CC BY
26
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА RYQLHPYR НА КЛЕТКАХ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Н.П. Акентьева1- 2, С.С. Шушанов3
ФГБУН «Институт проблем химической физики РАН»; Россия, 142432 Черноголовка, пр-т акад. Семенова, 1; 2Научно-образовательный центр «Медицинская химия» ГОУ ВО МО «Московский государственный областной университет»;
Россия, 142432 Черноголовка, пр-т акад. Семенова, 1; 3ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24
Контакты: Наталья Павловна Акентьева [email protected]
Введение. RHAMM (опосредованный гиалуронаном рецептор подвижности) избыточно экспрессируется во многих типах рака человека, а повышенный синтез RHAMMобычно коррелирует с плохим прогностическим фактором. В ходе исследования мы синтезировали пептид RYQLHPYR, модулирующий активность RHAMM, и рассмотрели терапевтический потенциал этого RHAMM-таргет-пептида как противоопухолевого реагента.
Цель исследования — изучение влияния синтетического пептида RYQLHPYR на жизнеспособность, апоптоз, некроз, активность каспаз-3/7 и инвазивность клеток рака предстательной железы.
Материалы и методы. Пептид RYQLHPYR был получен твердофазным синтезом. Изучались клетки рака предстательной железы человека (PC3 m-LNJ, мышиные эмбриональные фибробласты (неинвазивные, нормальные клетки) и мышиные эмбриональные фибробласты (RHAMM-/). Для количественной оценки влияния пептида на апоптоз и некроз клеток использовали метод ELISAPLUS. Определение активности каспаз-3/7 проводили колориметрическим методом. Антиметастатическое действие пептида in vitro оценивалось по инвазивности клеток методом количественного анализа площади деградации флуоресцентного желатина.
Результаты. Установлено, что пептид RYQLHPYR ингибировал рост опухолевых клеток PC3 m-LN4 при концентрации 10 мкг/мл (2 х 10-7 М) через 24 ч на ~80 %. Показано, что пептид стимулировал повышение уровня апоптоза в раковых клетках примерно в 10 раз и ускорял некротическую гибель опухолевых клеток в 2,5 раза. В ходе исследований выявлено, что пептид повышал в 2раза активность каспаз-3/7 в опухолевых клетках. В то же время показано, что RHAMM-таргет-пептид не оказывал значительного эффекта на апоптоз и некроз нормальных клеток и RHAMM-/. Установлено, что пептид ингибировал инвазивность опухолевых клеток на ~99,86 % при концентрации 10мкг/мл (2 х 10-7 М).
Выводы. Полученные результаты указывают, что пептид RYQLHPYR обладает противоопухолевой активностью и, следовательно, имеет терапевтический потенциал для лечения рака предстательной железы.
Ключевые слова: пептиды, апоптоз, некроз, рак предстательной железы, инвазивность
DOI: 10.17650/1726-9784-2019-18-2-40-50
STUDY OF ANTITUMOR ACTIVITY OF SYNTHETIC PEPTIDE RYQLHPYR ON THE PROSTATE CANCER CELLS
N. P. Akentieva1,2, S. S. Shushanov3
1Institute of Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences;1 Prospect Akademika Semenova, Chernogolovka 142432, Russia;
2Scientific-educational center "Medical chemistry" of the Moscow State Regional University; 1 Prospect Akademika Semenova, Chernogolovka 142432, Russia;
3N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe Sh., Moscow
115478, Russia
Introduction. The RHAMM (hyaluronan mediated mobility receptor) is overexpressed in many types of human cancer and increased synthesis of the RHAMM usually correlates with a poor prognostic factor. In this paper, we synthesized the peptide-RYQLHPYR modulating the activity of the RHAMM and examined the therapeutic potential of this RHAMM-targeting peptide as an antitumor agent. Objective. Study the effect of the synthetic peptide RYQLHPYR on viability, apoptosis, necrosis, caspase-3/7 activity, and invasion of prostate cancer cells.
Materials and methods. The peptide RYQLHPYR was prepared by solid phase synthesis. Human prostate cancer cells (PC3 m-LN4), murine embryonic fibroblasts and murine embryonic fibroblasts (RHAMM-/). To quantify the effect of the peptide on apoptosis and cell necrosis, ELISAPLUS was used. The activity of caspase-3/7 was determined by the colorimetric method. Evaluation of the anti-metastat-ic effect of the peptide in vitro was evaluated by invasion of cells by quantitative analysis of the area of degradation of fluorescent gelatin.
Results. It was found that thepeptide RYQLHPYR inhibited the growth of tumor cells PC3 m-LN4 at a concentration of 10 ^g/ml (2 x 10-7 M) after 24 h by ~80 %. It was shown that the peptide stimulated the level of apoptosis in cancer cells, approximately 10-fold. It was found that the peptide increased the necrotic death of tumor cells by 2.5 times. During the research it was revealed that the peptide increased the caspase-3/7activity in tumor cells by 2 times. At the same time, it was shown that RHAMM-targetingpeptide had no significant effect on apoptosis and necrosis of normal cells (fibroblasts) and fibroblasts (RHAMM-/). It was found that the peptide inhibited invasion of tumor cells by ~99.86 % at a concentration of 10 ^g/ml (2 x 10-7 M).
Conclusions. The obtained results indicate that the peptide RYQLHPYR has antitumor activity and, therefore, has a therapeutic potential for the treatment of prostate cancer.
Key words: peptides, apoptosis, necrosis, prostate cancer, invasion
Введение
Частота возникновения онкологических заболеваний в мире растет в геометрической прогрессии. Согласно статистике, к 2020 г. смертность от рака составит 40 % общего числа смертей [1]. Рак предстательной железы (РПЖ) остается 2-й ведущей причиной гибели в мире (после рака легких). Кроме того, лечение онкологических заболеваний является крайне дорогостоящим. Несмотря на определенные успехи в лечении, основная проблема в онкологии заключается в отсутствии селективности противоопухолевых препаратов. Поэтому разработка механизмов таргет-ной терапии раковых заболеваний — самая актуальная и активно развивающаяся область биомедицины.
Таргетная, адресная химиотерапия позволяет избирательно и эффективно локализовать препарат на молекулярных мишенях в клетке (например, на рецепторах), в то же время ограничить его доступ к нормальной клетке и таким образом получить максимальный терапевтический эффект, снизив токсичность препарата. На протяжении последних лет использование пептидов как перспективных терапевтических агентов для лечения онкологических заболеваний, стремительно растет. Терапевтические пептиды завоевывают все большую популярность для применения в различных аспектах медицины, в том числе в виде противоопухолевых вакцин, в составе антимикробной терапии, для доставки нуклеиновых кислот [2—9]. Недавно установлено, что антимикробный пептид низин обладает противоопухолевой активностью, индуцирует апоптоз и подавляет пролиферацию клеток астроцитомы человека (SW1088) [10].
