CC BY
71
Медицинская Иммунология 2009, Т. 11, № 2-3, стр. 245-254 © 2009, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ДЕФЕКТ
АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ КЛЕТОК У Больных ТУБЕРКУЛЕЗОМ лЕГКИХ
Сахно Л.В., Распай Ж.М., Тихонова М.А., Никонов С.Д.1, Жданов О.А.1, Останин А.А., Черных Е.Р.
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск 1ОГУЗ Новосибирская клиническая туберкулезная больница № 1, г. Новосибирск
Резюме. В работе были исследованы фенотипические и функциональные свойства антигенпре-зентирующих клеток (АПК: моноцитов крови и генерированных in vitro макрофагов / дендритных клеток) у больных туберкулезом легких (ТБ, n = 192), различающихся по уровню пролиферативного ответа на антигены M. tuberculosis (PPD-отвечающие и PPD-анергичные пациенты, n = 118 и 74 соответственно). Установлено, что у больных ТБ изменены все три типа АПК. На уровне моноцитов это проявляется снижением экспрессии CD86 и HLA-DR молекул, 2-кратным увеличением субпопуляции CD14+CD16+ клеток, FasL+ и IL-10+ моноцитов, а также повышенной продукцией IL-10 и IL-6 в ответ на стимуляцию эндотоксином. На уровне макрофагов регистрируется дисбаланс продукции Th1/Th2-цитокинов (снижение продукции IFNy и IL-18 в сочетании с усилением продукции IL-6 и IL-10), а также снижение аллостимуляторной активности в смешанной культуре лимфоцитов. На уровне дендритных клеток это проявляется снижением количества зрелых активированных CD25+ клеток, дефицитом продукции IFNy в сочетании с повышенной способностью секретировать IL-10 и IL-6 и нарушением функциональной (аллостимуляторной) активности. При этом наиболее выраженные изменения свойств различных типов АПК регистрируются в подгруппе больных ТБ со сниженным пролиферативным ответом на PPD. Обсуждается возможная роль дисфункций АПК в нарушении антигенспецифического ответа при туберкулезной инфекции.
Ключевые слова: моноциты, макрофаги, дендритные клетки, цитокины, туберкулез легких.
Sakhno L.V., Raspay Zh.M., Tikhonova M.A., Niconov S.D., Zhdanov O.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.
A DEFICIENCY OF ANTIGEN-PRESENTING CELLS IN PATIENTS WITH PULMONARY TUBERCULOSIS
Abstract. The phenotype and functional properties of antigen-presenting cells (APCs: blood monocytes and in vitro generated macrophages/dendritic cells) were investigated in patients with pulmonary tuberculosis (TB, n = 192) with different levels of proliferative response to M. tuberculosis antigens (PPD-responsive vs PPD-anergic patients, n = 118 and 74, respectively). A functional deficiency of all 3 types of APCs was revealed in patients with TB. I.e., a monocyte disfunction was displayed by low CD86 and HLA-DR expression, 2-fold increase of CD14+CD16+ subset, high level of FasL+ and IL-10+ cells, and enhanced IL-10 and IL-6 production upon LPS-stimulation. The in vitro generated macrophages from blood monocytes challenged with GM-CSF, were characterized by shifted Th1/Th2 balance (down-regulated production of IFNy and IL-18 combined with up-regulation of IL-6 and IL-10), and reduced allostimulatory activity in mixed lymphocyte culture. The dendritic cells were characterized by decrease of mature, activated CD25+ cells, low level of IFNy production
in conjunction with enhanced capacity to produce IL-10 and IL-6, and profound reduction of functional (allostimulatory) activity. The APC disfunction of were most prominent in PPD-anergic patients. A possible role of APC disfunctions in disturbed antigen-specific T-cell response to M. tuberculosis is discussed. (Med. Immunol., vol 11, N2-3, pp 245-254)
Адрес для переписки:
Сахно Людмила Васильевна,
630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14, НИИ клинической иммунологии СО РАМН.
Тел.: (383) 228-21-01.
Факс: (383) 222-70-28.
E-mail: ct lab@mail.ru
245
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
Введение
Важную роль в генерации адекватного иммунного ответа у больных туберкулезом легких (ТБ) играют антигенпрезентирующие клетки (АПК), представленные моноцитами, макрофагами (МФ) и дендритными клетками (ДК). Циркулирующие в периферической крови моноциты являются гетерогенной популяцией и различаются по морфологии, экспрессии мембранных антигенов и функциональным свойствам [26]. Большинство из них несут на своей поверхности высокий уровень CD14 (рецептор к липополисахариду) и не экспрессируют CD16 ^су рецептор III типа) [12]. В то же время существует минорная субпопуляция моноцитов, которые одновременно коэкспрессируют CD14 и СD16 молекулы [28]. В крови здоровых доноров количество таких клеток составляет около 10% [29].
В сравнении с CD14+CD16 моноцитами отличительной особенностью CD14+CD16+ клеток является более высокий уровень экспрессии мРНК и продукции TNFa в ответ на стимуляцию липополисахаридом (ЛПС) [4], вследствие чего их стали обозначать как «провоспалительные» моноциты [29]. Действительно, увеличение доли CD14+CD16+ моноцитов выявлено при многих инфекционных и воспалительных заболеваниях, включая ВИЧ-инфекцию, сепсис и системные аутоиммунные заболевания [7, 17, 27]. В то же время сведения о количественном содержании и функциональной активности субпопуляции CD14+CD16+ моноцитов при туберкулезе легких практически отсутствуют.
Хорошо известно, что инфицирование макрофагов и дендритных клеток M. tuberculosis сопровождается изменением их функциональных свойств [9, 10, 13]. Однако дефект данных типов АПК может быть обусловлен не только прямым воздействием микобактерии, но и нарушением процесса генерации МФ и ДК из моноцитов, которые рекрутируются в очаг туберкулезной инфекции из периферической крови больного. Функциональные свойства моноцитов и получаемых из них МФ и ДК у больных ТБ, особенно с учетом выраженности антигенспецифического Т-клеточного ответа, остаются во многом не исследованными.
