ВЛИЯНИЕ МЕЛИТТИНА ЯДА ПЧЕЛЫ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ ЛИНИЙ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Халиков Р.Р.; Громенко Д.Д.; Галимова С.Ш.; Данилко К.В.; Громенко И.Д.; Галимов Ш.Н.; Литвицкий П.Ф.

Оригинальные исследования

https://doi.org/10.24060/2076-3093-2022-12-2-118-122

(сс)]

Халиков Руслан Ринатович — студент 5-го курса,

ога&огд/0000-0001-8Ж2-9276

Громенко Дарья Дмитриевна — студентка 5-го курса, огсМ.ог//0000-0001-

5538-1-76

Галимова Саида Шамилевна — кафедра терапии и сестринского дела, огс1/3.

огд/0000-0002-7865-8326

Данилко Ксения Владимировна — к.б.н., Центральная научно-исследовательская лаборатория, лаборатория клеточных культур, orcid.org/0000-0002-437642923

Громенко Иван Дмитриевич — кафедра биологической химии, orcid.org/0000-

0001-8582-660Х

Галимов Шамиль Нарима-нович — д.м.н., профессор, кафедра биологической химии, orcid.org/0000-0003-

5576-5151

Литвицкий Пётр Франце-

вич — д.м.н., чл.-корр. РАН, кафедра патофизиологии,

orcid.org/G000-0003-015l-9H4

Влияние мелиттина яда пчелы на жизнеспособность клеток различных линий рака предстательной железы

Р.Р. Халиков1, Д.Д. Громенко2', С.Ш. Галимова2, К.В. Данилко2, И.Д. Громенко2, Ш.Н. Галимов2, П.Ф.Литвицкий'

1 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет), Россия, Москва

2 Башкирский государственный медицинский университет, Россия, Республика Башкортостан, Уфа * Контакты: Громенко Дарья Дмитриевна, e-mail: dasha.gromenko@mail.ru

Аннотация

Введение. Мелиттин является основным компонентом пчелиного яда и представляет собой водорастворимый пептид, обладающий свойствами поверхностно-активного вещества, цитолитические эффекты которого потенциально могут быть полезными в качестве противоопухолевой терапии. Нами проведена оценка влияния мелиттина из яда «башкирской» пчелы (Apis mellifera mellifera L.) на жизнеспособность клеток различных линий рака предстательной железы. Материалы и методы. Для оценки воздействия мелиттина на пролиферацию клеток различных линий рака предстательной железы (РПЖ) разной степени злокачественности: LNCaP, PC-3, DU145 проведен МТТ-тест и последующий анализ показателя жизнеспособности клеток. Результаты и обсуждение. Выявлена низкая чувствительность к мелиттину клеток линии DU145: подавляющее воздействие на процесс их пролиферации оказала относительно высокая концентрация пептида — 10 мкг/мл. Для линии клеток РС-3 его концентрация в 0,1 мкг/мл в значительной степени подавляла пролиферацию клеток до уровня 46,15 %, а мелиттин в дозе 10 мкг/мл оказал цитолитическое действие на большую часть клеток (4,27 % жизнеспособности). Для клеток линии LNCaP концентрация мелиттина 10 мкг/мл оказалась наименее токсичной по сравнению с линиями PC-3 и DU145. Показано подавление пролиферации клеток линий РПЖ: LNCaP, PC-3, DU145 под действием мелиттина в дозе 0,01-100,00 мкг/мл. Заключение. В исследовании выявлено значительное снижение жизнеспособности клеток линий РПЖ в минимальной концентрации мелиттина в 0,01 мкг/мл, что показывает высокую цитолитическую активность данного пептида и делает его потенциальным кандидатом для применения в противоопухолевой терапии.

Ключевые слова: мелиттин, рак предстательной железы, жизнеспособность клетки, клеточная пролиферация, клетки линии PC-3, клетки линии DU145, клетки линии LNCaP, противоопухолевая терапия

Для цитирования: Халиков Р.Р., Громенко Д.Д., Галимова С.Ш., Данилко К.В., Громенко И.Д., Галимов Ш.Н., Литвицкий П.Ф. Влияние мелиттина яда пчелы на жизнеспособность клеток различных линий рака предстательной железы. Креативная хирургия и онкология. 2022;12(2):118-122. https://doi.org/10.24060/2076-3093-2022-12-2-118-122

Impact of Honeybee Venom Melittin on Cell Viability of Different Prostate Cancer Lineages

