CC BY
21УДК 502.51:581.526.3
ВЛИЯНИЕ МОЧЕВИНЫ НА СОДЕРЖАНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ И УРЕАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ В ЛИСТЬЯХ ЭЛОДЕИ*
© 2012 г. М.Г. Малева, Г.Г. Борисова, Н.В. Чукина, Г.Ф. Некрасова
Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина, г. Екатеринбург
Ключевые слова водные объекты, загрязнение, мочевина, водные макрофиты, Elodea canadensis, фотосинтетические пигменты, уреазная активность.
Обсуждаются экологические аспекты влияния мочевины на состояние гидроценозов и функционирование гидробионтов. В модельных условиях при инкубировании элодеи в присутствии мочевины показано, что низкие концентрации мочевины стимулировали накопление фотосинтетических пигментов и активизировали работу фермента уреазы, в то время как высокие концентрации оказывали подавляющее действие на эти процессы. Обоснована необходимость контроля за потоками мочевины и других азотсодержащих соединений в водные объекты.
Введение
В условиях существенного роста антропогенной нагрузки на водные экосистемы все более актуальной становится проблема адаптации гидробионтов к поллютантам. Особое место среди них занимает мочевина (карбамид). Мочевина может накапливаться в водоемах и водотоках в результате естественных биохимических процессов. Она продуцируется растениями, грибами, бактериями и другими гидробионтами как продукт связывания аммиака, образующегося в процессе диссимиляции белков. Мочевина образуется также при распаде отмерших организмов как следствие микробиологических процессов метаболизации пуриновых и пиримидиновых оснований до мочевины и аммиака. Значительные количества мочевины поступают в водные объекты с хозяйственно-бытовыми сточными водами, с коллекторно-дренажными водами, а также с поверхностным стоком при использовании ее в качестве азотного удобрения.
В поверхностных слоях количество мочевины составляет, как правило, 20-30 %, а в придонных 60-80 % от суммы органического азота [1]. Разложение мочевины в водной среде осуществляется, главным образом, в
*Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (ГК № П1301).
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
результате деятельности ферментов бактерий и растений, особой активностью из которых обладает уреаза. Этот фермент катализирует гидролиз мочевины до углекислого газа и аммиака, который в последующем участвует в аминировании кетокислот или окисляется до нитритов и нитратов.
Благодаря своей доступности и распространенности, мочевина может служить дополнительным источником азота и углерода в гидроценозах. Это особенно важно для погруженных водных растений, обитающих в толще воды при пониженной освещенности и невысокой концентрации неорганического углерода [2]. В то же время избыточные количества мочевины могут влиять как на целые растительные сообщества, так и на отдельные виды макрофитов.
Известно, что высокие концентрации мочевины вызывают физиологические расстройства и снижение продуктивности у высших растений [3], приводят к диссоциации фикобилиновых пигментов на субъединицы у разных видов синезеленых и красных водорослей [4]. Имеются данные о том, что при залповом загрязнении гидроценозов мочевиной изменяется качество воды, ухудшается кислородный режим водоемов, происходит смена видового состава популяций [1, 5]. Вместе с тем способы утилизации экзогенной мочевины растениями и механизмы ее влияния на структурно-функциональные показатели гидробионтов изучены недостаточно.
Цель исследований - выявление ответных реакций водных макрофитов (на примере элодеи) на действие мочевины в градиенте концентраций.
Объекты и методы исследований
Объектом исследований была элодея канадская (Elodea canadensis Michx.), собранная в р. Сысерть Свердловской области в период цветения макрофита. Исследования проводили в модельных условиях. Элодею в течение 5 сут. инкубировали на среде Арнона с различными концентрациями мочевины: 0 (контроль), 100, 500 и 1000 мг/л при естественной освещенности.
Содержание фотосинтетических пигментов в листьях элодеи определяли спектрофотометрически. Расчет хлорофиллов проводили по формуле Vernon, содержание каротиноидов рассчитывали по Wettstein [6]. Для экстрагирования пигментов из листьев использовали 80 % водный раствор ацетона.
Для определения уреазной активности 0,5 г сырых листьев гомогенизировали в 5 мл охлажденного до 2-4 °С 0,03 М K/Na-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1 мМ ЭДТА -Na и 2 % поливинилпирролидон. Активность уреазы (EC 3.5.1.5) измеряли колориметрическим методом [7].