Исходя из этого, настоящее исследование было предпринято с целью анализа фенотипических и функциональных свойств моноцитов крови, а также генерированных МФ/ДК и выяснения возможной роли дисфункций АПК в нарушении антигенспецифического ответа у больных туберкулезом легких.
Материалы и методы
В исследование были включены 192 больных туберкулезом легких: 125 мужчин (65,1%) и 67 женщин (34,9%) в возрасте от 20 до 64 лет, включая
68 пациентов (35,4%) с фиброзно-кавернозной, 100 пациентов (52,1%) с инфильтративной и 24 пациента (12,5%) с диссеминированной формами ТБ. Активное бацилловыделение (БК+) было выявлено у 123 больных (64,1%). При лабораторном исследовании лекарственная резистентность регистрировалась у 69 из 192 пациентов (35,9%). Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия. Контрольную группу составили 90 здоровых доноров крови, сопоставимых по полу и возрасту.
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина и культивировали (0,1 х 106/лунку) в 96-луночных планшетах для иммунологических исследованийвсредеRPMI-1640 («Sigma-Aldrich», США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров крови IV (АВ) группы при 37 °С в СО2-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали туберкулиновый очищенный белковый дериват (PPD) в концентрации 50 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали на 6 сутки по включению 3Н-тимидина (1 мкКи на лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования. В зависимости от уровня пролиферативного ответа МНК на PPD больные были разделены на 2 подгруппы: подгруппа 1 — с сохранным (> 12500 имп/мин; n = 118) и подгруппа 2 — со сниженным (< 12500 имп/мин; n = 74) PPD-ответом.
Моноциты выделяли в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) путем прилипания к пластику МНК (3 х 106 клеток/мл) в присутствии 5% сыворотки АВ (IV) группы. Макрофаги генерировали из прилипающей фракции МНК в 6-луночных планшетах в среде RPMI-1640 дополненной 5% аутоплазмы, 2% сыворотки крови плодов коровы (FCS, Биолот, Санкт-Петербург), 2-меркаптоэта-нолом (5 х 10-5М, Serva), пируватом Na (2 х 10-3М, «Sigma-Aldrich»), 1% раствором незаменимых аминокислот в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF; 50 нг/мл, «Sigma-Aldrich») в течение 6 суток. По окончании культивирования отделение МФ от пластиковой поверхности осуществляли с использованием 0,25% раствора трип-сина/ЭДТА. Полученные МФ 2-кратно отмывали средой RPMI-1640, дополненной 5% FCS.
ДК также генерировали из прилипающей фракции МНК в течение 4 суток в среде RPMI-1640 с 5% FCS в присутствии GM-CSF 40 нг/мл и IFNa (Роферон-А, Roche, Швейцария) 1000 Ед/мл с последующим дозреванием в течение 24 ч в присутствии 10 мкг/мл липополисахарида (ЛПС E. coli 0111:B4, «Sigma-Aldrich») [5, 16, 18, 21].
246
2009, Т. 11, № 2-3
Антигенпрезентирующие клетки при туберкулезе легких
ТАБЛИЦА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
Маркеры Количество моноцитов (%)
Здоровые доноры Больные ТБ
В целом по группе Подгруппа № 1 Подгруппа № 2
CD14+CD16+ 8,9±1,2 (15) 18,0±1,2 (65)* 15,4±1,0 (39)* 21,4±2,4 (26)*#
FasL+ 5,6±0,9 (17) 25,6±4,1 (29)* 21,3±4,6 (13)* 29,1±6,3 (16)*
HLA-DR+ 84,1±1,5 (10) 69,7±1,8 (72)* 69,8±2,2 (50)* 69,1±3,7 (22)*
CD86+ 66,1±4,5 (9) 48,3±4,9 (18)* 48,6±5,4 (12)* 40,5±4,6 (6)*
Примечание. Данные представлены в виде M±S.E. * - ри < 0,05 - достоверность различия показателей по сравнению с донорами; # - ри < 0,05 - достоверность различий в подгруппах у больных ТБ с сохранным (№ 1) и сниженным (№ 2) PPD-ответом. Здесь и далее в таблицах: U - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни; в скобках -количество наблюдений.
Относительное содержание моноцитов, экспрессирующих HLA-DR, CD86 и FasL, определяли методом проточной цитофлюориметрии (FACS Calibur, Becton Dickinson, США) с использованием соответствующих FITC-меченых моноклональных антител (Becton Dickinson). Для определения субпопуляции CD14+CD16+ моноцитов использовали FITC-меченые анти-CD16 антитела (Сорбент, Москва) и фикоэритрин (PE)-меченые анти-CD14 антитела (Phar-Mingen, США). Оценку поверхностных маркеров МФ и ДК проводили c использованием анти-CD14, -CD16, -HLA-DR, -CD86, -CD25, -CD83 антител, меченых различными флюорохромами (Сорбент и PharMingen).
Внутриклеточную экспрессию TNF и IL-10 также проводили методом проточной цитофлюо-риметрии, используя пермеабилизации клеток. Относительное количество клеток, содержащих внутриклеточные детерминанты TNFa/p и IL-10, оценивали в моноцитарном гейте с помощью FITC-меченых антител 4F2, любезно предоставленных кандидатом медицинских наук С.В. Киселевым (США) и PE-меченых анти-^-10 антител (Becton Dickinson).
Для того чтобы оценить секрецию цитокинов, моноциты снимали с пластиковой поверхности скребком, однократно отмывали и культивировали в 96-луночных планшетах (0,1 х 106/лун-ку) 48 ч в стандартной среде с добавлением 10% FCS. Концентрацию IL-6, IL-10 в супернатантах определяли методом иммуноферментного анализа, используя соответствующие тест-системы («Вектор-Бест», Новосибирск).