Ruslan R. Khalikov', Darya D. Gromenko2*, Saida Sh. Galimova2, Ksenia V. Danilko2, Ivan D. Gromenko2, Shamil N. Galimov2, Petr F. Litvitsky'

1 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russian Federation

2 Bashkir State Medical University, Ufa, Russian Federation

* Correspondence to: Darya D. Gromenko, e-mail: dasha.gromenko@mail.ru

Abstract

Background. Melittin is a major constituent of honeybee venom and comprises a water-soluble surfactant peptide with cytolytic effects potentially applicable in anticancer therapy. We evaluated the impact of melittin from Bashkir honeybee (Apis mellifera mellifera L.) venom on cell viability of various prostate cancer lineages. Materials and methods. MTT assays with cell viability index estimation were used to evaluate the effect of melittin on cell proliferation in various-grade malignancy prostate cancer (PC) lineages, LNCaP, PC-3 and DU145. Results and discussion. Lineage DU145 revealed a low sensitivity to melittin, because a relatively high peptide concentration of 10 ^g/mL had a suppressive effect on its proliferation. With PC-3 cells, a 0.1 ^g/mL concentration suppressed proliferation significantly to 46.15 %, while melittin at a 10 ^g/mL dose had a cytolytic effect on most cells (4.27 % viability). LNCaP cells experienced the lowest toxicity at 10 ^g/mL melittin compared to PC-3 and DU145 lineages. The LNCaP, PC-3 and DU145 PC lineages demonstrated suppressed proliferation at melittin levels 0.01-100 ^g/mL. Conclusion. The study reveals a significant reduction of the PC lineages viability at a minimal melittin concentration of 0.01 ^g/mL, which indicates a high cytolytic activity of this peptide and renders it a candidate agent in antitumour therapy.

Keywords: melittin, prostate cancer, cell viability, cell proliferation, PC-3 cells, DU145 cells, LNCaP cells, antitumour therapy

For citation: Khalikov R.R., Gromenko D.D., Galimova S.Sh., Danilko K.V., Gromenko I.D., Galimov Sh.N., Litvitskiy P.F. Impact of honeybee venom melittin on cell viability of different prostate cancer lineages. Creative Surgery and Oncology. 2022;12(2):118-122. https://doi.org/10.24060/2076-3093-2022-12-2-118-122

Ruslan R. Khalikov — Graduate Student (5thyear), orcid.

org/Q(X)O-OQQ0-8-&2-9276

Darya D. Gromenko — Graduate Student (5th year), orcid.

oro/OQQO-OQQQ-5638-1779

Saida Sh. Galimova — Department of Therapy and Nursing, orcid.org/2222-2227-

7865-6326

Ksenia V. Danilko — Cand. Sci. (Biol.), Central Research Laboratory, Laboratory of Cell Culturing, orcid.org/QQQQ-QQQ7-

4374-2925

Ivan D. Gromenko — Department of Biological Chemistry, orcid.org/QQQQ-QQQ7-6567-22QX

Shamil N. Galimov — Dr.

Sci. (Med.), Prof., Department of Biological Chemistry, orcid.

0fg/gQÖQQ)QQ2-5&71-515i

Petr F. Litvitsky — Dr. Sci. (Med.), Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Department of Patho-physiology, orcid.org/2222-00033151-79-

ВВЕДЕНИЕ

На долю рака предстательной железы (РПЖ), легких и колоректального рака приходится почти половина (48 %) всех случаев заболевания у мужчин, причем только на РПЖ приходится 27 % всех диагнозов [1]. При РПЖ используется хирургическое удаление новообразования, радио-, гормоно- и химиотерапия. Основной причиной низкой эффективности существующих методов лекарственной терапии является ее неклональ-ная направленность, т.е. невозможность воздействия на все клоны опухолевой популяции, разнообразие которых в опухоли достаточно широко и определяет феномен внутриопухолевой гетерогенности. Этот феномен играет существенную роль в реализации различных клинических проявлений опухолевой прогрессии и рассматривается как один из основных факторов, определяющих развитие новообразования, поддержание онкогенного потенциала, выживание клеток в условиях динамичного микроокружения и устойчивость опухоли к лекарственному воздействию [2]. В связи с этим поиск молекул, позволяющих эффективно

воздействовать на все опухолевые популяции, является крайне важной задачей.

