CC BY
30
УДК 576.32.36: 582.282.23
РОЛЬ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ М6 И М8 В СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ Pma1 H+-ATPАЗЫ ДРОЖЖЕЙ
© В. В. Петров1*, Р. И. Ибрагимов2
1 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г. К. Скрябина Россия, 142290 г. Пущино, пр. Науки, 5.
Тел.: +7 (496) 731 86 98.
E-mail: vpetrov07@gmail.com Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел.: +7 (347) 229 96 71.
Для сравнительного изучения структурно-функциональной организации Pmal Н+-АТРазы плазматической мембраны дрожжей использовали аланин-сканирующий мутагенез аминокислотных остатков сегментов M6 и M8. Сегмент М6 содержал значительное количество остатков, замена которых приводила к нарушению функционирования фермента, вызывая полное блокирование его биогенеза и/или потерю активности и в 3 случаях — уменьшение сопряжения фермента. В сегменте М8 замена на Ala только 6 остатков приводила к блокированию биогенеза и/или потере активности. Замена еще 6 остатков вызывала значительное изменение сопряжения фермента — от почти полного разобщения до почти трехкратного сверхсопряжения. Полученные данные позволяют предположить, что, кроме структурной, роль сегмента М6 связана с определением катионной специфичности транспорта, в то время как сегмент М8 регулирует стехиометрию транспорта, а также постулировать наличие у фермента двух сайтов связывания протонов (ионов Н3О+), подобно наличию двух сайтов связывания Са + в гомологичной Са +-АТРазе дрожжей.
Ключевые слова: дрожжи, плазматическая мембрана, секреторные везикулы, биогенез, Pmal Н+-АТРаза, H+ транспорт, сайт-направленный мутагенез.
Введение
Н -АТРаза плазматической мембраны дрожжей (Pmal) является жизненно необходимым ферментом, генерирующим трансмембранный электрохимический протонный потенциал, за счет энергии которого функционируют различные вторичные транспортные системы и поддерживается ионный гомеостаз и кислотность цитоплазмы. Pmal АТРаза относится к широко распространенной группе Р2-АТРаз, входящих в семейство Р-АТРаз, которые сопрягают энергию гидролиза АТР с транспортом различных катионов через клеточные и внутриклеточные мембраны; к ним, в частности, относятся физиологически важные Н-АТРазы грибов и растений и Ca2+-, Н+, K+ - и Na , K -АТРазы животных клеток [1].
Изучение Pmal АТРазы дрожжей представляется важным поскольку, с одной стороны, дрожжи и грибы являются важным объектом биотехнологических производств, будучи продуцентами ценных биологически-активных веществ (Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Aspergillus и др.), они также могут вызывать оппортунистические инфекции (Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis и др.) или порчу продуктов (Zygosaccharomyces), с другой - являются удобной моделью для изучения гомологичных ферментов животных клеток. Представленные данные являются частью систематического изучения Pmal Н-АТРазы дрожжей и сфокусированы на трансмембранных сегментах М6 и М8 с целью сравнения их роли в структурно-функциональной организации фермента.