Продукцию TNFa, IL-6, IL-10, IFNy и IL-18 оценивали в супернатантах 6-суточных культур МФ, а также в 24-часовых супернатантах МФ, не стимулированных и стимулированных ЛПС в дозе 10 мкг/мл. Концентрацию цитокинов определяли, используя соответствующие ИФА тест-системы производства «Вектор-Бест», Новосибирск (TNFa, IFNy, IL-6, IL-18) и «Цитокин»,
Санкт-Петербург (IL-10). Также определяли концентрацию цитокинов в супернатантах 5-суточных культур ДК.
Аллостимуляторную активность МФ и ДК оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании МНК доноров (0,1 х 106/лунку) в 96-луночных круглодонных планшетах в присутствии аллогенных МФ здоровых доноров или больных ТБ в соотношении 10:1. Интенсивность пролиферации оценивали на 5 сутки радиометрически по включению 3Н-тимидина. Индекс стимуляции в СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии МФ к уровню спонтанной пролиферации МНК.
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ «Statistica 6.0» для Windows. Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05. Данные приведены в виде среднего арифметического значения (М) и стандартной ошибки среднего (S.E.), а также в виде медианных значений (Median).
Результаты
Для оценки моноцитарного звена исследовали фенотипические маркеры, а также внутриклеточную продукцию TNF и IL-10 моноцитами крови больных ТБ и здоровых доноров (табл. 1). В группе доноров количество CD14+CD16+ моноцитов варьировало от 2 до 17,3%, составляя в среднем 8,9±1,2%, что согласуется с данными литературы [29]. Относительное содержание CD14+CD16+-моноцитов у больных ТБ варьировало от 4 до 54% и в среднем в 2 раза превышало нормативный уровень. При этом наиболее выраженное увеличение доли CD14+CD16+ моноцитов отмечалось в подгруппе больных
247
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
со сниженным PPD-ответом. Частотный анализ показал, что в этой подгруппе у 61,5% больных (16/26) индивидуальные значения содержания CD14+CD16+ моноцитов выходили за верхнюю границу нормативного диапазона (> 17%), что достоверно превышало частоту встречаемости таких больных в оппозитной подгруппе с сохранной PPD-реактивностью (25,6%, 10/39, рТМФ = 0,04).
В целом по группе обследованных больных ТБ регистрировалось значительное увеличение количества FasL-позитивных клеток, а также достоверное снижение числа моноцитов, экспрессирующих HLA-DR- и CD86-антигены. При этом статистически значимых различий по этим показателям в подгруппах больных, оппозит-ных по уровню антигенспецифического ответа на PPD, выявлено не было. Поскольку CD16 и FasL относятся к активационным маркерам, увеличение в циркуляции моноцитов, экспрессирующих CD16 и FasL, может указывать на их активацию. В свою очередь, уменьшение доли HLA-DR+ и CD86+ моноцитов свидетельствует о нарушении экспрессии костимуляторных молекул, что может быть причиной дефекта анти-генпрезентирующей функции моноцитов.
Анализ внутриклеточной экспресии цитокинов показал (рис. 1), что по сравнению с донорами у больных ТБ регистрируется 3-кратное снижение относительного количества моноцитов, продуцирующих TNFa/p (c 14,7±2,1 до 4,9±1,1%), а также увеличение числа клеток с внутриклеточной экспрессией IL-10 (с 1,06±0,34 до 6,6±2,7%), что четко указывает на изменение регуляторной функции моноцитов при туберкулезной инфекции. Важно отметить, что между количеством CD14+CD16+ моноцитов и процентным содержанием TNF+ моноцитов выявлялась досто-
верная обратная корреляционная зависимость (rS = -0,62; p < 0,01).
Цитокин-секреторную активность моноцитов дополнительно оценивали по продукции IL-6 и IL-10 в супернатантах 24-часовых спонтанных и ЛПС-стимулированных культурах доноров и больных ТБ, в том числе в зависимости от уровня антигенспецифического ответа на PPD. Из данных таблицы 2 видно, что по сравнению с донорами моноциты больных ТБ отличались повышенной IL-6 и IL-10-секреторной активностью при стимуляции ЛПС ^U < 0,05). При этом наиболее выраженное и статистически значимое усиление ЛПС-индуцированной продукции IL-6 и IL-10 регистрировалось в подгруппе пациентов со сниженным PPD -ответом.
Выявленные дисфункции моноцитов у больных ТБ позволяют предположить, что и свойства генерируемых из них МФ и ДК также могут быть изменены. С целью проверки данной гипотезы провели сравнительное исследование фенотипа, цитокин-секреторной и аллостиму-ляторной активности МФ/ДК здоровых доноров и больных ТБ, различающихся по уровню антигенспецифического ответа на PPD. Из данных таблицы 3 видно, что и у доноров, и у больных преобладающее большинство МФ (около 80%) экспрессировали CD14. Интересно отметить, что у больных с сохранным ответом на PPD около 50% полученных МФ экспрессировали CD16, что было достоверно выше, чем у доноров или у пациентов со сниженным PPD-ответом (29±3,8 и 30±4,2% соответственно; рU < 0,05). В то же время у пациентов с PPD-анергией обнаруживалось 2-кратное снижение доли CD86-позитивных клеток, а также умеренное, но статистически достоверное снижение количества HLA-DR+МФ,
A 18 16 14 12 5? 10 8 6 4 2 0
i-
TNF+ моноциты
Б 10 8 6
o'-
4
2
0
-I-
IL-10+ моноциты
О Доноры □ Больные ТБ
Рисунок 1. Внутриклеточная экспрессия TNF и IL-10 в моноцитах крови здоровых доноров и больных туберкулезом легких
Примечание. Представлены средние значения (M±S.E.) относительного количества моноцитов с внутриклеточной экспрессией TNFa/p (А) и IL-10 (Б) у здоровых доноров (n = 8) и больных ТБ (n = 6). * - pU < 0,05 - достоверность различий по сравнению с донорами.