В ходе исследований было выявлено, что пептиды обладают разными физиологическими активностями и эффектами воздействия на опухолевые клетки. Многие природные и синтетические проапоптоти-ческие пептиды индуцируют ферменты апоптоза и вызывают гибель клеток. Например, катионный антимикробный пептид, выделенный из бразильского тарантула, обладает не только бактериостатиче-скими свойствами, но и проявляет противоопухолевую активность in vitro и in vivo [11]. Так называемые клеточно-проникающие пептиды усиливают эффект химиотерапевтических препаратов, в то же время мембранолитические, катионные антимикробные пеп-
тиды разрушают мембраны раковых клеток [12—16]. Недавно показано, что пептиды, выделенные из австралийской лягушки, ингибируют деление клеток рака молочной железы [17]. Химерные пептиды проявляют противоопухолевую активность и понижают множественную лекарственную устойчивость опухолей [18]. Известно, что клеточно-проникаю-щий пептид dNP2 может ускорять накопление противоопухолевых препаратов в клетке и тем самым повышать эффективность лечения рака [19].
Под воздействием различных неблагоприятных факторов нормальная клетка может перерождаться в раковую, которая характеризуется повышенным уровнем экспрессии рецепторов, белков или ферментов, являющихся молекулярными мишенями опухолевой клетки. Существует категория противоопухолевых пептидов (пептидных антагонистов), которые преимущественно связываются с известным рецептором и модулируют его активность, активируют или блокируют его функции и тем самым влияют на процессы развития и прогрессии рака [20—26]. Недавние исследования показали, что белок 2 ^А2), связанный с рецептором фактора роста, представляет собой адаптер, который в значительной степени вовлечен в опухолевые новообразования, а блокирование этого белка пептидами приводит к подавлению роста опухоли [27].
В последнее время эфрин-рецепторы киназной системы привлекают все большее внимание как основной класс потенциальных мишеней для лекарств [28]. Были идентифицированы пептиды, которые специфично связываются с эфрин-рецепторами с высоким сродством [29]. Эти пептиды, как правило, являются антагонистами, которые ингибируют связывание эфрина и передачу сигналов на эфрин-ре-цептор, но некоторые являются агонистами, имитирующими активацию эфрин-рецептора [30]. Помимо модуляции функции эфрин-рецептора такие пептиды могут служить в качестве диагностических и терапевтических средств, а также для доставки различных наночастиц в опухоли и другие пораженные ткани, представляющие мишени эфрин-рецепторов [31, 32]. Пептидные антагонисты имеют большие перспективы, потому что их основной механизм действия нацелен на конкретную молекулярную мишень опухолевых клеток, что приводит к их гибели.
42 Оригинальные статьи
RHAMM/HMMR-онкорецептор (опосредован- такой важный аспект, как изучение влияния пептида ный гиалуронаном рецептор подвижности) является RYQLHPYR на жизнеспособность, апоптоз, некроз такой молекулярной мишенью для диагностических, и инвазивность опухолевых клеток PC3 m-LN4. прогностических и терапевтических целей в области лечения онкологических заболеваний. RHAMM син- Материалы и методы тезируется в избытке в метастатических агрессивных Препараты и реактивы . В работе использовали опухолевых клетках по сравнению с нормальными ростовую среду DMEM (низкое содержание глюкозы клетками. В ряде работ было показано, что повышен- (—1 г/л), L-глютамин, 25 mMHEPES, пируват нат-ное содержание RHAMM наблюдается в клетках рака рия, Biowest, Франция), эмбриональную бычью сы-молочной и предстательной желез, толстой кишки, воротку (FBS, ультранизкое содержание эндотокси-в солидных опухолях и в клетках рака крови, при мие- на, Biowest, Франция), трипсин 0,25 % — ЭДТА 0,02 % лоидном лейкозе, множественной миеломе, и обыч- в HBSS (Biowest, Франция), гентамицин (10 mg/ml, но повышенный синтез RHAMM коррелирует с пло- Biowest, Франция), QCMTM Gelatin Invadopodia Assay хим прогнозом [33—36]. (red) набор (Millipore, США), Fluoro-Gel II (Millipore, Идея нашей работы состоит в том, чтобы с помо- США). В работе была использована пластиковая щью пептида-антагониста ингибировать активность посуда (чашки Петри, одноразовые пипетки) фирмы RHAMM-онкорецептора, понизить выживаемость, BD Falcon (США). инвазивность раковых клеток и тем самым заблоки- Линии клеток . Для исследований in vitro бы-ровать развитие опухоли на самой ранней стадии. ли использованы 3 линии клеток: адгезивные клет-Последовательности пептидов, обладающих высо- ки карциномы предстательной железы человека ким сродством к RHAMM, были идентифицированы (PC3 m-LN4), характеризующиеся повышенной экс-методом биоинформатики и создания библиотеки прессией RHAMM, мышиные эмбриональные фибро-пептидов [37]. Такие RHAMM-пептиды-антагони- бласты (MEF) — неинвазивные, нормальные клетки сты, специфично взаимодействующие с RHAMM, и эмбриональные фибробласты мыши (RHAMM-/). были охарактеризованы ранее [37, 38]. Показано, Клеточные линии фибробластов RHAMM-/- были что RHAMM-пептиды специфично связываются получены, как описано ранее [43]. Клеточные лис RHAMM с высоким сродством (константа связы- нии PC3 m-LN4 и MEF получены из ФГБУ «НМИЦ вания около 30 нМ), блокируют центр связывания онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. гиалуроновой кислоты (физиологического лиганда Способ культивирования: адгезивный в среде DMEM RHAMM), легко проходят через цитоплазматиче- с 10 % эмбриональной бычьей сывороткой при 37 °C, скую мембрану клеток [37]. Пептиды-антагонисты, 5 % CO2 и 95 % влажности. способные блокировать центр связывания гиалуро- Синтез пептида. Пептид RYQLHPYR был получен новой кислоты на RHAMM, представляют собой твердофазным методом, как описано ранее [37, 38, 44]. новую стратегию раковой терапии, направленную Оценка жизнеспособности клеток флуоресцентным на индукцию процессов апоптоза, некроза и ингиби- методом (Alamar Blue). Для анализа действия пептида рование инвазивности опухолевых клеток. В насто- на жизнеспособность клеток использовали метод ящее время RHAMM-таргет-пептиды известны Alamar Blue® Cell Viability Assay (Thermo Fisher Scien-как биомаркеры для ранней диагностики рака яич- tific, США). Данный метод позволяет определить ников, предстательной и молочной желез [38—40]. активность митохондриальных никотинамидаденин-Кроме того, показано, что RHAMM-таргет-пептиды динуклеотид- (НАДН) — дегидрогеназ живых клеток, индуцируют апоптоз и некроз клеток рака молочной которые расщепляют НАДН на НАД и Н+, и обра-железы, а также ингибируют их инвазивность [41, 42]. зующийся Н+ восстанавливает нефлуоресцентный Поиск новых RHAMM-таргет-пептидов, селек- краситель резазурин в сильно флуоресцентный