Методология
При изучении Рта1 АТРазы использовали штамм дрожжей Б. cerevisiae SY4, в котором присутствовали хромосомная (РМА1) и плазмидная (рта1) копии гена, кодирующего Рта1 Н-АТРазу [2-4]. Хромосомная копия гена АТРазы дикого типа находилась под контролем промотора ОАЬ1 (Р(здь-РМА1), плазмидная (на центромерной плаз-миде YCp2HSE) — под контролем индуцируемого тепловым шоком промотора НБЕ (РШЕ-рта1); сам плазмидный ген рта1 был или родительского типа или мутантный. Для введения мутаций в ген рта1 использовали ПЦР. Затем ген переносили в плаз-миду YCp2HSE, которой трансформировали штамм SY4. Штамм SY4 также содержал температурно-чувствительную мутацию в БЕС6 гене, блокирующую слияние секреторных везикул с плазматической мембраной при тепловом шоке и приводящую к накоплению секреторных везикул. Дрожжи выращивали при 23 °С на среде с галактозой до середины логарифмической фазы роста; при этом с хромосомного гена РМА1 синтезировался фермент дикого типа. Когда клетки переносили на среду с глюкозой, синтез с гена РМА1 прерывался, при повышении температуры до 37 °С синтез фермента начинался с плазмидного гена рта1 (кодирующего дикий или мутантный тип АТРазы). При этом секреторные везикулы, содержащие фермент, вновь синтезированный с плазмидного гена рта1, накапливались в клетке. В качестве контроля на присутствие плазматических мембран, несущих АТРазу
* автор, ответственный за переписку
дикого типа, синтезированную с хромосомного гена, использовали секреторные везикулы, выделенные из штамма, несущего плазмиду YCp2HSE без гена pmal. Секреторные везикулы, практически свободные от примеси плазматических мембран (не более 3-4%), выделяли с помощью дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и определяли уровень экспрессии фермента и его активность. Протонный транспорт в секреторные везикулы регистрировали по гашению флуоресценции рН-чувствительного красителя акридинового оранжевого, как описано ранее [2-4]. Чтобы оценить степень сопряжения гидролиза АТР с транспортом Н+, проводили параллельные измерения АТРазной активности и гашения флуоресценции в одинаковых условиях, но при различных концентрациях MgATP [3, 4].
Топология Р2-АТРаз и каталитический механизм
Все Р2-АТРазы имеют одну главную каталитическую субъединицу, встроенную в липидный бислой посредством четырех трансмембранных гидрофобных сегментов в N-концевой и шести сегментов в С-концевой частей фермента, разной длины и наклона (рис. 1). Эти десять сегментов взаимодействуют как между собой, так и с липидным бислоем, и образуют мембранный домен фермента, в котором находятся остатки, участвующие в транспорте катионов. Они связаны между собой пятью относительно короткими экстрацитозольны-ми и четырьмя более длинными цитозольными петлями, самые важные из которых так называемые большая и малая петли, образующие АТР-связывающий (средняя часть большой петли), фос-форилирующий (N- и C-концевые части этой петли) и приводящий (N-концевая часть фермента и малая петля) домены [5].
Р2-АТРазы обладают общим каталитическим механизмом, при котором АТР связывается с консервативным остатком Asp с образованием макро-эргического фосфорилированного интермедиата. Стехиометрия катионного транспорта, как и его специфичность, различаются у различных представителей этого семейства, варьируя от 1-2 H/ATP у протонных насосов плазматических мембран грибов и растений [3, 4, 6] до 2 Ca2+/ATP и 3 Na+/2 K/ATP у Ca2 - и ^+,К+-АТРаз животных клеток [7]. Детерминанты катионной специфичности и стехиометрии транспорта находятся в сердцевине трансмембранных сегментов M4, M5, M6 и M8 этих ферментов, и сайт-направленный мутагенез Ca2 - и ^^К+^ТРаз выявил аминокислотные остатки в М4, М5, М6 и М8, ответственные за транспорт катионов. В Н-АТРазе плазматической мембраны дрожжей таким остаткам соответствуют, в частности, Glu-703 в M5, Asp-730 в M6 и Glu-803 в M8, замена которых изменяет сопряжение гидроли-
за АТР и транспорта Н или нарушает нормальное функционирование фермента и/или его биогенез [3, 4, 8-10]. Замены ключевых остатков в этих сегментах Р2-АТРаз (например, в мембранном сегменте М6 Ca2+, Мп2+-АТРазы эндоплазматического рети-кулюма дрожжевой клетки) могут даже изменить специфичность катионного транспорта [11].
Рис. 1. Схематическая топология Pmal Н+-АТРазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, показывающая трансмембранные сегменты М1-М10. Цифры обозначают количество аминокислотных остатков в цитозольных частях фермента. Общее количество остатков в Pma1 H-АТРазе S. cerevisiae составляет 918.
Во время реакционного цикла Р2-АТРазы претерпевают существенные конформационные изменения; фермент при связывании АТР и транспортируемых катионов обратимо переходит из состояния Е1 с высоким сродством к субстрату (MgATP и транспортируемому катиону) и низким — к ингибитору ортованадату, являющийся аналогом орто-фосфата, в состояние Е2 с противоположными свойствами. При этом трансмембранные сегменты М1—М6, представляющие a-спирали, сгибаются, частично разворачиваются и даже выходят из мембраны, в то время как сегменты М7—М10 менее подвижны [5].