Все опыты проведены в повторностях, каждая из которых представлена выборкой из 10-15 растений. Достоверность различий между вариантами определяли по непараметрическому критерию Манна-Уитни при уровне значимостиp < 0,05. На рис. 1, 2 показаны средние арифметические значе-
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
20-
фс ос
а * му
а р
е
д
о
о
t
15
10-
5"
3
2
ф
о р
о
1
500 1000 Концентрация мочевины, мг/л
0 10 500 1000 Концентрация мочевины, мг/л
Рис. 1. Содержание суммы хлорофиллов (а), каротиноидов (б), отношение
хлорофиллов a/b (в) и отношение суммы хлорофиллов (a+b) к каротиноидам (г) в листьях E. сanadensis, инкубированной в течение 5 сут. в среде с разными концентрациями
мочевины.
Рис. 2. Активность уреазы
в листьях E. canadensis, инкубированной в течение
5 сут. в среде с разными концентрациями мочевины.
250
200
ым
СП . <U g
уел
с о н
150-
100
50
1_
0 100 500 1000
Концентрация мочевины, мг/л
0
c
b
a
d
0
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
ния из трех биологических повторностей и их стандартные ошибки. Разными буквами отмечены достоверно различающиеся значения.
Результаты исследований и обсуждение
Фотосинтез - одна из ведущих функций растений, обеспечивающих их необходимыми для роста и развития субстратами и энергией. Состояние фотосинтетического аппарата растений является важнейшим фактором, от которого зависит эффективность ассимиляции углекислого газа. В ходе адаптации к условиям среды у растений происходят такие изменения структуры фотосинтетического аппарата, которые способны обеспечить их оптимальное функционирование.
Результаты исследований показали, что содержание фотосинтетических пигментов в листьях элодеи, которую инкубировали в среде в градиенте концентраций мочевины, существенно зависело от концентрации данного поллютанта. Это свидетельствует о том, что листья элодеи легко поглощали экзогенную мочевину.
Воздействие малыми концентрациями мочевины (100 мг/л) стимулировало образование хлорофиллов a и b и каротиноидов: оно возрастало на 15-30 % от контроля. При повышении ее концентрации до 500 мг/л количество фотосинтетических пигментов снижалось, однако оставалось выше контроля (рис. 1а, б). При максимальных концентрациях мочевины (1000 мг/л) количество хлорофиллов (a+b) уменьшалось до значений, которые были существенно ниже по сравнению с контролем. Содержание каротиноидов при этом тоже убывало, но не столь значительно (до уровня контроля).
Повышение количества хлорофилла в листьях элодеи при увеличении концентрации мочевины в среде, очевидно, обусловлено тем, что в состав хлорофилла входит значительное количество азота, поэтому добавление мочевины в небольших количествах привело к усилению синтеза хлорофилла вследствие лучшего обеспечения растений азотом. Увеличение содержания каротиноидов в листьях макрофитов в присутствии мочевины является закономерным явлением, которое объясняется способностью каротиноидов взаимодействовать с активными формами кислорода, подавляя процесс их накопления и препятствуя, таким образом, окислительному стрессу [8].
Уменьшение количества хлорофиллов и каротиноидов в листьях элодеи при повышенном содержании мочевины, вероятно, связано с сильным окислительным стрессом в клетках данного макрофита. Под действием высоких концентраций мочевины происходит окисление органических молекул и повреждение клеточных мембран. Очевидно, именно окислительным разрушением фотосинтетических пигментов обусловлено уменьшение их содержания в листьях элодеи при высоком уровне мочевины.
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
Отношение хлорофилла а к хлорофиллу Ь в листьях элодеи при возрастании концентрации мочевины увеличивалось (рис. 1в). Хлорофилл а является основным фотосинтетическим пигментом растений. В неблагоприятных условиях произошло увеличение его доли при уменьшении доли хлорофилла Ь, что свидетельствует о его более высокой устойчивости к действию высоких концентраций мочевины.
Отношение суммы хлорофиллов (а+Ь) к каротиноидам менялось незначительно (рис. 1г), однако наблюдалась тенденция к его уменьшению, т. е. возрастанию в фотоассимиляции роли каротиноидов как вспомогательных фотосинтетических пигментов.