резо-тивно блокирующих RHAMM и его сигнальные пу- фурин [45]. PC3 m-LN4, MEF-клетки засеивали ти, является одним из перспективных подходов для в 96-луночные планшеты по 1 тыс. клеток в лунке лечения РПЖ. Однако в настоящее время физиоло- в 200 мкл ростовой среды, клетки выращивали в те-гический эффект RHAMM-таргет-пептидов на апо- чение 24 ч в инкубаторе при 37 °C, 5 % CO2 и 95 % птоз, некроз и инвазивность опухолевых клеток пред- влажности. Затем в лунки добавляли пептид (до ко-стательной железы изучен не полностью. Поэтому нечной концентрации 10 мкг/мл, 2 х 10-7 М), а в кон-в данной работе мы синтезировали пептид RYQLHPYR трольные добавляли равное количество фосфатно-в соответствии с методом, описанным ранее, и изу- солевого буфера (0,01 М, рН = 7,2) и инкубировали чили его терапевтический потенциал [37, 38]. в течение 24 ч при 37 °C. На каждую дозу препарата Цель исследования — изучение противоопухолевой и контроль использовали не менее 3 лунок. Затем до-активности пептида RYQLHPYR на культуре раковых бавляли Alamar Blue-реагент (10 мкл, Thermo Fisher клеток предстательной железы. Задачи включали Scientific, USA) непосредственно к клеткам в ростовую
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 2'2019 том 181 vol. 18
Оригинальные статьи 43
среду и проводили измерения через 24 ч. Интенсив- Elmer) при 405 нм. Все измерения дублировались ность флуоресценции измеряли при 570/590 нм, ис- 3 раза, данные представлены как средние от 3 по-пользуя спектрофлуориметр Willac 1420 (Perkin Elmer). вторных экспериментов. Жизнеспособность клеток при действии пептида метод деградации флуоресцентного желатина оценивалась сравнением флуоресценции в экспери- для исследования инвазивности клеток. Для изучения ментальных лунках с флуоресценцией в контроль- инвазивности клеток использовали QCM™ Gelatin ных. Все измерения дублировались 3 раза, и данные Invadopodia Assay (Red) Kit (Millipore, США). Дан-представлены как средние от 3 повторных экспери- ный метод основан на быстром обнаружении дегра-ментов. дации флуоресцентно-меченого желатина клетками оценка влияния пептида на апоптоз и некроз опу- [49, 50]. Эффект пептида на образование инвадопо-холевых клеток. Клетки РПЖ PC3 m-LN4, MEF, дий исследовали по его влиянию на степень деградации RHAMM-/- высеивали на плоскодонные 96-луноч- желатина. Поверхность покровного стекла вначале ные планшеты при плотности 1 тыс. клеток в лунке, обрабатывали поли^-лизином, затем — разбавлен-клетки выращивали в течение 24 ч в инкубаторе при ным раствором глутаральдегида, чтобы бифункцио-37 °C, 5 % CO2 и 95 % влажности. Затем в лунки добав- нально «активировать» поверхность для дальнейшего ляли пептид (до конечной концентрации 10 мкг/мл, связывания желатина. После этого стекло инкубиро-2 х 10-7 М), а в контрольные культуры добавляли вали с желатином, флуоресцентно-меченым с Cy3, равное количество фосфатно-солевого буфера и ин- в результате чего образовывалась ковалентная связь кубировали в течение 24 ч при 37 °C. Для количест- между поли^-лизином и желатином через реакци-венной оценки апоптоза и некроза клеток под дей- онноспособные альдегидные (-CHO) группы. Затем ствием пептида использовали иммуноферментный стекло, покрытое желатином, подготавливали для метод Cell Death ELISAPLUS Kit (Roche Diagnostic, культивирования клеток путем дезинфекции в 70 % США). Индукцию апоптоза и некроза с помощью этаноле и добавляли ростовую среду для гашения пептида определяли измерением гистоновых компо- свободных альдегидов. Клетки высеивали на стекла, нентов моно-, олигонуклеосом (гистоны Н1, H2A, покрытые желатином, при концентрации ~500 кле-H3 и H4), являющихся индикаторами апоптоза и не- ток на лунку, добавляли ростовую среду и выращива-кроза [46, 47]. Оптическую плотность измеряли при ли при 37 °C в 5 % CO2 в течение 24 ч. Для экспери-405/490 нм на спектрофлуориметре Wallac 1420 (Per- мента по влиянию пептида на инвазивность клеток kin Elmer). Все измерения дублировались 3 раза, дан- пептид (конечная концентрация 40 ^g/ml) добавляли ные представлены как средние от 3 повторных экс- к ростовой среде и инкубировали в течение 40 ч. периментов. После этого ростовую среду удаляли и клетки фик-определение активности каспаз-3/7 колориметри- сировали в течение 30 мин при 37 °C формальдегидом ческим методом. Клетки РПЖ человека PC3 m-LN4, (3,7 %). Для визуализации цитоскелетного актина MEF засеивали плотностью 1 тыс. клеток в лунке и ядер клетки окрашивали флуоресцентно-меченым в 24-луночные платы и инкубировали 24 ч в ростовой FITC-фаллоидином (2 мг/мл) и DAPI (1 мг/мл) со-среде DMEM (Multicell) с 10 % эмбриональной ответственно, чтобы анализировать одновременно бычьей сывороткой. Затем пептид (конечная кон- локализацию деградации с клеточными признаками. центрация 2 х 10-7 М) добавляли к клеткам и инку- После окрашивания клетки фиксировали на покров-бировали в течение 24 ч при 37 °С. В контрольные ном стекле с помощью Fluoro-Gel II и анализировали культуры добавляли обычную ростовую среду, содер- методом конфокальной микроскопии при 358, жащую 10 % сыворотки. Для количественного изме- 494 и 550 нм. Конфокальные изображения получали рения активности каспаз-3/7 был использован Cas- с помощью лазерного сканирующего конфокального pase-3 Colorimetric Assay Kit (Gen Script, США). микроскопа (Fluoview FV-1000; Olympus) при увели-Активацию каспаз-3/7 определяли измерением рас- чении х20 для количественного анализа. На конфо-щепления колориметрического субстрата, специфич- кальных изображениях флуоресцентно-меченый ного для каспаз-3/7, (DEVD-p-нитроанилида). Суб- желатин красного цвета (Cy3), актин клеток имеет страт, DEVD-p-нитроанилид состоит из хромофора зеленую окраску (FITC-фаллоидин), ядра клеток — p-нитроанилида и синтетического тетрапептида, синие (DAPI), а область деградации желатина — чер-DEVD (Asp-Glue-Val-Asp), который и отщепляется ного цвета (флуоресценция отсутствует). Изображе-каспазами-3/7. После расщепления субстрата каспа- ния снимали с помощью программы Fluoview зами 3/7 высвобождается окрашенный хромофор Software (FV10-ASW version 01.07; Olympus). Количе-^-нитроанилин (^NA), который определяется спек- ственный анализ изображений, подсчет числа и пло-трофотометрически [48]. Измерение оптической щади клеток, а также площади деградации желатина плотности каждой лунки проводилось с использо- проводили, используя программу ImageJ software (NIH, ванием многорядного счетчика Wallac 1420 (Perkin USA). На изображениях, полученных с помощью
2'2019 ТОМ 18 1 vol. 18 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
44 Оригинальные статьи
этой программы, ядра клеток и площадь черного цвета, а площадь деградации желатина белого цвета.