Одной из таких перспективных молекул является пептид мелиттин, основной токсин пчелиного яда, составляющий около 50 % от его сухого веса [3]. Промышленный способ получения пчелиного яда основан на электростимуляции пчел слабым электрическим током, под действием которого они выделяют яд на стеклянные листовые сборники [4]. Мелиттин образован 26 остатками аминокислот. В водной среде он формирует амфифильный тетрамер, что придает ему свойства катионного детергента с высокой поверхностной активностью [5]. В предыдущих исследованиях описаны противовирусные, антибактериальные, противогрибковые, противопаразитарные и противоопухолевые свойства мелиттина, и на данный момент считается, что главный эффект этого вещества как неселективного цитолитического пептида заключается в физическом и химическом разрушении всех прокариотических и эукариотических клеточных мембран [6-10]. Мелиттин связывается с отрицательно

заряженной поверхностью мембраны и затем нарушает целостность фосфолипидных бислоев путем образования пор, приводящих к утечке атомарных ионов и молекул и повышению проницаемости, что в конечном счете приводит к лизису клеток [11]. В настоящее время предлагаются различные механизмы доставки мелиттина к клеткам-мишеням, которыми могут являться и раковые клетки простаты [12], молочных желез [13], яичников [14] и печени [15], на развитие которых он оказывает ингибирующее действие. Целью настоящего исследования являлась оценка механизмов влияния мелиттина яда «башкирской» пчелы на пролиферацию клеток различных линий рака предстательной железы разной степени злокачественности: LNCaP, PC-3, DU145.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мелиттин получен из яда «башкирской» пчелы (Apis mellifera mellifera L.) в Центре прототипирования в области нефтехимии ГУП «Института нефтехимперера-ботки РБ» (Карчевский С.Г.).

В исследовании использованы различные линии клеток новообразований: LNCaP (аденокарцинома предстательной железы, метастаз в лимфатический узел, эпителиоподобная), PC-3 (карцинома предстательной железы, метастаз в кость, эпителиоподобная), DU145 (аденокарцинома предстательной железы, метастаз в мозг, эпителиоподобная).

Влияние мелиттина на пролиферацию клеток трех линий рака предстательной железы оценивалось с помощью МТТ-теста. Этот тест основан на способности оксидоредуктаз клетки превращать желтый тетразо-лиевый краситель — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый пурпурный формазан. На этом основании рассчитывали показатель оптической плотности.

кшщоир^Ешя иелшиша. мк: мл

Рисунок 1. Уровень жизнеспособности клеток (в % от контроля) в зависимости от концентрации мелиттина в среде.

* — статистически значимые различия, полученные с использованием критерия Манна — Уитни в ходе попарного сравнения уровней жизнеспособности клеток линий LNCaP/PC-3, PC-3/DU145, LNCaP /DU145, р < 0,05 (p = 0,0286)

Figure 1. Cell viability (% of control) by melittin concentration in medium.

* — Mann—Whitney statistical significance of pairwise cell viability comparison for LNCaP/PC-3, PC-3/ DU145, LNCaP/DU145, p <0.05 (p = 0.0286)