Роль трансмембранного сегмента М6
Pmal Н-АТРаза синтезируется в эндоплазма-тическом ретикулюме и в процессе созревания последовательно проходит через аппарат Гольджи и секреторные везикулы, которые доставляют фермент к плазматической мембране. На этих стадиях имеются пункты контроля качества, и если фермент имеет серьезные дефекты фолдинга, он отбраковывается [12, 13].
Сегмент М6 Н-АТРазе дрожжей S. cerevisiae состоит из 19 аминокислотных остатков: 721-LIVFIAIFADVATLAIAYD. Эти остатки были заменены на Ala, а в случае A726, A729, A732, A735 и А737 — на Ser. Из полученных замен только две — D730A и D739A — вызывали полное блокирование трафика синтезированных мутантных ферментов, что предотвращало достижение ими секреторных везикул: экспрессия D730A и D739A составляла 2— 6% от уровня дикого типа. Такое поведение типично для белка с серьезными дефектами фолдинга, что приводит в действие механизмы контроля каче-
ства [12, 13]. В случае замен L721A, I721A, F724A, I725A, I727A, F728A, L734A и Y738A мутантные ферменты экспрессировались на уровне от 29 до 90% от уровня АТРазы дикого типа, однако теряли активность. Так, N-концевая часть сегмента М6 Pmal АТРазы содержит семь расположенных практически один за другим аминокислотных остатков (721-LI.FI.IF.D), замена которых нарушает биогенез и/или активность фермента (рис. 2); замена еще одного остатка из этого ряда (мутация A726S) приводила к снижению уровня сопряженности фермента вдвое, а другого (мутация V723A) — к многократному изменению кинетических параметров, связанных со сдвигом в конформацию Е1 [13]. Кроме этого, замены еще двух аминокислотных остатков, примыкающих к вышеуказанным (мутации A732S и T733A), приводили к падению уровня сопряженности мутантных ферментов вдвое. Таким образом, из 19 остатков, образующих сегмент М6, только в 5 случаях замены не приводили к нарушению биогенеза и/или активности фермента или его функционирования.
Известно, что остатки Asp, соответствующие D730 Pmal АТРазы дрожжей S. cerevisiae, участвуют в образовании сайтов связывания катионов в - и других Р2^ТРазах животных клеток, растений и дрожжей. Были сделаны дополнительные консервативные замены этого остатка на Glu и Asn. Замена D730 на Glu (D730E) существенно увеличивала экспрессию фермента (48% от дикого типа), увеличивая также активность, остававшуюся однако очень низкой (14%). В то же время замена D730N мало меняла ситуацию по сравнению с D730A [3, 8, 9]. Таким образом, эти данные свидетельствуют об исключительно важной роли D730 в структурно-функциональной организации Pma1 Н-АТРазы дрожжей и других ферментов этого типа.
Роль трансмембранного сегмента М8
Трансмембранный сегмент М8 образует 21 аминокислотный остаток (791-
MNGIMFLQISLTENWLIFITR). Эти остатки также были последовательно заменены на Ala, мутантные ферменты были экспрессированы в секреторных везикулах, где были изучены уровень их экспрессии, АТР-гидролазной и Н -транслоказной активностей и степень их сопряжения. В отличие от сегмента М6, где мутации приводили к блокированию биогенеза только в 2 случаях, нарушение экспрессии при мутациях в сегменте М8 наблюдалось в 4 случаях (I794A, F796A, Q798A, DI799A; рис. 3А), экспрессия которых составляла 1—9 % от уровня фермента дикого типа; еще в двух случаях (L801A и I807A) экспрессия была незначительной (18— 19%), а активность практически отсутствовала. У активных мутантов экспрессия составляла от 19 до 94%, а активность варьировала от 15 до 69% уровня дикого типа.