Для статистического анализа готовили 3 слайда на каждый тип обработки и снимали 5 изображений со слайда. Свыше 100 клеток анализировали в каждом образце, чтобы получить процент площади деградации желатина по отношению к общей площади. Данные представляются как средние от 3 повторных экспериментов.
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка всех полученных данных была выполнена с помощью компьютерной программы GraphPad Prizm с использованием метода анализа One-Way ANOVA. Различия считались достоверными при p <0,05.
Результаты и обсуждение
Пептид RYQLHPYR ингибирует жизнеспособность клеток PC3 m-lN4
Мы изучали влияние пептида RYQLHPYR на жизнеспособность клеток РПЖ PC3 m-LN4, для которых характерна повышенная экспрессия RHAMM [51]. Чтобы понять, может ли пептид ингибировать рост раковых клеток, PC3 m-LN4 обрабатывались пептидом при концентрации 10 мкг/мл (2 х 10-7 М) в течение 24 ч. В качестве контроля мы использовали MEF, которые обрабатывали аналогично. Деление клеток анализировали с помощью резазурина (Alamar Blue-реагент), как описано в разделе «Материалы и методы». Результаты показали, что пептид ингиби-ровал жизнеспособность опухолевой клеточной культуры через 24 ч на ~80 %, однако не влиял на рост фибробластов мыши (рис. 1). Это свидетельствует о том, что пептид RYQLHPYR, связываясь с RHAMM, значительно ингибирует активность митохондриальных дегидрогеназ клетки, которые играют центральную роль в процессах клеточного дыхания и окислительного фосфорилирования, около 40 % протонного градиента для синтеза аденозинтрифосфата создается именно этим комплексом [52]. Таким образом, результаты показали, что RYQLHPYR-пептид обладает цитотоксическим действием за счет модуляции RHAMM.
Следует подчеркнуть, что жизнеспособность клеточных культур РПЖ значительно подавлялась низкими концентрациями пептида (2 х 10-7 М). Это указывает на то, что пептид является перспективным кандидатом в качестве противоопухолевого препарата.
Пептид RYQLHPYR индуцирует апоптоз и некроз
раковых клеток предстательной железы
Известно, что реализация апоптоза может происходить в результате комбинирования 2 основных сигнальных путей — рецепторзависимого и митохон-дриального [53, 54]. Внешний сигнальный путь осуществляется через поверхностные рецепторы смерти
120 -
100 -
80 -
g 60 -з
i® 40 -
20 -
Е
СО
U
5 &
5
о а
о \о
с
\о о d \о
S с
Ш -OQ. 1= g
-о i
рис. 1. Эффект пептида RYQLHPYR на жизнеспособность фибробластов и опухолевьа клеток предстательной железы (PC3 m-LN4) *Различия являются статистически значимыми при p <0,05; М ± m, n = 3
Fig. 1. Effect of the RYQLHPYR peptide on viability of fibroblasts and
prostate tumor cells (PC3 m-LN4)
*Significant differences atp <0.05; М± m, n = 3
клетки, специально предназначенные для включения программы апоптоза [53, 55]. Такими рецепторами смерти являются рецепторы Fas, TNFR1, DR3, DR4, DR5 [53—58]. Сигнальный путь апоптоза индуцируется физиологическими факторами-индукторами апоптоза, такими как гормоны, ростовые факторы, цитокины и др. [59, 60]. Посредством рецепторов смерти могут быть активированы 3 инициирующие каспазы: 2, 8 и 10 [61]. В отличие от внешнего сигнального пути апоптоза, митохондриальный путь его активации индуцируется действием цитотоксических агентов, радиации, повреждением ДНК, глюкокор-тикоидов, изменением теломеров [54]. Внутренний, митохондриальный путь сопровождается активацией белка Р53 и экспрессией генов, кодирующих белки семейств Bcl-2, Вах и Bid [54]. Эти белки вызывают пермеабилизацию митохондриальной мембраны, высвобождение цитохрома С, прокаспаз 2, 3, 7 и 9, белка AIF в цитоплазму, истощение митохондриаль-ного пула аденозинтрифосфата, что и приводит к апоптозу [62—65].
Поскольку мы показали, что жизнеспособность клеток PC3 m-LN4 значительно подавлялась пептидом, было важно классифицировать, какой тип гибели (апоптоз, некроз) наблюдается в клетках PC3 m-LN4. Анализ типа гибели клеток проводили методом ELISA, как описано в «Материалах и методах». Клетки, не обработанные пептидом, показали небольшой уровень апоптоза, поскольку каждая экспоненциально растущая клеточная культура содержит некоторое количество мертвых клеток (в норме приблизительно 3 %) вследствие спонтанной дифференциации и взросления клеточной линии. В то же время клетки, обработанные пептидом (концентрация
0
Оригинальные статьи 45
2 х 10-7 М), продемонстрировали высокий уровень апоптоза, а именно: пептид увеличивал апоптоз в опухолевых клетках приблизительно в 10 раз (см. таблицу). Эти результаты указывают на то, что RYQLHPYR-пептид и RHAMM вовлечены в апоптозные пути, которые индуцируют потерю энергии, и ингибиро-вание работы мембранных насосов клетки [66].
Затем мы исследовали эффект пептида на некроз клеточной линии PC3 m-LN4. Наши результаты показали, что пептид стимулировал некротическую гибель опухолевых клеток приблизительно в 2,5 раза. Эти результаты свидетельствуют о том, что индукция апоптоза под действием пептида сопровождается последующим развитием некроза опухолевых клеток. Следует отметить, что в современной онкологии индукция некроза используется как один из методов лечения злокачественных опухолей. Для подтверждения специфичности действия пептида RYQLHPYR на опухолевые клетки мы изучали влияние его на апоп-тоз и некроз нормальных фибробластов и RHAMM-/-. Результаты показали, что пептид не оказывал значительного эффекта на апоптоз и некроз нормальных клеток. Как видно из таблицы, уровень апоптоза
Влияние пептида RYQLHPYR на апоптоз и некроз клеточной линии PC3 m-LN4, фибробластов и (RHAMM-/-) клеток Effect of the RYQLHPYR peptide on apoptosis and necrosis of the PC3 m-LN4, fibroblast and (RHAMM-/-) cell lines
Ишы клеток Апоптоз (оптическая плотность при 405 нм, ед.) Apoptosis (absorbance некроз (оптическая плотность при 405 нм, ед.) Necrosis (absorbance
PC3 m-LN4 0,257 0,114
PC3 m-LN4 + пептид PC3 m-LN4 + peptide 2,213* 0,277*
Фибробласты Fibroblasts 0,621 2,324
Фибробласты + пептид Fibroblasts + peptide 0,656 2,231
Фибробласты (RHAMM-/) Fibroblasts (RHAMM-/) 0,423 2,269
Фибробласты (RHAMM-/-) + пептид Fibroblasts (RHAMM-/-) + peptide 0,690 1,710
*Различия являются статистически значимыми при p <0,05. *Significant differences atp <0.05.