Клетки культивировали в полной питательной среде DMEM (Sigma):RPMI1640 (Gibco) в соотношении 50:50, содержащей 5 % эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Laboratories), 2 ммоль L-глутамина в 25 см2 куль-туральном флаконе при 37 °С, в присутствии 5 % СО2 до достижения ими 80 % монослоя. Среду заменяли на новую каждые 3 суток. Далее клетки монослоя снимали с помощью раствора трипсина 0,25 % — Версена 0,02 %, подсчитывали их количество на автоматическом счетчике клеток (ТС20, BioRad) и распределяли по 5х103 на лунку в 96-луночные планшеты в 100 мкл полной культуральной среды. Через 24 часа после этого добавляли мелиттин, который растворяли в культуральной среде до стоковой концентрации 100 мг/мл, а затем добавляли в лунки с клетками по 100 мкл раствора мелиттина до достижения его концентрации: 0,01, 0,1, 1, 10, 100 мкг/мл, по 4 лунки на каждую. Через 72 часа инкубации 20 мкл МТТ реактива (Диаэм) (5 мг/мл в фосфатном буфере) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 3,5 часа при 37 °С для накопления формазана. После инкубации отбирали культуральную среду, не затрагивая клетки, добавляли 100 мкл диметилсульфокси-да для растворения кристаллов формазана и тщательно перемешивали на шейкере-инкубаторе в течение 1 часа при температуре 21 оС. Абсорбцию измеряли при длине волны 530 нм и длине волны фонового поглощения 620 нм, используя мультипланшетный анализатор Spark 10M (Tecan). До внесения МТТ-реактива клетки фотографировали в проходящем свете инвертированного микроскопа с увеличением х100, после чего сравнивали снимки до и после проведенного эксперимента. Статистическую обработку проводили в программе GraphPad Prism v.5.0 (GraphPad Software Inc., США). Процент жизнеспособности клеток оценивался как среднее арифметическое значение оптической плотности для 4 измерений образцов / среднее арифметическое значение оптической плотности для 4 измерений контрольных лунок (без мелиттина) х 100 для каждой концентрации. Для каждой концентрации рассчитывалось также стандартное отклонение. Различия (в %) жизнеспособности между клеточными линиями при воздействии мелиттина в каждой из концентраций проводили с помощью непараметрического критерия Манна — Уитни Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный с помощью МТТ-теста анализ показателя жизнеспособности клеток линий LNCaP, PC-3, DU145 в присутствии мелиттина в концентрации 0,01100,00 мкг/мл показал следующие результаты (рис. 1). Концентрация мелиттина в 100 мкг/мл была летальной для всех клеток. Это проявлялось при микроскопии признаками лизиса опухолевых клеток (рис. 2). В то же время наиболее чувствительными к концентрации мелиттина в 10 мкг/мл оказались клетки аденокарци-номы предстательной железы линии DU145 (0,19 % жизнеспособности). В отличие от этого клетки опухоли линии LNCaP были более устойчивыми к пептиду

Контроль, 0 мкг/мл 100 мкг/мл

Рисунок2. Влияние мелиттина на клеточные линии рака предстательной железы. Видно, что концентрация мелиттина в 100 мг/мл оказалась абсолютно летальной для всех линий клеток. Фазовый контраст, увеличение х100, коричневый фильтр. a, b — клетки линии LNCaP; c, d — клетки линии PC-3; e, f — клетки линии DU145

Figure 2. Melittin impact on prostate cancer lineages. Melittin 100 mg/mL is totally lethal in all lineages. Phase contrast, magn. х100, brown filter. a, b — LNCaP cells; c, d — PC-3 cells; e, f — DU145 cells

(жизнеспособность — 43,97 %). При концентрациях мелиттина от 1 до 0,01 мкг/мл наблюдалась сходная картина: наименее чувствительными к нему оказались клетки линии DU145 (более 80 % жизнеспособных клеток), а наиболее чувствительными — линии PC-3 (менее 50 % жизнеспособных клеток). Промежуточное положение занимали клетки линии LNCaP (более 50 % жизнеспособных клеток).

Ранее Park et al. показали, что мелиттин в концентрации 0,5-2,5 мкг/мл оказывает ингибирующее действие

на клетки изученных нами линий LNCaP, DU145 и PC-3 [12]. Предполагается, что этот эффект был опосредован подавлением конститутивно активированного NF-kB. Мелиттин снижал уровень антиапоптотических белков и повышал количество проапоптотических. Мелиттин подавлял также рост клеток перевитой опухоли линии PC-3 у мышей и индуцировал их апоптоз. Имеющиеся в настоящее время данные литературы, включающие исследования in vitro и in vivo, свидетельствуют о том, что мелиттин также влияет на сигнальную трансдукцию

и регуляторные пути, приводящие к многочисленным механизмам гибели рака, включая ингибирование пролиферации, индукцию апоптоза, ингибирование анги-огенеза, остановку клеточного цикла, ингибирование подвижности, миграции, метастазирования и инвазии рака [3].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наше исследование показало, что мелиттин в концентрации 100 мкг/мл оказывает тотальное ингибирующее действие на все популяции опухолевых клеток. Более того, даже в концентрации 0,01 мкг/мл данный пептид значительно подавляет рост и размножение линий DU145, PC-3. Однако стоит отметить, что для схожего воздействия на клетки линий LNCaP дозировки 0,01 мкг/мл было недостаточно и минимальной необходимой дозой для подавления развития клеток LNCaP оказалась дозировка 10 мкг/мл, которая у других линий РПЖ вызывала практически полный цитолиз. Из всего вышесказанного можно сделать вывод об эффективности цитолитической активности мелиттина на клетки аденокарциномы предстательной железы, что подтверждает возможность использования данного вещества в качестве химиотерапии.

