащего 5 мМ MgSO4 и АТФ, и инкубировали 30 минут в присутствии и отсутствие 100 мкМ Na3VO4 при 30оС и 700 rpm. Для остановки реакции добавляли 400 мкл 1 М HClO4. Затем проводили осаждение при 13000 g в течение 3 мин. Активность фермента определяли по высвобождению фосфата (Pi). Из надосадочной жидкости отбирали пробы для определения содержания Pi с использованием молибдата аммония и аскорбиновой кислоты в качестве окислителя. Реакцию по определению Pi проводили в планшетах для иммуноферментного анализа при 30оС в течение 10 мин на шейкере и затем измеряли оптическую плотность при 750 нм на фотометре "Эфос 9305" (Россия).
Закисление среды. Клетки осаждали, дважды промывали водой. 1 г клеток ресуспендировали в 10 мл воды. 500 мкл этой суспензии вносили в 100 мл воды содержащей 2% глюкозы и измеряли рН при постоянном перемешивании.
Микроскопирование. Использовали микроскоп AXIO Imager A1 ZEISS (Германия). Счёт клеток производили с помощью светового микроскопа в камере Горяева.
Результаты и их обсуждение
Было показано, что экспрессия гена PMA2 возрастает на стадии диауксического роста при культивировании на глюкозе, при культивировании на этаноле и в условиях щелочного стресса. [6,7,3]. В нашей работе кривые роста штаммов WT и /\pma2 на средах YPD как с глюкозой, так и с этанолом не различались (не иллюстрируется).
Была измерена ванадат-чувствительная АТФазная активность in situ в клетках дрожжей, находящихся в стационарной стадии роста при культивировании на средах с глюкозой, этанолом и в условиях щелочного стресса при росте на глюкозе. Данные представлены в таблице 1. Для этого измерения использовали клетки обоих штаммов, культивировавшиеся на среде с глюкозой в течение 3 суток (глубокая стационарная стадия) Во всех трёх случаях активность у мутантного штамма была ниже, чем у родительского. Эта разница невелика, что указывает на то, что даже в условиях наибольшей экспрессии гена PMA2, большая часть ванадат-
чувствительной АТФазной активности обеспечивается ферментом гена PMA1 [8].
Таблица 1
Ванадат-чувствительная АТФазная активность in situ родительского (WT) и мутантного (Apma2) штаммов в различных условиях роста. E/г
сырой биомассы
Штамм Рост на Рост на Щелочной
этаноле глюкозе стресс
WT 1,22 ±0,05 0,68 ±0,02 1,46 ±0,03
/\pma2 1,17 ±0,01 0,54 ±0,005 1,24 ±0,02
Закисление среды клетками дрожжей используется в литературе как один из критериев функционирования протонного насоса цитоплазматической мембраны [9]. На рис. 1 показан график понижения рН в суспензии клеток, выращенных на глюкозе в течение 3 суток, после добавления глюкозы. Как видно из рис. 1, мутантный штамм закисляет среду несколько меньше родительского.
Рис. 1. Закисление среды клетками родительского и мутантного штамма при ферментации глюкозы: 1 - родительский штамм,
2 - мутантный штамм
Полученные данные свидетельствуют о том, что вклад PMA2 в энергизацию цитоплазматической мембраны даже в условиях увеличенной экспрессии остается небольшим.
Поскольку ранее было известно, что штамм /\pma2 хуже адаптируется к высокой концентрации ионов марганца, мы проверили
действие другого окислителя, Н202, и другого токсического иона металла, Cd2+ на рост штаммов WT и /\pma2.
Мы сравнили подавление роста этих штаммов ионами кадмия, перекисью водорода и при увеличенной солености среды. Штаммы WT и /\pma2 культивировали в течение суток на среде YPD c 2% глюкозы в присутствии или отсутствии различных концентраций сульфата кадмия, перекиси водорода и хлорида натрия. Как видно из табл. 2, чувствительность родительского и мутантного штаммов к этим соединениям оказалась близкой.