в фибробластах был практически одинаковым до обработки пептидом и после (оптическая плотность 0,621 и 0,656 ед. соответственно). Установлено, что изначально уровень некроза в фибробластах был 2,324 ед., а после добавки пептида он составил 2,231 ед. Анализ данных показал, что наблюдаемые незначительные различия в уровне апоптоза и некроза в контрольных и обработанных пептидом фибробластах не являются статистически значимыми. Это свидетельствует о том, что пептид не влияет на уровень апоп-тоза и некроза в фибробластах, потому что в них нет такого высокого уровня экспрессии RHAMM, который наблюдается в опухолевых клетках. В раковых клетках пептид связывается с RHAMM и таким образом индуцирует апоптоз и некроз через сигнальные пути рецептора.
Чтобы подтвердить участие ЯНЛММ в апоптозе и некрозе, мы исследовали влияние пептида на апоп-тоз и некроз ЯНЛММ-/-, в которых отсутствует данный рецептор. Как видно из таблицы, пептид не влиял на уровни апоптоза и некроза в ЯНЛММ-/-. Наблюдаемые незначительные различия в уровне апоптоза (некроза) в контрольных фибробластах и обработанных пептидом не являются статистически значимыми. Эти данные указывают на то, что индукция апоптоза и некроза в опухолевых клетках под действием пептида ЯНЛММ-опосредована.
Таким образом, результаты показали, что пептид RYQLHPYR селективно влияет на опухолевые клетки, не затрагивая жизнеспособность нормальных клеток, и его действие осуществляется через RHAMM. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными о специфичности действия RHAMM-таргет пептидов на опухолевые клетки молочной железы [41, 42].
влияние пептида RYQLHPYR
на активность каспаз-3/7
Из литературы известно, что существует 2 основных пути апоптоза в клетке: митохондриальный и через рецепторы апоптоза [67]. Оба пути приводят к активации каспаз и запуску каскада реакций, приводящих к гибели клетки. Митохондрии являются ключевым регулятором каспазного каскада и апоптоза, при этом наблюдаются выброс цитохрома С в цитоплазму, активация каспазы 9 и затем каспаз-3/7 [67].
Поскольку мы наблюдали цитостатический эффект и индукцию апоптоза (некроза) в опухолевых клетках под действием пептида, то исследовали влияние данного пептида на митохондриальный тип апоптоза. Активация каспаз 3/7 является основным индикатором митохондриального апоптоза, поэтому мы изучали эффект пептида на активность кас-паз-3/7 в РС3 т^№-клетках. Фибробласты мыши использовали в качестве контрольных клеток.
К клеткам добавляли пептид (2 х 10-7 М) и инкубировали в течение 24 ч. Затем активность каспаз-3/7 измеряли методом расщепления меченого субстрата DEVD-p-нитроанилвда. Результаты показали, что активность каспаз-3/7 увеличилась примерно в 2 раза
0,3 -
s э;
s
S с
О. LO 1= d л
о а
с -о
ГО -Q
( I ^
0,25 -
0,2 -
0,15 -
0,1 -
0,05 -
PC3 m-LN4 PC3 m-LN4 + пептид / PC3 m-LN4 + peptide
Рис. 2. Влияние пептида RYQLHPYR на активность каспаз-3/7 в опухолевых клетках предстательной железы (PC3 m-LN4)
*Различия являются статистически значимыми при p <0,05; М ± m, n = 3
Fig. 2. Effect of the RYQLHPYR peptide in caspase-3/7 activity in prostate
tumor cells (PC3 m-LN4)
*Significant differences atp < 0.05; М± m, n = 3
в РС3 т^№-клетках, обработанных пептидом, по сравнению с необработанными (рис. 2). Пептид не оказывал влияния на активность каспаз в фибро-бластах. Эти данные подтверждают участие кас-паз-3 /7 в индукции апоптоза в опухолевых клетках РС3 так как пептид значительно повышал
активность каспаз-3 /7.
Наши результаты показали, что под действием пептида наблюдается активация каспаз-3/7, что свидетельствует об индукции митохондриального пути апоптоза. Таким образом, RHAMM участвует в передаче сигналов в митохондриальный путь апоптоза.
Влияние пептида RYQLHPYR
на инвазивность клеток РПЖ
Чтобы анализировать, может ли пептид ингиби-ровать инвазивность клеток РПЖ, клетки высеивали на Су3-флуоресцеин-желатиновые подложки, затем добавляли пептид или только ростовую среду фМЕМ, контроль) и выращивали клетки в течение 40 ч. После фиксации и окраски клеток согласно протоколу, описанному в «Материалах и методах», снимали изображения и анализировали площадь деградации желатина клетками. На рис. 3а—ж представлены изображения клеток РС3 без обработки пептидом. Показано, что инвазивные клетки РС3
0
Рис. 3. Анализ инвазивности клеток PC3 m-LN4. Конфокальные изображения клеток (а), ядер (б), актина (в) и деградации желатина (г). Желатин окрашен Cy3 (красная флуоресценция), ядро клеток окрашено DAPI (синяя флуоресценция), актин клеток окрашен FITC-фаллои-дином (зеленая флуоресценция). Изображения клеток, полученные с помощью программы ImageJ software: д — число клеток, е — площадь клеток (черный цвет), ж — площадь деградации желатина (белый цвет). х20
Fig. 3. Analysis of PC3 m-LN4 cell invasiveness. Confocal photos of cells (а), nuclei (б), actin (в), and gelatin degradation (г). Gelatin is stained with Cy3 (red fluorescence), nuclei are stained with DAPI (blue fluorescence), actin is stained with FITC-phalloidin (green fluorescence). Cell photos were obtained using the ImageJ software: д — number of cells, е — cell area (black), ж — gelatin degradation area (white). x20
Рис. 4. Эффект пептида на инвазивность опухолевых клеток. Конфокальные изображения клеток (а), ядер (б), актина (в) и деградации желатина (г): PC3 m-LN4клетки, обработанные пептидом. Желатин окрашен к Cy3 (красная флуоресценция), ядро клеток окрашено DAPI (синяя флуоресценция), актин клеток окрашен FITC-фаллоидином (зеленая флуоресценция). Изображения клеток, полученные с помощью программы ImageJsoftware: д — число клеток, е — площадь клеток (черный цвет), ж — площадь деградации желатина (белый цвет). х20 Fig. 4. Effect of the peptide on invasiveness of tumor cells. Confocal images of cells (а), nuclei (б), actin (в), and gelatin degradation (г): PC3 m-LN4 cells treated with the peptide. Gelatin is stained with Cy3 (red fluorescence), nuclei are stained with DAPI (blue fluorescence), actin is stained with FITC-phalloidin (green fluorescence). Cell photos were obtained using the ImageJ software: д — number of cells, е — cell area (black), ж — gelatin degradation area (white). x20
Инвазивные клетки PC3 m-LN4 имеют большое количество инвадоподий и высокую концентрацию актина на концах клетки (рис. 3а, в). Количественный анализ изображений показал, что клетки PC3 m-LN4, не обработанные пептидом, значительно деградировали желатин, и площадь его деградации составляет около 90 % общей площади клеток (рис. 3г, ж). Однако клетки, обработанные пептидом, претерпели морфологические изменения, количество инвадопо-дий уменьшилось, и площадь деградации желатина резко сократилась, что свидетельствует о подавлении инвазивности клеток (рис. 4а, г). На рис. 3ж и 4ж представлены изображения, полученные с помощью программы ImageJ software, показывающие число и площадь клеток (черного цвета) и площадь деградации желатина (белого цвета). Количественный анализ площади деградации желатина с помощью ImageJ software показал, что клетки, обработанные пептидом, деградировали только 0,14 % площади желатина по отношению к общей площади клеток, что свидетельствует об ингибировании инвазивности клеток на 99,86 % в сравнении с контролем (рис. 5).