248
2009, Т. 11, № 2-3
Антигенпрезентирующие клетки при туберкулезе легких
ТАБЛИЦА 2. УРОВНИ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ МОНОЦИТАМИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
Исследуемый цитокин Условия продукции Уровень продукции цитокинов (пкг/мл)
Здоровые доноры (n = 8) Больные ТБ
В целом по группе (n = 17) Подгруппа № 1 (n = 8) Подгруппа № 2 (n = 9)
IL-6 0 1509±781 2995±390 2748±756 3206±374
ЛПС 1902±720 4015±315* 3596±708 4329±146*
IL-10 0 27±17 58,6±12,8 59,2±19,4 58,0±18,1
ЛПС 70,1±40,9 201,5±44,7* 165,8±65,5 233,3±62,8*
Примечание. Представлены средние значения спонтанной (0) и ЛПС-стимулированной (ЛПС) продукции цитокинов в 24-часовых культурах моноцитов (0,1 х 106 клеток/лунку) здоровых доноров и больных ТБ легких. Подгруппы № 1 и № 2 -больные ТБ с сохранным и сниженным ответом на PPD соответственно; * - ри < 0,05 - достоверность различий средних значений по сравнению с донорами.
тогда как в подгруппе PPD-реактивных больных относительное содержание CD86+ и HLA-DR+ клеток сохранялось на уровне нормы. Таким образом, МФ, генерируемые in vitro из моноцитов больных с сохранным антигенспецифическим ответом, практически не отличаются по своему фенотипу от МФ здоровых доноров, за исключением повышенного содержания CD16+ клеток. Напротив, МФ, полученные из моноцитов PPD-анергичных больных, характеризовались количественным дефицитом клеток, экспрессирующих молекулы необходимые для эффективной презентации антигена (HLA-DR) и костиму-ляции Т-лимфоцитов (CD86).
Анализ уровня продукции цитокинов в 6-суточных культурах МФ не выявил значимых различий концентрации TNFa, IL-6 и IL-18 в подгруппах здоровых доноров и больных ТБ. Тем не менее у больных ТБ как с сохранным, так и сниженным PPD-ответом регистрировалось 10-кратное снижение уровня IFNy. Кроме того, макрофаги PPD-анергичных больных характеризовались 3-кратным увеличением уровня продукции IL-10 и достоверно отличались по этому показателю и от здоровых доноров, и от пациентов с сохранным PPD-ответом. Полученные результаты свидетельствуют о дисбалансе цитокинов, продуцируемых МФ больных ТБ, который проявляется недостаточностью продукции IFNy, участвующего в запуске и контроле воспалительных и клеточно-опосредованных иммунных реакций. Цитокиновый дисбаланс у больных с PPD-анергией дополнительно усиливается за счет повышенной секреции IL-10, что может свидетельствовать об увеличении противовоспалительного и иммуносупрессорного потенциала генерированных in vitro МФ при нарушении антигенспецифического ответа на PPD.
Оценка аллостимуляторной активности МФ показала, что пролиферативный ответ
в алло-СКЛ, индуцированный макрофагами PPD-анергичных больных, был практически в 6 раз ниже, чем в аналогичных культурах, содержащих МФ здоровых доноров ^U < 0,05). Важно отметить, что аллостимуляторная активность МФ больных с сохранных PPD-ответом не отличалась от нормативных значений.
Исследования цитокинов, которые МФ се-кретируют на этапе генерации в течение всего периода 6-суточного культивирования, были дополнены оценкой уровня спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции цитокинов в 24-часовых культурах МФ, стандартизованных по количеству клеток-продуцентов (0,05 х 106 МФ/лунку). Из данных таблицы 4 видно, что МФ, генерированные из моноцитов больных с сохранным ответом на PPD (подгруппа № 1), в целом сохраняют свою цитокин-секреторную функцию и продуцируют про- (TNFa, IL-6) и противовоспалительные (IL-10) медиаторы на уровне, сопоставимом с донорскими значениями. В то же время регистрировалось снижение интенсивности спонтанной и особенно ЛПС-стимулированной продукции IFNy. Тем не менее макрофаги PPD-отвечающих больных отличались максимально высоким уровнем спонтанной секреции IL-18, и при этом были чувствительны к стимуляции эндотоксином. Вероятно, способность клеток к продукции IL-18, выявленная в данной подгруппе больных ТБ, частично компенсирует дефицит секреции IFNy и позволяет сохранять аллостимуляторную активность МФ в СКЛ (табл. 3), а также общую PPD-реактивность МНК в культуре in vitro.
Низкая аллостимуляторная активность МФ, генерированных из моноцитов больных со сниженным ответом на PPD (табл. 3), сочеталась с наиболее выраженными нарушениями их цитокин-секреторной функции, которые проявлялись снижением спонтанной
249
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
и ЛПС-индуцированной продукции IFNy и IL-18 в комбинации с повышенным уровнем продукции IL-6 (спонтанно) и IL-10 (в ответ на ЛПС).
Был проведен также сравнительный анализ фенотипических и функциональных свойств ДК, генерированных из моноцитов крови доноров и больных ТБ (табл. 5). Несмотря на отсутствие значимых различий в количестве зрелых CD83+ДК в группах больных, умеренное снижение HLA-DR+ДК в сочетании с достоверным увеличением CD14-позитивных клеток и низким количеством активированных CD25+ДК у больных ТБ свидетельствует о нарушении процесса созревания/генерации ДК при туберкулезной инфекции, особенно в подгруппе PPD-ареактивных больных.
Оценка содержания цитокинов в супернатантах 5-суточных культур ДК показала, что по сравнению с донорами ДК генерированные из моноцитов больных с сохранным PPD-ответом отличались повышенной продукцией IL-6 и резко сниженным уровнем синтеза IFNy. В оппозит-ной подгруппе PPD-анергичных больных также отмечался глубокий дефицит продукции IFNy. Однако в этом случае генерируемые ДК, так же как и исходная популяция моноцитов (табл. 2) и получаемые из них макрофаги (табл. 3), характеризовались повышенной IL-10-секреторной активностью (p < 0,05).