Вопрос о путях ассимиляции мочевины в растительных тканях до сих пор не имеет единого решения. Как известно, основным путем усвоения у большинства растений является гидролиз мочевины под действием уреазы и последующая ассимиляция в обычных реакциях азотного и углеродного обмена. Уреаза катализирует реакцию гидролитического разложения мочевины на аммиак и углекислый газ, причем как в процессе жизнедеятельности организмов, так и в течение определенного времени после их отмирания [9]. Она широко распространена у растений, бактерий, грибков и некоторых беспозвоночных.
Исследования показали, что при повышении в среде концентрации мочевины до 500 мг/л уреазная активность в листьях элодеи существенно возрастала (почти в 8 раз). Это можно объяснить стимулирующим действием мочевины на активность уреазы как субстрата данного фермента. Однако в присутствии мочевины в среде в концентрации 1000 мг/л активность фермента резко падала, опускаясь даже ниже контрольных значений, что свидетельствует о токсических эффектах мочевины, которые проявляются при ее высоком уровне.
Известно, что мочевина может аккумулироваться корнями растений непосредственно и ассимилироваться в клетках корня [10], однако высокие концентрации мочевины приводят к денатурации белковых молекул [11]. Мочевина способна взаимодействовать как с полярными, так и неполярными группировками белков, приводя к разрушению их третичной структуры. Обнаружено, что мочевина может непосредственно разрывать водородные связи в белковых молекулах. Поэтому мочевину можно считать стрессовым фактором для растений наряду с другими поллютантами.
Значительные количества мочевины могут поступать в водные объекты с сельскохозяйственных угодий при использовании ее в качестве удобрения. Мочевина является одним из лучших азотных удобрений и по эффективности равноценна аммиачной селитре. Ее можно применять как основное удобрение или в качестве подкормки под все культуры и на различных почвах. Мочевина непосредственно растениями не усваивается, только после
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
разложения ее почвенными уробактериями она становится доступной. На богатых гумусом почвах это превращение происходит за 2-3 дня, на песчаных и болотистых несколько медленнее. При поверхностном размещении удобрения возможны потери азота вследствие улетучивания аммиака из карбоната аммония, легко разлагающегося в воздухе. Значительные потери в форме аммиака могут происходить при использовании мочевины в качестве подкормки на лугах и пастбищах, поскольку дернина обладает высокой уреазной активностью.
В связи с увеличением доли мочевины в промышленном производстве и структуре азотных удобрений возникает необходимость обоснования режимов использования мочевины. В периоды интенсивного снеготаяния и ливневых осадков значительная часть внесенной под сельскохозяйственные растения мочевины смывается в реки и водоемы. Следовательно, целесообразно применять мочевину в качестве основного удобрения, а также для ранневесенней подкормки озимых и пропашных культур при немедленной заделке в почву.
Существенный вклад в ухудшение экологического состояния водных объектов и их загрязнение мочевиной и другими азотсодержащими веществами вносят объекты животноводства. Стоки животноводческих комплексов характеризуются высокой загрязненностью: содержание взвешенных веществ в них может достигать 29 г/л; общего сухого остатка до 4 г/л; азота общего до 2 г/л; азота аммиачного до 0,8 г/л; величина БПК5 10 г/л [12, 13].
Проведенными в США исследованиями установлено [12], что на средней по размеру и поголовью животных откормочной площадке в накапливающемся за год навозе содержится 25 т азота, 59 % этого количества удаляется с территории площадки в процессе уборки и вывоза навоза; 10,1 % теряется вместе со стоком за холодный период года; 1,3 % - летом. Остальная часть азота попадает в почву в виде нитратов, аммония и органических соединений или улетучивается в атмосферу. Особую угрозу для близлежащих водных объектов представляет образование в периоды весеннего половодья и летних ливневых паводков на территории комплексов навозосодержащих сточных вод, которые, как правило, неорганизованным путем поступают в природные воды, вызывая их загрязнение.
Для предотвращения накопления мочевины и продуктов ее распада в поверхностных водах необходим комплекс мер, направленных на сокращение потоков органических и неорганических азотсодержащих соединений: строгий контроль за соблюдением экологически обоснованных правил и требований при использовании мочевины в качестве удобрения; регламентирование основных показателей функционирования животноводческих предприятий, эффективное обезвреживание и утилизация образующихся отходов, предотвращение поступления в природные воды навозосодержа-
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
щих сточных вод, образующихся на территориях комплексов в периоды повышенной водности.