Эти результаты показали, что пептид RYQLHPYR значительно ингибирует инвазивность опухолевых клеток предстательной железы. Данные согласуются с ранее опубликованными результатами, свидетельствующими,
120 -
100 -
£ с 80 -
3
о
60 -
40 -
20 -
PC3 m-LN4
PC3 m-LN + пептид / PC3 m-LN + peptide
Рис. 5. Количественный анализ деградации желатина клетками PC3 m-LN4 и клетками, обработанными пептидом RYQLHPYR, с помощью ImageJ программы.
*Различия являются статистически значимыми приp <0,05; М ± m, n = 3
Fig. 5. Quantitative analysis of gelatin degradation by PC3 m-LN4 cells and cells treated with the RYQLHPYR peptide performed using the ImageJ software.
*Significant differences atp < 0.05; М± m, n = 3
вызывают лизис желатина, относящийся к образованию инвадоподий в виде областей, в которых отсутствует флуоресценция желатина, — на конфокальных изображениях это область черного цвета (рис. 3а, г).
0
что RHAMM-таргет-пептиды ингибируют инвазивность опухолевых клеток молочной железы [40—42, 68, 69]. Таким образом, исследование показало, что пептид RYQLHPYR обладает антиметастатическим действием.
Заключение
Наши результаты продемонстрировали, что пептид RYQLHPYR при низкой концентрации (2 х 10-7 М)
ингибирует жизнеспособность, индуцирует апоптоз и некроз клеток предстательной железы. Индукция апоптоза происходит по митохондриальному пути. Пептид RYQLHPYR ингибирует инвазивность опухолевых клеток предстательной железы. Полученные результаты свидетельствуют, что пептид RYQLHPYR обладает противоопухолевой активностью и имеет терапевтический потенциал для лечения РПЖ.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R. et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer 2015;136(5):E359-86.
DOI: 10.1002/ijc.29210.
2. Lehrer R.I. Primate defensins. Nat Rev Microbiol 2004;2(9):727-38.
DOI: 10.1038/nrmicro976.
3. Hancock R.E. Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials. Lancet Infect Dis 2001;1(3):156-64.
DOI: 10.1016/S1473-3099(01)00092-4.
4. Koczulla A.R., Bals R. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential. Drugs 2003;63(4):389-406. DOI:10.2165/00003495-200363040-00005.
5. Otvos L.Jr. Antibacterail peptides and proteins with multiple cellular targets. J Pept Sci 2005;11(11):697-706. DOI: 10.1002/psc.698.
6. Nicolaou K.C., Jinyou X., Murphy F. et al. Total synthesis of sanglifehrin A. Chem Int Ed Engl 1999;38(16):2447-51.
7. Xia Z., Smith C.D. Total synthesis
of dendroamide A, a novel cyclic peptide that reverses multiple drug resistance. J Org Chem 2001;66(10):3459-66.
8. Davies J.S. the cyclization of peptides and depsipeptides. J Peptide Sci 2003;9(8):471-501.
DOI: 10.1002/psc.491.
9. Lyu P., Ge L., Ma R. et al. Identification and pharmaceutical evaluation of novel frog skin-derived serine proteinase inhibitor peptide-PE-BBI (Pelophylax esculentus Bowman-Birk inhibitor)
for the potential treatment of cancer. Sci
Rep 2018;8(1):14502.
DOI: 10.1038/s41598-018-32947-5.
10. Zainodini N., Hassanshahi G., Hajizadeh M. et al. Nisin Induces Cytotoxicity and Apoptosis in Human Asterocytoma Cell Line (SW1088). Asian Pac J Cancer Prev 2018;19(8):2217-22. DOI: 10.22034/APJCP.2018.19.8.2217.
11. Tanner J.D., Deplazes E., Mancera R.L. the Biological and Biophysical Properties
of the Spider Peptide Gomesin. Molecules 2018;23(7):E1733. DOI: 10.3390/molecules23071733.
12. Veloria J.R., Chen L., Li L. et al. Novel cell-penetrating-amyloid peptide conjugates preferentially kill cancer cells. MedChemComm 2017;9(1):121-30. DOI: 10.1039/c7md00321h.
13. Lindgren M., Rosenthal-Aizman K., Saar K. et al. Overcoming methotrexate resistance in breast cancer tumour cells by the use of a new cell-penetrating peptide. Biochem Pharmacol 2006;71(4):416-25.
DOI: 10.1016/j.bcp.2005.10.048.
14. Liang J.F., Yang V.C. Synthesis
of doxorubicin-peptide conjugate with multidrug resistant tumor cell killing activity. Bioorg Med Chem Lett 2005;15(22):5071-5. DOI: 10.1016/j.bmcl.2005.07.087.
15. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol 2005;3(3):238-50.
DOI: 10.1038/nrmicro1098.
16. Mader J.S., Hoskin D.W. Cationic antimicrobial peptides as novel cytotoxic agents for cancer treatment. Expert Opin Investig Drugs 2006;15(8):933-46. DOI: 10.1517/13543784.15.8.933.
17. Yuan J., You X., Ni G. et al. Iodine-125 labeled Australian frog tree host-defense peptides caerin 1.1 and 1.9 better inhibit human breast cancer cells growth
than the unlabeled peptides. 125I-caerin 1.9 may better be used for the treatment of breast cancer. Hell J Nucl Med 2018;21(2):115-20. DOI: 10.1967/s002449910803.