При исследовании аллостимуляторной активности было обнаружено, что способность ДК больных ТБ стимулировать пролиферативный ответ
в СКЛ достоверно ниже, чем у ДК здоровых доноров. Характерно, что наиболее глубокий дефект аллостимуляторной активности ДК регистрировался в подгруппе PPD-анергичных пациентов.
Обсуждение
В целом полученные нами данные убедительно свидетельствуют о том, что у больных ТБ изменены все три типа АПК. На уровне моноцитов это проявляется снижением экспрессии CD86 и HLA-DR молекул, увеличением субпопуляции CD14+CD16+ клеток, FasL+ и IL-10+ моноцитов, а также повышенной продукцией IL-10 и IL-6 в ответ на стимуляцию эндотоксином. На уровне макрофагов регистрируется дисбаланс продукции Th1/Th2-^-токинов (IFNy, IL-18/IL-6, IL-10), а также снижение аллостимуляторной активности. На уровне ДК это проявляется снижением количества зрелых активированных CD25+клеток, дефицитом продукции IFNy в сочетании повышенной способностью секретировать IL-10 и IL-6 и, так же как у макрофагов, снижением аллостимуляторной активности. При этом наиболее выраженные изменения свойств различных типов АПК регистрируются в подгруппе больных ТБ со сниженным пролиферативным ответом на антигены M. tuberculosis (PPD).
Изменение фенотипических и функциональных свойств моноцитов является характерным признаком туберкулезной инфекции. Так, полученные нами данные о снижении относительного количества HLA-DR и CD86-позитивных моноцитов согласуются с данными других исследова-
ТАБЛИЦА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА МАКРОФАГОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
Показатели Здоровые доноры Больные ТБ
Подгруппа № 1 Подгруппа № 2
1. Фенотип клеток (%)
CD14+ 78±3,9 (18) 79±4,1 (11) 76±4,0 (9)
CD16+ 29±3,8 (18) 50±5,6 (11)* 30±4,2 (9)#
HLA-DR+ 91±2,2 (18) 96±1,7 (11) 80±4,8 (9)*#
CD86+ 38±4,7 (18) 31±9,4 (11) 19±3,9 (9)*
2. Продукция цитокинов (пкг/мл)
TNFa 557±95 (14) 508±120 (11) 399±83 (14)
IL-6 2119±39 (10) 1820±220 (7) 1645±291 (6)
IL-10 53±22 (13) 54±24 (10) 162±58 (7)*#
IFNy 2588±1232 (5) 315±104 (8)* 221±109 (4)*
IL-18 41±6,7 (7) 44±10 (8) 62±15 (5)
3. Аллостимуляторная активность в СКЛ
Пролиферативный ответ (имп/мин) 13798±208 (31) 10072±1158 (33) 2154±653 (10)*#
Индекс стимуляции 18,0±3,1 (31) 18,0±3,1 (33) 4,3±1,0 (10)*#
Примечание. Данные представлены в виде M±S.E. * - ри <0,05 - достоверность различий показателей по сравнению с донорами; # - рц < 0,05 - достоверность различий в подгруппах у больных ТБ с сохранным (№ 1) и сниженным (№ 2) PPD-ответом.
250
2009, Т. 11, № 2-3
Антигенпрезентирующие клетки при туберкулезе легких
ТАБЛИЦА 4. УРОВНИ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В 24-ЧАСОВЫХ КУЛЬТУРАХ МАКРОФАГОВ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
Цитокин Условия продукции Уровень продукции цитокинов (пкг/мл)
Здоровые доноры Больные ТБ
Подгруппа № 1 Подгруппа № 2
Концентрация ИВлпс Концентрация ИВлпс Концентрация ИВлпс
TNFa 0 85,4 (5) 198 (6) 295 (3)
ЛПС 940 (5) 4,5 940 (6) 4,2 814 (3) 2,3
IL-6 0 734 (7) 691 (9) 1219 (4)*
ЛПС 2180 (7) 3,0 2111 (9) 3,0 2212 (4) 1,8 *
IL-10 0 1,3 (8) 1,3 (8) 1,8 (8)
ЛПС 8,5 (8) 6,1 12,2 (8) 5,7 22,3 (8)* 7,2
IFNy 0 134 (5) 89,5 (4) 34 (3)*
ЛПС 326 (5) 2,5 80,5 (4)* 1,3* 38 (3)* 1,1 *
IL-18 0 16,9 (5) 34,4 (6)* 8,1 (3)*#
ЛПС 27,3 (5) 1,6 53,3 (6) 1,5 8,6 (3)*# 1,0
Примечание. Представлены медианные значения спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции цитокинов в 24-часовых культурах МФ (0,05 х 106 МФ/лунку) здоровых доноров и больных ТБ. ИВлпс - индекс влияния ЛПС; * - ри < 0,05 -достоверность различий средних значений по сравнению с донорами; * - ри < 0,05 - достоверность различий средних значений в подгруппах у больных ТБ с сохранным (№ 1) и сниженным (№ 2) PPD-ответом.
телей о нарушении экспрессии костимуляторных молекул на моноцитах больных ТБ [25].
Кроме того, в периферической крови больных ТБ нами выявлено увеличение относительного содержания CD14+CD16+ моноцитов, которое в наибольшей степени проявлялось у пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом. Субпопуляция СD14+СD16+ моноцитов и их свойства у больных ТБ практически не исследованы. Единственным сообщением является работа Vanham G. с соавторами, которые выявили при туберкулезной инфекции повышенную экспрессию на моноцитах Fc+R I и III типа [24]. Важно отметить, что у здоровых доноров CD14+CD16+ моноциты экспрессируют мРНК TNFa, IL-1 и IL-6, но не IL-10 [4, 29]. Кроме того, количество CD14+CD16+ моноцитов при многих заболеваниях ассоциировано с активностью воспалительного процесса [22]. Поэтому общепринятым стало мнение, что данная субпопуляция представлена клетками с провоспалительной активностью. Тем не менее результаты, полученные нами при обследовании больных ТБ, противоречат такому представлению. Так, нами выявлена обратная корреляционная взаимосвязь (rg -0,62; p < 0,01) между количеством CD14+CD16+ клеток и процентным содержанием моноцитов с внутриклеточной экспрессией TNF. Кроме того, ранее при исследовании внутриклеточной продукции IL-10 в субпопуляциях CD16+ и CD^-моно-цитов нами было показано, что у больных ТБ IL-10-позитивные клетки сосредоточены преимущественно в популяции CD16+ моноцитов,
при этом среднее количество IL-10+CD16+ клеток было значительно выше, чем у здоровых доноров (12,1±3,1 против 2,0±0,92%, ри < 0,05) [1]. Очевидно, повышенное содержание моноцитов с внутриклеточной экспрессией IL-10 (рис. 1) при туберкулезной инфекции является совокупным результатом увеличения как общего числа CD14+CD16+ моноцитов, так и доли IL-10-пози-тивных клеток среди них. Таким образом, у больных туберкулезом CD14+CD16+ моноциты, по-видимому, представляют субпопуляцию клеток с противовоспалительной/иммуносупрессорной активностью.