Рис. 2. Аминокислотные остатки в мембранном сегменте
М6 Pma1 АТРазы дрожжей, важные для биогенеза и функционирования фермента. Более светлая часть представляет N-концевая часть М6. Не показан Ala-726, замена которого на Ser приводит к двукратному падению сопряжения гидролиза АТР и Н+ транспорта.
Считается, что при нормальных условиях стехиометрия транспорта Н+ у Н-АТРаз грибов и растений составляет 1 Н+ на 1 молекулу АТР, хотя в некоторых случаях (у мутанта гриба Neurospora crassa) она может увеличиваться до 2 Н+/1 АТР [6]. Существенно отличными от данных, полученных для сегмента М6, оказались также данные о сопряжении гидролиза АТР мутантными ферментами в М8 и транспорте ими ионов Н+ (ионов гидроксония Н3О+). В 6 случаях замены (M791A, N792A, G793A, M795A, Е803А и R811A) приводили к значительному падению сопряжения или почти полному его отсутствию. В то же время в случае замены S800A мутантный фермент при гидролизе молекулы АТР транспортировал почти в 2 раза больше Н+, чем фермент дикого типа. Так как остаток E803 также участвует в образовании транспортного сайта в Са2+-АТРазе, а в Na , K -АТРазе на его месте находится Gln, были сконструированы дополнительные мутации этого остатка с заменами его на Gln, Asp, Asn, а также Arg (E803Q, E803D, E803N, E803R). В случае замены E803D наблюдалось 4-кратное падение экспрессии фермента и практическое отсутствие его активности. Фермент, несущий мутацию E803R, экспрессировался на уровне дикого типа, но был неактивен, в то же время ферменты E803Q и E803N экспрессировались как дикий тип и обладали значительной (E803Q — уровня дикого типа) активностью, однако при этом E803N, как и Е803А, был практически рассопряжен, а E803Q — сверхсопряжен, транспортируя почти три иона гидроксония на одну молекулу АТР. Таким образом, в 6 случаях наблюдалось значительное падение сопряженности фермента, а в двух (S800A и E803Q; рис. 3Б) — сверхсопряжение.
Пространственная организация фермента и механизмы транспорта
Совместно с мембранными сегментами М4 и М5 сегменты М6 и М8 формирует часть Са2 -связывающих сайтов в Са2+-АТРазе саркоплазма-тического ретикулюма и других Р2-АТРаз, участвуя остатками Т799 (сайт I), N796 (сайт II), D800 (оба сайта) в сегменте М6 и остатком E908 (сайт I) в сегменте М8. В Pma1 АТРазе этим остаткам соответствуют A729, A726, D730 и E803. Как показано, роль остатков D730 и E803 оказалась чрезвычайно важна. Замены D730A и D730N вызывали блокирование биогенеза фермента и только консервативная замена D730E восстанавливала биогенез до 48% от уровня дикого типа, но фермент оставался малоактивен [3], что не позволяло продолжить его изучение. В случае E803 ситуация была другой: ни одна из замен не приводила к полному блокированию трафика синтезированных de novo мутантных АТ-Раз, однако эти ферменты оказывались либо неактивными, либо существенно изменяли сопряжение транспорта Н+ и гидролиза АТР от почти полного разобщения до сверхсопряжения. Замена остатка
A726 (A726S), соответствовавшего N796 сайта II Са2+-АТРазы, приводила к частичному разобщению сопряжения Н+ транспорта и гидролиза АТР.
эаоо
А Б
Рис. 3. Гомологичная модель Рта1 АТРазы дрожжей, иллюстрирующая аминокислотные остатки, важные для биогенеза и стабильности фермента (А) или отвечающие за сопряжение протонного транспорта с гидролизом АТР (Б). Модель построена с использованием кристалличе-ско-структурной модели Са2+-АТРазы саркоплазматиче-ского ретикулюма, как описано в [4]. Мембранный домен представлен видным с экстрацитозольной поверхности плазматической мембраны. Цифры обозначают номера мембранных сегментов.