Таблица 2
Оптическая плотность культур клеток родительского (ЖТ) и мутантного (Арта2) штаммов при выращивании в присутствии сульфата кадмия, перекиси водорода и хлорида натрия, % от оптической плотности культуры штамма ЖТ в контрольных условиях
Штамм СdSO 4
0,02 мЫ 0,05 мЫ 0,1 мЫ 0,15 мЫ
WT 83 ±10 68 ±0,5 43 ±0,9 12 ±1,6
/\pma2 87 ±6,1 61 ±2,4 30 ±0,3 17 ±0,9
№С1
1 Ы 1,25 Ы 1,5 Ы 2 М
WT 82 ±2,5 67 ±1,8 39 ±2,2 2 ±0,2
/\pma2 78 ±0,7 62 ±1,6 33 ±3,3 6 ±0,4
Н2О2
5 мЫ 6 мЫ 7 мЫ
WT 30 ±5,1 11 ±1,4 3 ±0,2
/\pma2 26 ±3,8 9 ±0,7 3 ±0,1
Хотя разницы в оптической плотности при щелочном стрессе не обнаружено, был произведён счёт клеток при культивировании в различных условиях: ранней и поздней (1-4 суток) стационарной стадии роста на среде с глюкозой, роста на среде с этанолом в качестве источника энергии и роста в условиях щелочного стресса. Достоверной разницы в концентрации клеток выявлено не было, но мы обратили внимание на различия в морфологии. С помощью фазово-контрастной микроскопии, мы обнаружили различия в морфология клеток родительского и мутантного штаммов при культивации в описанных выше условиях. На рис. 2 представлены фотографии клеток, выращенных в условиях щелочного стресса. У мутантного штамма наблюдаются значительные изменения морфологии - увеличен размер клетки, а вакуоль занимает почти весь её
объём. В то же время у клеток, выращенных в других условиях, заметных отличий между штаммами не наблюдали.
Рис. 2. Микрофотография клеток родительского и мутантного штамма в условиях щелочного стресса
Таким образом можно заключить, что И+-АТФаза плазматической мембраны, кодируемая геном PMA2, участвует в адаптации дрожжей к щелочному стрессу. Нокаут мутация по этому гену, хотя и не является
летальной для этих условий, однако приводит к значительному изменению морфологии клеток.
Список литературы
1. Serrano R., Kielland-Brandt M., Fink G.R. Yeast plasma membrane H+-ATPase is essential for growth and has homology with (Na+-K+)-, K+- and Ca2+-ATPases // Nature (Lond). 1986. V. 319. P. 689-693. DOI: 10.1038/319689a0.
2. Sanchez, N.S., Castro, D.E., Calahorra, M., Martiinez-Munoz, G.A. and Pena A. Yeast Plasma Membrane and Vacuolar H+-ATPases. N.Y.: Nova Science Publisher, 2012.
3. Second transport ATPase gene in Saccharomyces cerevisiae / A. Schlesser, S. Ulaszewski, M. Ghislain [et al]. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 19480-19487.
4. Regulation of the expression of the H+-ATPase genes PMA1 and PMA2 during growth and effects of octanoic acid in Saccharomyces cerevisiae / A.C. Viegas, P. Supply, E. Capieaux [et al]. // Biochim Biophys Acta. 1994. V. 1217. P. 74-80.
5. Transcriptome profile of yeast reveals the essential role of PMA2 and uncharacterized gene YBR056W-A (MNC1) in adaptation to toxic manganese concentration / N. Andreeva, E. Kulakovskaya, A. Zvonarev [et al]. // Metallomics. 2017. V. 9(2). P. 175-182. DOI: 10.1039/c6mt00210b.
6. Fernandes A and Sa-Correia I. Transcription patterns of PMA1 and PMA2 genes and activity of plasma membrane H+- ATPase in Saccharomyces cerevisiae during diauxic growth and stationary phase // Yeast. 2003. V. 20. P. 207-219. DOI: 10.1002/yea.957.
7. The in vivo activation of Saccharomyces cerevisiae plasma membrane H+-ATPase by ethanol depends on the expression of the PMA1 gene, but not of the PMA2 gene / G.A. Monteiro, P. Supply, A. Goffeau [et al]. // Yeast .1994. V. 10. P. 1439-1446. DOI: 10.1002/yea.320101107.
8. Functional role of charged residues in the transmembrane segments of the yeast plasma membrane H+-ATPase / V.V. Petrov, K.P. Padmanabha, R.K. Nakamoto [et al]. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 15709-15716. DOI: 10.1074/jbc.M000546200.
9. Петров В.В., Окороков Л.А. Энергизация плазмалеммы дрожжей необходима для активации её H+-ATPазы глюкозой // Биохимия. 1992. № 11. С. 1705-1711.
Томашевский Александр Андреевич, канд. биол. наук, научный сотрудник, tomashevskialexandr25@gmail.com, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина ФИЦ ПНЦБИ РАН,
Звонарев Антон Николаевич, канд. биол. наук, младший научный сотрудник, zvonarev®,ibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина ФИЦ ПНЦБИ РАН.
THE ROLE OF YEASTPMA2 H+-ATPASE IN STRESSING CONDITIONS
A.A. Tomashevski, A.N. Zvonarev
The role of yeast PMA2 plasma membrane H+-ATPase was studied in case of adaptation to several stressing conditions such as heavy metals, salt, oxidative and alkaline stresses. The work revealed that PMA2 ATPase is important for adaptation to alkaline stress but it is not essential.
Key words: Plasma membrane H+-ATPase, PMA2, Saccharomyces cerevisiae.
Tomashevski Alexandr Andreevich, candidate of biological science, stuff scientist, tomashevskialexandr25@gmail.com, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, FRC Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences,
Zvonarev Anton Nikolaevich, candidate of biological science, stuff scientist, zvonarev@ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, FRC Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences
