CC BY
46
оригинальные статьи Журнал фундаментальной медицины и биологии
УДК 615.856:612.112:616-066.04-092.4
Е.Ю. Златник, Г.И. Закора, Л.В. Передреева, С.В. Белгова, М.В. Панасенко
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ НА СОСТОЯНИЕ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ПРИ ИНКУБАЦИИ IN VITRO
Лаборатория иммунологии ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России
Цель: изучение действия наночастиц (НЧ) металлов на фенотипические и функциональные характеристики иммунокомпетентных клеток онкологических больных.
Материалы и методы: после инкубации in vitro мононуклеарных клеток крови с взвесью наночастиц оценивали экспрессию рецепторов на лимфоцитах и моноцитах, функциональную активность нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов.
Результаты: отмечены следующие эффекты НЧ - стимуляция экспрессии рецепторов CD16 на NK-лимфоцитах при действии НЧ Cu, HLA-DR на моноцитах при действии НЧ Fe; регуляторное влияние на продукцию монокинов TNF-a и IL-1a при инкубации с НЧ Fe и НЧ Zn. Изменения были в целом позитивными, хотя и незначительно выраженными.
Заключение: повреждающего действия наночастиц на иммунокомпетентные клетки не наблюдалось.
Ключевые слова: наночастицы металлов, иммунокомпетентные клетки, онкологические больные.
E.Y. Zlatnik, G.I. Zakora, L.V. Peredreeva, S.V. Belgova, M.V. Panasenko
EFFECTS OF METALLIC NANOPARTICLES ON THE IMMUNOCYTES OF PATIENTS WITH MALIGNANT TUMORS
FSBI «Rostov Research Oncologic Institute» Ministry of Health
Purpose: To study the effects of the metallic nanoparticles (NP) on the phenotypic and functional characteristics of immunocytes of patients with malignant tumors.
Materials and methods: Assessment of membrane receptors' expression on monocytes and lymphocytes, functional activity of neutrophils, monocytes and lymphocytes after in vitro incubation of blood mononuclears with nanoparticles' suspension was carried out by immunologic methods.
Results: Stimulation of CD16 expression on NK-cells after incubation with NP Cu and of HLA-DR on monocytes after incubation with NP Fe was observed; regulatory effect of NP Fe and NP Zn on monokines' production (TNF-a and IL-1a) was demonstrated. Effects of NP on immunocytes seem to be positive though soft.
Summary: No injury of patients' immunocytes by metallic nanoparticles on was observed.
Key words: metallic nanoparticles, immunocytes, patients with malignant tumors.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
Введение
В последние годы в стране и за рубежом происходит бурное развитие нанотехнологий, одним из важнейших направлений которого является разработка и исследование наноразмерных частиц (НЧ). Изучение их биологических эффектов с целью определения возможных областей применения является актуальной задачей современной биологии и медицины. Нами ранее были показаны антипроли-феративные свойства НЧ металлов (Cu, Zn, Fe, их сплава) на различных экспериментальных моделях [1-7]. Представляет интерес исследование возможных иммунотропных свойств этих НЧ, поскольку известно, что многие металлы, включая Cu, Zn и Fe, влияют на метаболические процессы в иммуноком-петентных клетках, их функциональную активность, развитие органов иммунной системы и пр. [8].
Целью данной работы явилось изучение влияния НЧ металлов на функциональное состояние клеток врожденного и адаптивного иммунитета онкологических больных при инкубации in vitro. Было проведено изучение влияния НЧ:
1. На функциональную активность нейтрофи-лов;
2. На экспрессию мембранных рецепторов диф-ференцировки, активации и адгезии на лимфоцитах и моноцитах;
3. На продукцию моно- и лимфокинов монону-клеарными клетками крови.
онкологических больных проводили выделение мо-нонуклеарных клеток (МНК), включающих лимфоциты и моноциты, в градиенте плотности фиколл-верографина (р=1,077-1,078). К 1 мл взвеси клеток в концентрации (3-4)х106/мл добавляли по 100 мкл взвеси НЧ, ех 1етрогае обработанных ультразвуком для предотвращения агрегации, инкубировали, трижды отмывали средой 199. В зависимости от времени инкубации, необходимого для постановки того или иного метода, экспозиция клеток с НЧ была различной: для тестов НСТ, розеткообра-зования и иммунофлюоресценции она составляла 30-90 мин. при 37°С или при комнатной температуре. Для оценки продукции цитокинов в присутствии и в отсутствии НЧ проводили 24-часовое культивирование МНК в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640 с 10% инактивиро-ванной эмбриональной телячьей сыворотки, 5х10-5М 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ буфера HEPES, 50 мкг/мл гентамицина [9], после чего в супернатантах определяли содержание ТОТ-а, ^-1а, Я, ^-1ЯА, ^-2, ^-6, ^-8, ^-10 ИФА-методом с тест-системами фирм «Вектор-Бест» (Новосибирск) и «Цитокин» (С-Петербург).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрических (Стью-дента) и непараметрических (Уилкоксона-Манна-Уитни, z-критерий знаков) методов.