Информация о конфликте интересов. Конфликт интересов отсутствует.

Conflict of Interest. The authors declare no conflict of interest. Информация о спонсорстве. Данная работа не финансировалась.

Sponsorship Data. This work is not funded.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Siegel R.L., Miller K.D., Fuchs H.E., Jemal A. Cancer Statistics, 2022. CA Cancer J Clin. 2022;72(1):7-33. DOI: 10.3322/caac.21708

2 Arneth B. Comparison of Burnet's clonal selection theory with tumor cell-clone development. Theranostics. 2018;8(12):3392-9. DOI: 10.7150/thno.24083

3 Rady I., Siddiqui I.A., Rady M., Mukhtar H. Melittin, a major peptide component of bee venom, and its conjugates in cancer therapy. Cancer Lett. 2017;402:16-31. DOI: 10.1016/j.canlet.2017.05.010

4 Memariani H., Memariani M., Shahidi-Dadras M., Nasiri S., Akhavan M.M., Moravvej H. Melittin: from honeybees to superbugs. Appl Microbiol Biotechnol. 2019;103(8):3265-76. DOI: 10.1007/s00253-019-09698-y

5 Guha S., Ferrie R.P., Ghimire J., Ventura C.R., Wu E., Sun L., et al. Applications and evolution of melittin, the quintessential membrane active peptide. Biochem Pharmacol. 2021;193:114769. DOI: 10.1016/j. bcp.2021.114769

6 Memariani H., Memariani M., Moravvej H., Shahidi-Dadras M. Melit-tin: a venom-derived peptide with promising anti-viral properties. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2020;39(1):5-17. DOI: 10.1007/s10096-019-03674-0

7 Memariani H., Memariani M. Anti-fungal properties and mechanisms of melittin. Appl Microbiol Biotechnol. 2020;104(15):6513-26. DOI: 10.1007/s00253-020-10701-0

8 Memariani H., Memariani M. Melittin as a promising anti-protozoan peptide: current knowledge and future prospects. AMB Express. 2021;11(1):69. DOI: 10.1186/s13568-021-01229-1

9 Paray B.A., Ahmad A., Khan J.M., Taufiq F., Pathan A., Malik A., et al. The role of the multifunctional antimicrobial peptide melittin in gene delivery. Drug Discov Today. 2021;26(4):1053-9. DOI: 10.1016/j. drudis.2021.01.004

10 Павлов В.Н., Рахматуллина И.Р., Фархутдинов Р.Р., Пушкарев В.А., Данилко К.В., Галимова Э.Ф. и др. Свободнорадикальное окисление и канцерогенез: дискуссионные вопросы. Креативная хирургия и онкология. 2017;7(2):54-61. DOI: 10.24060/2076-30932017-7-2-54-61

11 Jamasbi E., Mularski A., Separovic F. Model membrane and cell studies of antimicrobial activity of melittin analogues. Curr Top Med Chem. 2016;16(1):40-5. DOI: 10.2174/1568026615666150703115919

12 Park M.H., Choi M.S., Kwak D.H., Oh K.W., Yoon D.Y., Han S.B., et al. Anti-cancer effect of bee venom in prostate cancer cells through activation of caspase pathway via inactivation of NF-kB. Prostate. 2011;71(8):801-12. DOI: 10.1002/pros.21296

13 Jeong Y.J., Choi Y., Shin J.M., Cho H.J., Kang J.H., Park K.K., et al. Melittin suppresses EGF-induced cell motility and invasion by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in breast cancer cells. Food Chem Toxicol. 2014;68:218-25. DOI: 10.1016/j.fct.2014.03.022

14 Badr-Eldin S.M., Alhakamy N.A., Fahmy U.A., Ahmed O.A.A., Asfour H.Z., Althagafi A.A., et al. Cytotoxic and pro-apoptotic effects of a sub-toxic concentration of fluvastatin on OVCAR3 ovarian cancer cells after its optimized formulation to melittin nano-conjugates. Front Pharmacol. 2021;11:642171. DOI: 10.3389/fphar.2020.642171

15 Yu X., Chen L., Liu J., Dai B., Xu G., Shen G., et al. Immune modulation of liver sinusoidal endothelial cells by melittin nanoparticles suppresses liver metastasis. Nat Commun. 2019;10(1):574. DOI: 10.1038/ s41467-019-08538-x

REFERENCES