I331
Рис. 4. Сайты связывания и транспорта Н (Н3О ). Остатки Ile-331, Ile-332, Val-334 в М4 соответствуют Val-304, Ala-305
и Пе-307, Ser-699 в М5 соответствует Asn-768, Asp-730 в М6 - Asp-800 и Glu-803 в М8 - Glu-908, участвующих в образовании сайтов I и II Са2+-АТРазы саркоплазматического ретикулюма. Координированные гидратированные Н (Н3О ) представлены кружками в сферах. Гомологичная модель построена с использованием кристаллической структуры Са2+-АТРазы
саркоплазматического ретикулюма, как описано в [4].
Таким образом, кроме структурной, присущей обоим трансмембранным сегментам, роль сегмента М6 связана с определением катионной специфичности и селективности транспорта, подобно тому, что найдено для Ca2+, Мп2+-АТРазы дрожжей [11], в то время как роль сегмента М8 выражается в регулировании стехиометрии транспорта. Полученные данные позволяют постулировать, что в отличие от имеющегося представления о том, что в Н -АТРазах грибов и растений имеется лишь один сайт связывания протонов (ионов гидроксония Н3О+), этот фермент подобно Са2+-АТРазе обладает двумя такими сайтами (рис. 4), один из которых обычно является дормантным и становится активным лишь в результате мутации, как в данном исследовании, или в условиях хронической энергетической недостаточности, также вызванной мутацией [6], а сам транспортируемый специмен является гидратированным ионом гидроксония подобно гидратированным катионам кальция.
Работа частично поддержана грантом РФФИ №12-08-01157-а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lutsenko S., Kaplan J. H. Organization of P-type ATPases: significance of structural diversity // Biochemistry. 1995. V. 34. №48. P. 15607-15613.
2. Nakamoto R. K., Rao R., Slayman C. W. Expression of the yeast plasma membrane H+-ATPase in secretory vesicles. A new strategy for directed mutagenesis. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. №12. P. 7940-7949.
3. Petrov V. V., Padmanabha K. P., Nakamoto R. K., Allen K. E., Slayman C. W. Functional role of charged residues in the
transmembrane segments of the yeast plasma membrane H+-ATPase. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. №21. P.15709-15716.
4. Guerra G., Petrov V. V., Allen K. E., Miranda M., Pardo J. P., Slayman C. W. Role of transmembrane segment M8 in the biogenesis and function of yeast plasma-membrane H+-ATPase. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1768. №10. P. 2383-2392.
5. Toyosima, C., and Nomura, H. Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium. // Nature. 2002. V. 418. №6898. P. 605-611.
6. Warnke J., Slayman C. L. Metabolic modulation of stoichi-ometry in a proton pump // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 591. №2. P. 224-233.
7. Appel H. J. Ho do P-type ATPases transport ions? // Bioelec-trochemistry. 2004. V. 63. №1-2. P. 149-156.
8. Miranda-Arango M., Pardo J. P., Petrov V. V. Role of transmembrane segment M6 in the biogenesis and function of the yeast Pma1 H+-ATPase // J. Biomol. Struct. Dyn. 2009. V. 26. № 6. P. 866-868.
9. Miranda M., Pardo J. P., Petrov V. V. Structure-function relationships in membrane segment 6 of the yeast plasma membrane Pma1 H+-ATPase. // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1808. №7. P. 1781-1789.
10. Dutra M. B., Ambesi A., Slayman C. W. Structure-function relationships in membrane segment 5 of the yeast Pma1 H+-ATPase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. №28. P. 17411-17417.
11. Wei Y., Chen J., Rosas G., Tompkins D. A., Holt P. A., Rao R. Phenotypic screening of mutations in Pmr1, the yeast secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase, reveals residues critical for ion selectivity and transport. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. №31. P. 23927-23932.
12. Ferreira T., Mason A. B., Pypaert M., Allen K. E., Slayman C. W. Quality control in the yeast secretory pathway: a misfolded PMA1 H+-ATPase reveals two checkpoints. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. №23. P. 21027-21040.
13. Ambesi A., Miranda M., Petrov V. V., Slayman C. W. Biogenesis and function of the yeast plasma-membrane H+-ATPase // J. Exp. Biol. 2000. V. 203. №1. P. 156-160.
Поступила в редакцию 30.09.2013 г.