Результаты и обсуждение
Материалы и методы
В работе были использованы НЧ (размер 40100 нм), представляющие собой ультрадисперсные порошки металлов (Си, Zn, Fe и сплава, содержащего 60% Си, 15% Zn и 25% Fe), синтезированные на Саратовском плазмохимическом комплексе ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС. В опытах было использовано две концентрации НЧ в физиологическом растворе: 1 мкг/мл и 0,01 мкг/мл. В работе применены иммунологические методы: непрямой иммунофлюоресценции, спонтанного розеткообра-зования, восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), иммуноферментный анализ (ИФА).
Для постановки спонтанного и стимулированного латексом НСТ-теста использовали цельную кровь. Для остальных тестов из венозной крови
При световой микроскопии мазков для учета тестов НСТ и розеткообразования отдельные на-норазмерные частицы не видны, однако, в клетках и вне клеток определяется наличие их конгломератов. Светооптическая оценка клеток, способных к фагоцитозу (моноцитов и нейтрофилов), показала, что НЧ металлов как проникают внутрь клеток, так и прилипают к их мембране. В лимфоцитах, не обладающих способностью к фагоцитозу, также были обнаружены конгломераты частиц, особенно заметные при использовании НЧ Fe. Иногда наличие частиц отмечается и на мембранах эритроцитов. Инкубация с НЧ не приводит к визуально регистрируемому развитию повреждений клеток.
Результаты спонтанного и стимулированного латексом НСТ-теста с нейтрофилами представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние инкубации с НЧ металлов (1 мкг/мл) на функциональную активность нейтрофилов
Показатели Пробы (n=17)
Контроль НЧ Zn НЧ Fe НЧ сплава
НСТ спонт. (%) 15,11+2,13 14,93+1,64** 15,67+1,07 18,79+0,9**
НСТ стим. (%) 29,1+1,67 28,00+1,94** 34,40+2,61** 35,06+2,53* **
ИА f НСТстимЛ \НСТспонт/ 2,04+0,13 1,88+0,12** 2,2+0,15** 1,87+0,26
Примечание. * - статистически достоверные отличия от контроля по критерию Стьюдента (Р<0,05); ** - статистически достоверные различия в зависимости от вида НЧ по z-критерию знаков.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
Как видно из таблицы 1, результаты НСТ-теста продемонстрировали повышение по сравнению с контролем стимулированного латексом восстановления НСТ при применении НЧ сплава, что говорит об усилении реакций «дыхательного взрыва» в нейтрофилах. Действие НЧ Zn и НЧ Fe было статистически недостоверно по сравнению с контролем, однако различалось между собой. Так, при применении непараметрических методов выявлены статистически значимо более низкие показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста, а также индекса активации (ИА) при инкубации с НЧ Zn по сравнению с НЧ Fe и/или НЧ сплава, при этом каждый из параметров не отличался от контроля.
Результаты иммунофлюоресцентного теста, выполненного для оценки влияния НЧ на экспрессию мембранных лимфоцитарных рецепторов, не позволили установить каких-либо различий экспрессии рецепторов основных субпопуляций Т-лимфоцитов (СD4+ и СD8+) под влиянием НЧ. При инкубации с НЧ Си (концентрация 0,01 мкг/мл) количество лимфоцитов, экспрессиру-ющих CD4+ и CD8+, не отличалось от контроля (33,5+1,96% против 30,8+1,12% и 24,5+3,08% против 25,75+1,96% соответственно). Выявлено статистически достоверное повышение экспрессии рецептора к Fc-фрагменту IgG, характерного для NК-клеток (CD16+) с 18,3+0,42% в контрольных
пробах до 22,3+0,42% после инкубации с НЧ Cu (Р<0,05).