Выводы
Исследования по оценке влияния экзогенной мочевины на некоторые физиологические показатели водных макрофитов (на примере элодеи) показали следующее.
1. Присутствие в инкубационной среде мочевины в концентрациях 100 и 500 мг/л стимулировало синтез хлорофиллов и каротиноидов в листьях элодеи. Активность уреазы существенно возрастала по сравнению с контролем.
2. Возрастание концентрации мочевины от 500 до 1000 мг/л вызывало уменьшение количества пигментов и снижение уреазной активности в листьях элодеи.
Таким образом, мочевина и продукты ее гидролиза могут не только вызывать эвтрофирование природных вод, ухудшая тем самым экологическое состояние гидроэкосистем, но и оказывать токсическое действие на жизнедеятельность водных макрофитов и других гидробионтов, что предопределяет необходимость постоянного контроля за поступлением азотсодержащих веществ в водные объекты с водосборной территории, а также осуществления комплекса мероприятий по сокращению этих потоков.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Клоченко П.Д., Сакевич А.И., Усенко О.М., Шевченко Т.Ф. Изменение структуры фито-
планктона под воздействием мочевины // Гидробиологический журнал. 2000. Т. 36. № 6. С. 62-74.
2. Горышина Т.К. Экология растений: Учеб. пособие. М.: Высш. шк., 1979. 368 с.
3. МокроносовА.Т., ИльиныхЗ.Г., ШуколюковаН.И. Ассимиляция мочевины растениями кар-
тофеля // Физиология растений. 1966. Т. 13. № 5. С. 798-806.
4. Лось С.И. Влияние мочевины на спектральные свойства фикобилиновых пигментов водо-
рослей // Альгология. 2009. Т. 19. № 1. С. 25-32.
5. Антропогенное воздействие на малые озера. Л.: Наука, 1980. 172 с.
6. ГавриленкоВ.Ф., ЛадыгинаМ.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии рас-
тений. М.: Высшая школа, 1975. 392 с.
7. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений. Киев: Наукова думка, 1975.
334 с.
8. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб.: Изд-во СПб. ун-та,
2002. 244 с.
9. Усенко О.М., Сакевич А.И., Клоченко П.Д. Участие фотосинтезирующих гидробионтов в
разложении мочевины // Гидробиологический журнал. 2000. Т. 36. № 4. С. 20-29.
10. Rossky P.J. Protein denaturation by urea: slash and bond // PNAS. 2008. V. 105. № 44. P. 16825-16826.
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
11. Lima W. K., Rosgen J., Englander S.W. Urea, but not guanidinium, destabilizes proteins by
forming hydrogen bonds to the peptide group // PNAS. 2009. V. 106. № 8. P. 2595-2600.
12. Фокина В.Д. Охрана окружающей среды от загрязнения отходами животноводства (Обзорная информация). М.: ВНИИТЭИСХ, 1980. 52 с.
13. Редька И.И. Поверхностный сток с территории животноводческих комплексов // Охрана
вод от загрязнения поверхностным стоком. Харьков: ВНИИВО, 1983. С. 69-72.
Сведения об авторах:
Малева Мария Георгиевна, к. б. н., ассистент, кафедра физиологии и биохимии растений, Институт естественных наук, департамент: «Биологический факультет», Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина, 620002, г. Екатеринбург, Мира, 19; e-mail: maria.maleva@mail.ru
Борисова Галина Григорьевна, д. г. н., профессор, кафедра физиологии и биохимии растений, Институт естественных наук, департамент: «Биологический факультет», Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина, 620002, г. Екатеринбург, Мира, 19; e-mail: borisova59@mail.ru
Чукина Надежда Владимировна, к. б. н., ассистент, кафедра физиологии и биохимии растений, Институт естественных наук, департамент: «Биологический факультет», Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина, 620002, г. Екатеринбург, Мира, 19; e-mail: nady_dicusar@mail.ru
Некрасова Галина Федоровна, к. б. н., доцент, кафедра физиологии и биохимии растений, Институт естественных наук, департамент: «Биологический факультет», Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина, 620002, г. Екатеринбург, Мира, 19
Водное хозяйство России № 5, 2012
Водное хозяйство России