Подтверждением иммуносупрессорных свойств моноцитов у больных ТБ является их повышенная способность к продукции IL-6 и IL-10 в ответ на стимуляцию эндотоксином (табл. 2). При этом в наибольшей степени такая функциональная активность моноцитов была характерна для пациентов со сниженным PPD-ответом. Усиление супрессорной активности моноцитов при туберкулезной инфекции является известным фактом и активно обсуждается в качестве одной из причин нарушения иммунного ответа на антигены M. tuberculosis [8, 19, 25].
Одним из открытых остается вопрос, с чем связано увеличение числа CD14+CD16+ моноцитов у больных ТБ. В литературе имеются данные, что появление CD16-антигена на моноцитах крови индуцируется определенными цитокинами (TGFp и IL-10) [29]. Эти же цитокины активируют моноциты/макрофаги по альтернативному пути, в результате чего клетки приобретают
251
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
ТАБЛИЦА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
Показатели Здоровые доноры Больные ТБ
Подгруппа № 1 Подгруппа № 2
1. Фенотип клеток (%)
CD14+ 8,7±1,4 (18) 17,2±2,7 (28) * 30,0±5,4 (10)*#
CD25+ 25,1±3,5 (18) 8,8±1,3 (28) * 12,1±2,9 (10)*
HLA-DR+ 90,7±3,6 (18) 83,3±3,7 (28) 77,3± 5,8 (10)
CD83+ 29,4±2,9 (18) 34,2±3,7 (28) 27,8±3,4 (10)
2. Продукция цитокинов (пкг/мл)
TNFa 818±63 (13) 945±51 (14) 912±45 (7)
IL-6 9767±1245 (20) 13468±859 (35)* 10685±1953 (8)
IL-10 73±14,8 (8) 191±84 (11) 421±107 (7)*
IFNy 111±59,8 (13) 19,5±2,1 (23)* 13,9±3,7 (6)*
IL-18 6,7±3,0 (19) 20,0±6,7 (35) 26,7±21,5 (8)
3. Аллостимуляторная активность в СКЛ
Пролиферативный ответ (имп/мин) 12113±1263 (24) 6173±1126 (31)* 1983±366 (24)*#
Индекс стимуляции 11,0±0,8 (24) 8,6±1,2 (31)* 4,0±0,7 (24)*#
Примечание. Данные представлены в виде M±S.E. * - ри < 0,05 - достоверность различий показателей по сравнению с донорами; # - рц < 0,05 - достоверность различий в подгруппах у больных ТБ с сохранным (№ 1) и сниженным (№ 2) PPD-ответом.
противовоспалительные/иммуносупрессорные свойства [11, 23]. Поскольку инфицирование АПК M. tuberculosis сопровождается запуском продукции TGFp и IL-10 [6, 13, 20], а развитие туберкулезной инфекции сопряжено с Th1^Th2 переключением [16, 25], то увеличение популяции CD14+CD16+ моноцитов у больных ТБ, возможно, является результатом активации моноцитов в условиях сдвига цитокинового баланса в сторону противовоспалительных/иммуносу-прессорных медиаторов.
Выявленные дисфункции циркулирующих моноцитов у больных ТБ позволили предположить, что и свойства получаемых из них МФ и ДК также могут быть изменены. Действительно, нами показано, что МФ больных ТБ отличаются от клеток здоровых доноров по целому комплексу фенотипических и функциональных признаков, которые четко ассоциируются с выраженностью антигенспецифического ответа на PPD. Так, например, МФ, полученные из моноцитов PPD-анергичных больных, характеризовались количественным дефицитом клеток, экспрессирующих HLA-DR и костимуляторные молекулы (CD86). Вне зависимости от уровня PPD-ответа МФ больных ТБ отличались низким уровнем продукции IFNy, а у PPD-анергичных пациентов — в сочетании с повышенной IL-10-секреторной активностью. Пролиферативный ответ в алло-СКЛ, индуцированный макрофагами PPD-анергичных больных, был достоверно ниже, чем в аналогичных куль-
турах, содержащих МФ здоровых доноров или PPD-реактивных пациентов (табл. 3).
В популяции ДК, генерированных из моноцитов крови больных ТБ, нами также были выявлены фенотипические отличия (очевидно, связанные с задержкой созревания/генерации ДК), а также изменения их функциональных свойств, которые проявлялись дисбалансом продукции ТЫ/^2-цитокинов и низкой аллостимулятор-ной активностью (табл. 5). Важно отметить, что отдельные нарушения ДК четко ассоциировались с угнетением антигенспецифического ответа, поскольку выявлялись или были более выражены в подгруппе больных с PPD-анергией.
Таким образом, общим функциональным дефектом всех трех проанализированных нами типов АПК (циркулирующих моноцитов и генерированных из них МФ/ДК) является нарушение их цитокин-секреторной активности: дефицит продукции IFNa в сочетании с повышенной способностью секретировать IL-10 и IL-6.