Действие НЧ Zn на эти характеристики было исследовано при более высокой концентрации (1 мкг/мл), статистически значимых различий не было получено ни по одному из лимфоцитарных рецепторов: (CD4+: опыт 31,4+2,64%, контроль 33,6+1,98%; CD8+: 31,4+2,42% и 28,2+2,42%; CD16+: 14,25+1,12% и 15,5+1,68%; CD56+: 6,0+0,56% и 6,5+0,56% соответственно).
Результаты теста спонтанного розеткообразова-ния с эритроцитами барана и мыши говорят об отсутствии статистически значимого влияния на экспрессию рецепторов лимфоцитов, ответственных за адгезию к гетерологичным эритроцитам, вне зависимости от концентрации НЧ, хотя в ряде случаев наблюдались индивидуальные разнонаправленные изменения количества розеткообразующих клеток, обуславливающие выраженную вариабельность данных.
Результаты определения влияния НЧ на экспрессию моноцитарных рецепторов представлены в таблице 2, из которой видно, что повышение экспрессии HLA-DR наблюдается при действии НЧ Fе, при этом данный показатель превышает не только контроль, но и результат пробы, инкубированной с НЧ Zn. Влияния инкубации с НЧ на экспрессию рецептора CD14 не выявлено.
Таблица 2
Влияние инкубации с НЧ металлов (1 мкг/мл) на экспрессию мембранных рецепторов моноцитов
Показатели (%) Пробы (n=8)
Контроль НЧ Zn НЧ Fe НЧ сплава
CD14 14,4+0,62 14,8+1,2 15,8+0,8 14,2+0,8
HLA-DR 13,13+0,5 13,0+1,0** 15,8+0,5* ** 14,2+0,73
Примечание. * - статистически достоверные отличия от контроля по г-критерию знаков; ** - статистически достоверные различия в зависимости от вида НЧ по 2-критерию знаков
Результаты определения уровней цитокинов в супернатантах 24-часовых культур МНК показали, что в целом при инкубации с НЧ металлов статистически достоверных различий продукции цито-кинов не выявляется. Например, уровень TNF-a (фактора некроза опухоли) в контроле составил 94,16+11,2, а при инкубации с НЧ Zn 103,3 + 9,9 пг/мл; данные по уровню IL-10 8,17+2,62 и 20,05+6,54 пг/мл соответственно. По остальным исследованным цитокинам наблюдалась сходная картина. Вариабельность данных внутри каждой группы значительна, различия статистически недостоверны. Тем не менее, при раздельном анализе проб с исходно низкой (группа I) и высокой (группа II) спонтанной продукцией отмечены некоторые статистически значимые различия в зависимости от инкубации с НЧ (табл. 3).
Так, в 7 пробах из 13 наблюдался исходный незначительный спонтанный уровень TNF-a (что является нормальным); в этой группе (I) инкубация с НЧ Zn и НЧ Fe вызывает повышение его продукции в 3,3 и 3,5 раза соответственно. В остальных 6 пробах, где был отмечен исходно высокий уровень спонтанной продукции этого цитокина (II), инкубация с НЧ вызывала его снижение, статистически значимое для НЧ Fe; при инкубации этих проб с НЧ Zn отмечено уменьшение продукции TNF-a в 4 пробах из них на 20-97%. При инкубации МНК с НЧ Zn наблюдалась статистически значимая стимуляция продукции IL-1a в пробах с низкой базальной продукцией (I) этого цитокина (в 4,8 раз) и отсутствие влияния при высокой продукции (II). Уровни IL-10 при инкубации МНК с НЧ Zn возрастали в 9 пробах из 12, хотя и незначительно,
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
Таблица 3
Влияние инкубации МНК с НЧ металлов (1 мкг/мл) на продукцию цитокинов в зависимости
от ее базального уровня
Пробы (n=13) Спонтанная продукция (пг/мл)
цитокины TNF-a IL-1a
группы I II I II
Контроль Min 6,3 92 2,5 154
Max 35,4 327 80 487
M±m 14,2+4,3 187,5+34,8 39,6+13,7 380+49
НЧ Zn Min 2,2 26,8 8,9 15
Max 167,4 370 461 489
M±m 46,77+24,47 179+73,7 193+61,4* 317+70
НЧ Fe Min 6,99 12 5,3 17
Max 142,4 111 480 462
M±m 50,4+29,8 41,5+27,7* 177+104 177+125
Примечание. * - статистически достоверные отличия от контроля (Р<0,05).