18. Уханова Т.М., Кулинич Е.А., Кудинова В.К. Терапевтические дозовые характеристики химерного пептида MM-D37K при парентеральном введении мышам BALB/C NUDE с колоректальным раком человека HCT-116. Российский биотерапевтический журнал 2017;16(2):36—41. DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-236-41. [Ukhanova T.M., Kulinich E.A.,
Kudinova V.K. Therapeutic dose characteristics of the chimeric peptide MM-D37K when administered parenterally to BALB/C NUDE mice with human colorectal cancer HCT-116. Rossiysky bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Biotherapeutic Journal 2017;16(2):36-41. (In Russ.)].
19. Xiang Y., Shan W., Huang Y. Improved anticancer efficacy of doxorubicin mediated by human-derived cell-penetrating peptide dNP2. Int J Pharm 2018;551(1-2):14-22.
DOI: 10.1016/j.ijpharm.2018.09.011.
20. Kritzer J.A., Stephens O.M., Guar-racino D.A. et al. p-Peptides as inhibitors of protein—protein interactions. Bioorg Med Chem 2005;13(1):11-6.
DOI: 10.1016/j.bmc.2004.09.009.
21. Qvit N., Mochly-Rosen D. Highly Specific Modulators of Protein Kinase C Localization: Applications to Heart Failure. Drug Discov Today Dis Mech 2010;7(2):e87-e93.
DOI: 10.1016/j.ddmec.2010.07.001.
22. Zhang X.X., Eden H.S., Chen X. Peptides in cancer nanomedicine: drug carriers, targeting ligands and protease substrates. J Control Release 2012;159(1):2-13.
DOI: 10.1016/jjconrel.2011.10.023.
23. Thayer A.M. Improving peptides. C&EN 2011;89(22):13-20.
24. Borghouts C., Kunz C., Groner B. Current strategies for the development of peptide-based anticancer therapeutics. J Pept Sci 2005;11(11):713-26.
DOI: 10.1002/psc.717.
25. Platt V.M., Szoka F.C.Jr. Anticancer Therapeutics: targeting macromolecules and nanocarriers to hyaluronan or CD44, a hyaluronan receptor. Mol Pharm 2008;5(4):474-86.
DOI: 10.1021/mp800024g.
26. Vives E., Schmidt J., Pelegrin A. Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery. Biochim Biophys Acta 2008;1786(2):126-38.
DOI: 10.1016/j.bbcan.2008.03.001.
27. Ijaz M., Wang F., Shahbaz M. et al.
the Role of Grb2 in Cancer and Peptides as Grb2 Antagonists. Protein Pept Lett 2018;24(12):1084-95. DOI: 10.2174/ 0929866525666171123213148.
28. Lisabeth E.M., Falivelli G.,
Pasquale E.B. Eph receptor signaling and ephrins. Cold Spring Harb Perspect Biol 2013;5(9):a009159. DOI: 10.1101/cshperspect.a009159.
29. Lamberto I., Lechtenberg B.C., Olson E. et al. Development and structural analysis of a nanomolar cyclic peptide antagonist for the EphA4 receptor. ACS Chem Biol 2014;9:2787-95.
DOI: 10.1021/cb500677x.
30. Wang Y., Menendez A., Fong C. et al. Ephrin B2/EphB4 mediates the actions of IGF-I signaling in regulating endochondral bone formation. J Bone Miner Res 2014;29:1900-13.
DOI: 10.1002/jbmr.2196.
31. Accardo A., Aloj L., Aurilio M. et al. Receptor binding peptides for target-selective delivery of nanoparticles encapsulated drugs. Int J Nanomedicine 2014;9:1537-57. DOI: 10.2147/IJN.S53593.
32. Patel A.R., Chougule M., Singh M. EphA2 targeting pegylated nanocarrier drug delivery system for treatment
of lung cancer. Pharm Res 2014; 31:2796-809.
DOI: 10.1007/s11095-014-1377-4.
33. Maxwell C.A., McCarthy J., Turley E. Cell-surface and mitotic-spindle RHAMM: moonlighting or dual oncogenic functions? J Cell Sci 2008;121(Pt 7):925-32.
DOI: 10.1242/jcs.022038.
34. Turley E. A., Naor D. RHAMM and CD44 peptides-analytic tools and potential drugs. Front Biosci (Landmark Ed) 2012;17:1775-94.
35. Tabarkiewicz J., Giannopoulos K. Definition of a target for immunotherapy and results of the first Peptide vaccination study in chronic lymphocytic leukemia. Transplant Proc 2010;42(8):3293-6. DOI: 10.1016/j. transproceed.2010.07.022.
36. Casalegno-Garduno R., Schmitt A., Schmitt M. Clinical peptide vaccination trials for leukemia patients. Expert Rev Vaccines 2011;10(6):785-99.
DOI: 10.1586/erv.11.56.
37. Esguerra K.V., Tolg C., Akentieva N. et al. Identification, Design and Synthesis of Tubulin-Derived Peptides as Novel Hyaluronan Mimetic Ligands for the Receptor for Hyaluronan-Mediated Motility (RHAMM/HMMR). Integr Biol (Camb). 2015;7(12):1547-60. DOI: 10.1039/c5ib00222b.
38. Luyt L.G., Turley E.A., Esguerra K.V. Rhamm binding peptides. International
Patent W02011/150495. 2011. London Health Sciences Centre Research Inc.
39. Turley E.A., Noble P.W., Bourguignon L.Y. Signaling properties of hyaluronan receptors. J Biol Chem 2002;277(7):4589-92.
DOI: 10.1074/jbc.R100038200.
40. Akentieva N.P., Shushanov S.S. Visualization of Ovarian Cancer Cells with Peptide VEGEGEEGEEY. Biochemistry (Moscow), Suppl A: Membrane and Cell Biology 2018; 12(2):189-98.
DOI: 10.1134/S1990747818020022.
41. Акентьева Н.П., Шушанов С.С., Котельников А.И. Эффект RHAMM-се-лективных пептидов на выживаемость клеток рака молочной железы. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2015;159(5):618—21. DOI: 10.1007/s10517-015-3041-3. [Akenteva N.P, Shushanov S.S, Kotelnikov A.I. Effects of RHAMM/ HMMR-Selective Peptides on Survival of Breast Cancer Cells. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2015;159(5):618-21. (In Russ.)].
42. Акентьева Н.П., Шушанов С.С. Ингибирующий эффект RHAMM-таргет пептидов на инвазивность клеток рака молочной железы. Вопросы онкологии 2016;62(6):831-7. ISSN 0507-3758. [Akentieva N.P., Shushanov S.S. Inhibitory effect
of RHAMM-target peptides on invasion of breast cancer cells. Voprosy onkologii = Problems in oncology 2016;62(6):831-7 (In Russ.)].
43. Tolg C., Hamilton S.R., Nakrieko K.A. et al. Rhamm-/- fibroblasts are defective in CD44-mediated ERK1, 2 mitogenic signaling, leading to defective skin wound repair. J Cell Biol 2006;175(6):1017-28. DOI: 10.1083/jcb.200511027.