Общепризнанно, что уничтожение внутриклеточных микроорганизмов (например, M. tuberculosis) реализуется с вовлечением ТЫ-кле-ток, в то время как элиминация внеклеточных патогенов осуществляется с участием ^2-клеток. Поэтому факторы, которые регулируют поляризацию иммунных реакций, являются определяющими для формирования адекватного иммунного ответа по Th1- или ^2-направлению. В этом контексте дисбаланс продукции ТЫ/1Ъ2-цитокинов (IFNy, IL-18/IL-6, IL-10), который характерен для
252
2009, Т. 11, № 2-3
Антигенпрезентирующие клетки при туберкулезе легких
АПК больных ТБ, по-видимому, является одной из причин неэффективности антигенспецифического ответа при туберкулезной инфекции (PPD-анергии). Действительно, хорошо известно, что IL-6 способен вызывать поляризацию наивных CD4+Т-лимфоцитов в сторону Th2, а IL-10 является ингибитором Th1-клеток [10]. В качестве дополнительного механизма развития PPD-анергии у больных ТБ ответа можно также рассматривать и снижение экспрессии HLA-DR и костимуля-торных молекул на АПК, что приводит к нарушению их антигенпрезентирующей функции. Именно в подгруппе PPD-анергичных больных нами было выявлено наиболее глубокое угнетение ал-лостимуляторной активности МФ/ДК.
Тем не менее, снижение продукции IFNy было характерно для всех больных ТБ легких независимо от уровня PPD-ответа. Можно предположить, что нарушение антигенспецифического ответа у больных ТБ может быть связано не только с дефицитом продукции ТЫ-цитокинов, но и с приобретением толерогенных свойств АПК (МФ/ДК), например, через аутокринные механизмы под влиянием активно продуцируемого ими IL-10. Известно, что толерогенные ДК способствуют генерации регуляторных CD4+Т-клеток с супрессорной активностью (Treg) [14]. Действительно, ранее нами было показано, что у больных ТБ с PPD-анергией повышено содержание циркулирующих CD4+CD25+Тreg, при этом между уровнем PPD-ответа и количеством CD4+CD25+Т-клеток регистрировалась сильная обратная корреляционная связь (rS = -0,81; p < 0,01) [2].
В целом полученные данные, а также результаты проведенных нами ранее исследований свидетельствуют о том, что в основе неэффективного иммунного ответа на антигены M. tuberculosis (PPD-анергии), который обнаруживается примерно у 40% больных туберкулезом легких, лежат комплексные механизмы, связанные не только с повышенным апоптозом/анергией Т-клеток [3] или генерацией Treg [2], но и с нарушением функциональной активности АПК (моноцитов, МФ, ДК). В настоящей работе мы исследовали МФ/ДК, которые не имели непосредственного контакта с патогенном, а были получены в культуре in vitro из моноцитов периферической крови больных ТБ. Поэтому выявленные дисфункции МФ/ДК, скорее всего, являются результатом изменения свойств циркулирующих моноцитов, нежели следствием инфицирования клеток M. tuberculosis. Полученные результаты отражают общую направленность возможных нарушений АПК при ТБ, но не претендуют на исчерпывающее представление о патогенезе развития дисфункций АПК в очаге туберкулезного поражения. Можно полагать, что изменения АПК,
формирующиеся непосредственно в патологически измененной ткани легкого, носят более выраженный характер, чем те, что выявлены нами на основании экспериментов in vitro.
Список литературы
1. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Кожевников В.С., Сенюков В.В., Пронкина Н.В., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Фенотипическая и функциональная характеристика моноцитов у больных туберкулезом легких // Мед. иммунол. — 2005. — Т. 7, № 1. — С. 49-56.
2. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Курганова Е.В., Шевела Е.Я., Никонов С.Д., Жданов О.А., Мостовая Г.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Т-клеточная анергия в патогенезе иммунной недостаточности при туберкулезе легких // Пробл. туб. — 2004. — № 5. - С. 23-27.
3. Черных Е.Р., Сахно Л.В., Хонина Н.А., Тихонова М.А., Кожевников В.С., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А. Субпопуляционная принадлежность Т-клеток, подверженных анергии и апоптозу, у больных туберкулезом легких // Пробл. туб. — 2002. — № 7. — С. 43-48.
4. Belge K.U., Dayyani F., Horelz A., Siedlar M., Frankenberger M., Frankenberger B., Espevik T., Ziegler-Heitbrock L. The proinflammatory CD14+CD16+ DR++ monocytes are a major source of TNF // J. Immunol. — 2002. — Vol. 168. — P. 3536-3542.
5. Bella S.D., Nicola S., Riva A., Biasi N.M., Clerici M., Villa M.L. Functional repertoire ofdendritic cells generated in granulocyte macrophage-colony stimulating factor and interferon-a // J. Leukoc. Biol. — 2001. — Vol. 75. — P. 106-116.
6. Beltan E., Horgen L., Rastogi N. Secretion of cytokines by human macrophages upon infection by pathogenic and non-pathogenic mycobacteria // Microb. Pathog. — 2000. — Vol. 28. — P. 313-318.
7. Dayyani F., Belge K.U., Frankenberger M., Mack M., Berki T., Ziegler-Heitbrock L. Mechanism of glucocorticoid-induced depletion of human CD14+CD16+ monocytes // J. Leukoc. Biol. —
2003. — Vol. 74. — P. 33-39.
8. Fietta A., Meloni F., Francioli C., Morosini M., Bulgheroni A., Casali L., Gialdroni G.G. Virulence of Mycobacterium tuberculosis affects interleukin-monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-10 production by human mononuclear phagocytes // Int. J. Tissue React. — 2001. — ЛЫ. 23. — P. 113-125.
9. Geijtenbeek T.B.H., van Vliet S.J., Koppel E.A., Sanchez-Hernandez M., Vanden-broucke-Grauls C.M.J.E., Appelmelk B., van Kooyk V. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function // J. Exp. Med. — 2003. — Vol. 197. — P. 7-17.