и снижались в 3-х пробах. Влияние инкубации с НЧ Zn и НЧ Fe на продукцию остальных исследованных цитокинов было разнонаправленным в различных пробах и не укладывалось в какую-либо тенденцию.
Таким образом, установлено определенное влияние НЧ металлов на ряд фенотипических и функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток, регистрируемое при инкубации in vitro; при этом на многие исследованные параметры такого влияния не выявлено. Изменения иммунологических показателей в целом могут быть расценены как позитивные, хотя даже при наличии статистической достоверности они выражены существенно слабее, чем при аналогичной инкубации с иммуно-модуляторами. Среди полученных изменений отмечены: стимуляция экспрессии рецепторов CD16 на NK-лимфоцитах при действии НЧ Cu, HLA-DR на моноцитах при действии НЧ Fe; регуляторное влияние на продукцию монокинов TNF-a и IL-1a при инкубации с НЧ Fe и НЧ Zn. Сопоставление эффектов различных НЧ между собой показало, что активность кислородо-зависимых реакций в нейтрофилах при действии НЧ Zn ниже по срав-
нению с НЧ Fe и НЧ сплава, а экспрессия HLA-DR на моноцитах ниже по сравнению с НЧ Fe. По данным, полученным с помощью электронно-микроскопических методов, описанным в литературе [10], металлические НЧ могут проникать в клетки как путем фагоцитарного захвата, так и трансмем-бранно; по-видимому, при попадании в нейтрофи-лы и моноциты имеет место первый вариант, а в лимфоциты — второй. Кроме того, фиксация НЧ на мембранах клеток также может оказывать влияние на их функцию.
Заключение
Полученные нами результаты свидетельствуют об отсутствии повреждающего действия исследованных металлических наночастиц на фагоцитарное, Т- и NK-клеточное звенья иммунной системы на модели инкубации in vitro.
Авторы приносят глубокую благодарность зав. кафедрой биохимии ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет», профессору В.Б. Бородулину за любезное предоставление наноча-стиц металлов.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ЛИТЕРАТУРА
1. Сидоренко Ю.С., Златник Е.Ю., Передреева Л.В., Бородулин
B.Б. Противоопухолевое действие наночастиц металлов (экспериментальное исследование)// Известия Самарского научного центра Росс. Академии наук. - 2009. - №11(5/2). -
C.482-487.
2. Златник Е.Ю., Передреева Л.В. Влияние наночастиц металлов на опухолевый рост // Онкология - XXI век. Здоровье и образование. М-лы IV (XIII) Международной научной конференции (27.04-7.05.09). - Хошимин, Вьетнам, 2009. -С. 84-87.
3. Златник Е.Ю., Передреева Л.В. Регрессия опухоли и продолжительность жизни у мышей-опухоленосителей при введении наночастиц металлов // Известия ВУЗов, СевероКавказский регион. Естеств. науки. Клиническая и экспериментальная онкология. - 2010; спецвыпуск. - С. 94-96.
4. Златник Е.Ю., Передреева Л.В. Действие металлических наночастиц на развитие перевиваемой опухоли крыс // Вопросы онкологии. - 2011. - №57 (2). - С.27-28.
5. Златник Е.Ю., Передреева Л.В. Экспериментальное изучение влияния наноразмерных частиц металлов на опухолевый рост и костномозговое кроветворение // Бюллетень экс-
периментальной биологии и медицины. - 2012. - №153(1). -С.113-117.
6. Закора Г.И., Златник Е.Ю. Влияние наночастиц металлов на состояние культуры клеток эритромиелоза человека // Известия ВУЗов, Северо-Кавказский регион. Естеств. науки. Клиническая и экспериментальная онкология. - 2010; спецвыпуск. -С. 91-94.
7. Zlatnik E.Y., Peredreeva L.V., Zakora G.I. Antitumor effect of metallic nanoparticles. Tumor and Host: novel aspects of old problem. International Conference 21-24.09.10, Kyiv, Ukraine // Experimental oncology. - Sept. 2010. - V.32(Suppl.):85, Abstr. -P. 5.9
8. Кудрин А.В., Громова О.М. Микроэлементы в иммунологии и онкологии. - М0., 2007. - 544 с.
9. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры тканей в гематологии. - Томск, 1992. - 272 с.
10. Мильто И.В., Суходоло И.В., Миллер А.А. Электронно-микроскопическое исследование печени крыс после внутривенного введения суспензии наноразмерного магнетита // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2012. - №153(4). - С.510-513.