44. Mäde V., Els-Heindl S., Beck-Sickinger A.G. Automated solid-phase peptide synthesis to obtain therapeutic peptides. Beilstein J Org Chem 2014;10:1197-212. DOI: 10.3762/bjoc.10.118.
45. Schreer A., Tinson C., Sherry J.P., Schirmer K. Application of Alamar blue/5-carboxyfluorescein diacetate acetoxymethyl ester as a noninvasive cell viability assay in primary hepatocytes from rainbow trout. Anal Biochem 2005;344(1):76-85.
DOI: 10.1016/j.ab.2005.06.009.
46. Terui Y., Furukawa Y., Kikuchi J. et al. Apoptosis during HL-60 cell differentiation is closely related to a G0/ G1 cell cycle arrest. J Cell Physiol 1995;164(1):74-7.
DOI: 10.1002/jcp.1041640110.
47. Liu C.Y., Takemasa A., Liles W.C. et al. Broad-spectrum caspase inhibition
paradoxically augments cell death in TNF-alfa-stimulated neutrophils. Blood 2003;101(1):295-304. DOI: 10.1182/blood-2001-12-0266.
48. Pradhan N., Pratheek B.M., Garai A.
et al. Induction of apoptosis by Fe (salen) Cl through caspase-dependent pathway specifically in tumor cells. Cell Biol Int 2014;38(10):1118-31. DOI: 10.1002/cbin.10308.
49. Artym V.V., Yamada K.M., Mueller S.C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol
Biol 2009;522:211-9.
DOI: 10.1007/978-1-59745-413-1_15.
50. Xu C., Wang Y., Yu X. et al. Evaluation of human mesenchymal stem cells response to biomimetic bioglass-collagen-hyaluronic acid-phospha-tidylserine composite scaffolds for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A 2009;88(1):264-73.
DOI: 10.1002/jbm.a.31931.
51. Rizzardi A.E., Vogel R.I., Koopmei-ners J.S. et al. Elevated hyaluronan and hyaluronan-mediated motility receptor are associated with biochemical failure in patients with intermediate-grade prostate tumors. Cancer 2014;120(12): 1800-9. DOI: 10.1002/cncr.28646.
52. Efremov R.G., Baradaran R., Sazanov LA. the architecture of respiratory complex I Nature 2010;465(7297):441-5.
DOI: 10.1038/nature09066.
53. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоп-тоза. М.: Эдиториал УРСС, 2002. [Baryshnikov A.Yu., Shishkin Yu.V. Immunological problems of apoptosis. M.: Editorial URSS, 2002. (In Russ.)].
54. Льюин Б., Кассимерис Л., Лингаппа В. и др. Клетки. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2011. [Lewin B., Kassimeris L., Langappa V. et al. Cells. Moscow: Binom. Laboratoriya znaniy, 2011. (In Russ.)].
55. Гордеева А.В., Лабас Ю.А., Звягиль-ская Р.А. Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция. Биохимия 2004;69(10):1301-13. [Gordeeva A.V., Labas Yu.A., Zvyagilskaya R.A. Apoptosis
of unicellular organisms: mechanisms and evolution. Biokhimiya = Biochemistry 2004;69(10):1301-13. (In Russ)].
56. Cory S. Apoptosis. Fascinating death factor. Nature 1994;367(6461):317-8. DOI: 10.1038/367317a0.
57. Smith C.A., Farrah T., Goodwin R.G. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell 1994;76(6):959-62.
58. Wiley S.R., Schooley K., Smolak P.J.
et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family that
induces apoptosis. Immunity 1995;3(6):673-82.
59. Pitti R.M., Marsters S.A., Ruppert S. et al. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J Biol Chem1996;271(22):12687-90.
60. Nagata S. Apoptosis by death factor.
Cell 1997;88(3):355-65.
61. Tartaglia L., Goeddel D.V. Two TNF receptors. Immunol Today 1992;13(5):151—3.
DOI: 10.1016/0167-5699(92)90116-0.
62. Peter M.E., Heufelder A.E., Hengar-tner M.O. Advances in apoptosis research. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94(24):12736-7.
63. Alberts B., Johnson A., Levis J. at al. Molecular biology of the cell. 5 th Edn. Garland Sci 2008.
64. Qian T., Nieminen A.L., Herman B. et al. Mitochondrial permeability transition
in pH-dependent reperfusion injury to rat hepatocytes. Am J Physiol 1997;273(6 Pt 1):1783-92.
65. Petit P.X., Susin S.A., Zamzami N. et al. Mitochondria and programmed cell death: back to the future. FEBS Lett 1996;396(1):7—13.
66. Манских В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение. Цитология 2007;49(11):909-15. [Manskikh V.N. Pathways of cell death and their biological importance.
Tsitologiya = Citology 2007;49(11): 909-15 (In Russ.)].
67. Bröker L.E., Kruyt F.A., Giaccone G. Cell death independent of caspases:
a review. Clin Cancer Res
2005;11(9):3155-62.
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2223.
68. Akentieva N. RHAMM-target peptides inhibit invasion of breast cancer cells. EBTJ 2017;1:138-148. DOI: 10.24190/ ISSN2564-615X/2017/02.05.
69. Akentieva N.P., Shushanov S.S. Inhibition of cancer cell invasiveness by the synthetic peptides GEGEEGEE and DFGEEAEE. Biochemistry (Moscow), Suppl A: Membrane and Cell Biology 2017;11(1):24-34.
DOI: 10.1134/S1990747816040127.
Вклад авторов:
Н.П. Акентьева: разработка дизайна исследования, постановка экспериментов, получение данных для анализа, анализ полученных данных, написание текста рукописи, обзор публикаций по теме статьи.
С.С. Шушанов: культивирование клеточных линий (PC3 m-LN4 и MEF), постановка экспериментов по влиянию пептида на апоптоз клеток, анализ полученных данных. Authors' contributions
N.P. Akentieva: study design; experimental set up, obtaining data for analysis, analysis of the obtained data; manuscript preparation; literature review on the subject of the article.
S.S. Shushanov: cell line cultures (PC3 m-LN4 and MEF), experiments on the effect of the peptide on cell apoptosis, analysis of the obtained data. ORCID авторов/ORCID of authors
Н.П. Акентьева/N. P. Akentieva: https://orcid.org/0000-0002-9126-3070 С.С. Шушанов/S.S. Shushanov: https://orcid.org/0000-0002-2273-3024
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа проводилась по тематической карте Минобрнауки РФ в соответствии с государственным заданием (регистрационный № 0089-2019-0014). Исследование выполнено без спонсорской поддержки.
Financial support. The study was performed per the subject card of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation in accordance with the state task (registration № 0089-2019-0014). The study wasn't supported by external sources.
Статья поступила: 11.09.2018. Принята в печать: 12.04.2019. Article reseived: 11.09.2018. Accepted for publication: 12.04.2019.