253
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
10. Giacomini E., Iona E., Ferroni L., Miettinen M., Fattoni L., Orefici G., Julkunen I., Coccia E.M. Infection of human macrophages and dendritic cells with Mycobacterium tuberculosis induces a differential cytokine gene expression that modulates T-cell response // J. Immunology. — 2001. -Vol. 166. - P. 7033-7041.
11. Gordon S. Alternative activation of macrophages // Immunology. — 2003. — ЛЫ. 3. — P. 23-35.
12. Grage-Griebenow E., Lorenzen D., Fetting R., Flad H.D., Ernst M. Phenotypical and functional characterization of Fcy receptor I (CD64)-negative monocytes, a minor human monocyte subpopulation with high accessory and antiviral activity // Eur. J. Immunol. — 1993. —Vol. 23. — P. 3126-3135.
13. Hickman S.P., Chan J., Salgame P. Mycobacterium tuberculosis induces differential cytokine production from dendritic cells and macrophages with divergent effects on naive T-cell polarization // J. Immunol. — 2002. — Vol. 168. — P. 4636-4642.
14. Jonuleit H., Schmitt E., Schuler G., Knop J., Enk A.H. Induction of Interleukin 10-producing, nonproliferating CD4 T-cells with regulatory properties by repetitive stimulatioN with allogeneic immature human dendritic cells // J. Exp. Med. —
2000. — Vol. 192. — P. 1213—1222.
15. Luft T., Pang K.C., Thomas E., Hertzog P., Hart D.N., Trapani J., Cebon J. Type I IFNs enhance the terminal differentiation of dendritic cells // J. Immunol. — 1998. — Vol. 161. — P. 1947-1953.
16. Nagabhushanam V, Solache A., Ting L.-M., Escaron C.J., Zhang J.Y., Ernst J.D. Innate inhibition of adaptive immunity: Mycobacterium tuberculosis-induced IL-6 inhibits macrophage responses to IFNy // J. Immunol. — 2003. — Vol. 171. — P. 4750-4757.
17. Nockher W.A., Scherberich J.E. Expanded CD14+CD16+ monocyte subpopulation in patients with acute and chronic infections undergoing hemodialysis // Infect. Immun. — 1998. — Vol. 66. — P. 2782-2790.
18. Parlato S., Santini S.M., Lapenta C., Pucchio T.D., Logozzi M., Spada M., Giammarioli A.M., Malorni W., Eais S., Belardelli F. Expression of CCR-7, MIP-3P and Th1 chemokines in type I IFN-induced monocyte-derived dendritic cells — importance for the rapid acquisition of potent migratory and functional activities // Blood. —
2001. —Vol.198. — P. 3022-3029.
19. Pereira C.B., Palaci M., Leite O.H., Duarte A.J., Benard G. Monocyte cytokine secretion in patients with pulmonary tuberculosis differs from that of healthy infected subjects and correlates with clinical manifestations // Microbes. Infect. — 2004. — Vol. 6. — P. 25-33.
20. Rojas R.E., Balaji K.N., Subramanian A., Boom WH. Regulation of human CD4(+) alphabeta
T-cell-receptor-positive (TCR(+)) and gammadelta TCR(+) T-cell responses to Mycobacterium tuberculosis by interleukin-10 and transforming growth factor beta // Infect. Immun. — 1999. — Vol. 67. — P. 6461-6472.
21. Santini S.M., Pucchio T.D., Lapenta C., Parlato S., Logozzi M., Belardelli F. A new type IFN-mediated pathway for the rapid differentiation of monocytes into highly active dendritic cells // Stem. cells. — 2003. — Vol. 21. — P. 357-362.
22. Scherberich J.E., Nockher W.A. CD14++ monocytes, CD14+/CD16+ subset and soluble CD14 as biological markers of inflammatory system diseases and monitoring immunosuppressive therapy // Scand. J. Immunol. — 2002. — Vol. 55. — P. 629-638.
23. Tzachanis D., Berezovskaya A., Nadler L.M., Boussiotis V.A. Blockade of B7/CD28 in mixed lymphocyte reaction cultures results in the generation of alternatively activated macrophages, which suppress T-cell responses // Blood. — 2002. — ЛЫ. 99. — P. 1465-1473.
24. Vanham G., Edmonds K., Qing L., Hom D., Toossi Z., Jons B., Daley C.L., Huebler B., Kestens L., Gigase P., Ellner J.J. Generalized immune activation in pulmonary tuberculosis: co-activatin with HIV infection // Clin. Exp. Immunol. — 1996. — Vol. 103. — P. 30-34.
25. Vanham G., Toossi Z., Hirsch C.S., Wallis R.S., Schwander S.K., Rich E.A., Ellner J.J. Examining a paradox in the pathogenesis of human pulmonary tuberculosis: immune activation and suppression/ anergy // Tubercle and Lung Disease. — 1997. — Vol. 78. — P. 145-158.
26. Wang S.Y, Mak K.L., Chen L.Y, Chou M.P., Ho C.K. Heterogeneity of human blood monocytes: two subpopulations with different sizes, phenotypes and function // Immunol. — 1992. — Vol. 77. — P. 298-303.
27. Wijngaarden S., van RooN J.A.G., Bijlsma J.WJ., van de Winkel J.G.J., Lafeber F.P.J. Fcy receptor expression levels on monocytes are elevated in rheumatoid arthritis patient with high erythrocyte sedimentation rate who do not use antirheumatic drugs // Rheumatol. — 2003. — Vol. 42. — P. 681-688.
28. Ziegler-Heitbrock H.W, Fingerle G., Strobel M., Schraut W., Stelter F., Schutt C., Passlick B., Pforte A. The novel subset of CD14+/ CD16+ blood monocytes exhibits features of tissue macrophages // Eur. J. Immunol. — 1993. — Vol. 23. — P. 2053-2058.
29. Ziegler-Heitbrock H.WL. Heterogeneity
of human blood monocytes: CD14+CD16+
subpopulation // Immunol. Today. — 1996. — Vol. 17. — P. 424-428.
поступила в редакцию 09.02.209 отправлена на доработку 14.02.2009 принята к печати 02.03.2009
254
