CC BY
20
DOI: 10.17650/1726-9776-2021-17-4-85-93
Роль микроРНК в развитии радиорезистентности клеток рака предстательной железы (экспериментальное исследование)
М.А. Махоткин1, Д.А. Чеботарев1, М.Г. Тютякина1, А.Н. Машкарина1, В.А. Тарасов1, М.И. Коган1, 2, Е.А. Черногубова1
ФГБУН «Федеральный исследовательский центр Южный научный центр Российской академии наук»; Россия, 344006 Ростов-на-Дону, проспект Чехова, 41;
2ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России; Россия, 344022 Ростов-на-Дону, переулок Нахичеванский, 29
Контакты: Елена Александровна Черногубова [email protected]
Введение. Лучевая терапия - один из ведущих методов лечения рака предстательной железы на ранней и поздней стадиях развития. Значительная частота прогрессирования рака предстательной железы после лучевой терапии делает актуальными изучение молекулярных механизмов развития радиорезистентности и выявление прогностических маркеров ее развития.
Цель исследования - идентификация и анализ механизма действия микроРНК, регулирующих радиорезистентность клеток рака предстательной железы на модели андрогеннезависимой клеточной линии DU145. Материалы и методы. В работе использовали клеточные линии аденокарциномы предстательной железы человека: DU145 - гормононезависимую клеточную линию рака предстательной железы и DU145-RR - ее радиорезистентный вариант. Дифференциальную экспрессию микроРНК измеряли в культивируемых клетках DU145 и DU145-RR через 1 и 8 сут после однократного Y-облучения в дозе 4 Гр. Для анализа дифференциальной экспрессии микроРНК в исходном и радиорезистентном вариантах клеток DU145 использовали платформу HiSeq 2000 (Illumina Inc., США). Для идентификации микроРНК применяли базу данных miRBase v.21. Для биоинформатического анализа - базы данных miRTarbase 7.0 и KEGG PATHWAY.
Результаты. Результаты исследования показали, что аберрантная экспрессия miR-101-3p, -148a-3p, -21-3p, -532-5p, -92a-3p в клетках DU145-RR повышается по сравнению с таковой в клетках DU145, а miR-125b-5p, -23a-3p, -424-3p -снижается. Показано, что роль этих микроРНК связана с обеспечением функционального взаимодействия между ДНК-метилтрансферазами, транскрипционным регулятором протоонкогенного белка Myc, а также фосфатазой PTEN в регуляции активности протеинкиназных сигнальных каскадов MAPK и PI3K. Конститутивная активация данных каскадов приводит к повышению выживаемости, миграции, пролиферации и росту клеток. Заключение. Широкий спектр генов-мишеней и существенное изменение профилей экспрессии микроРНК при различных состояниях, включая переход злокачественных клеток в радиорезистентный статус, делают микроРНК перспективными прогностическими маркерами радиорезистентности при раке предстательной железы.
Ключевые слова: рак предстательной железы, радиорезистентность, микроРНК, DU145
Для цитирования: Махоткин М.А., Чеботарев Д.А., Тютякина М.Г. и др. Роль микроРНК в развитии радиорезистентности клеток рака предстательной железы (экспериментальное исследование). Онкоурология 2021;17(4):85-93. DOI: 10.17650/1726-9776-2021-17-4-85-93.
CV а CV
ев
u et
U
N а N it
The role of microRNAs in the development of radioresistance of prostate cancer cells (experimental study)
M.A. Makhotkin1, D.A. Chebotarev1, M.G. Tyutyakina1, A.N. Mashkarina', V.A. Tarasov1, M.I. Kogan1'2, E.A. Chernogubova1
'Federal Research Centre the Southern Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences; 41 Prospekt Chekhova, Rostov-on-Don 344006, Russia;
2Rostov State Medical University, Ministry of Health of Russia; 29 Nakhichevanskiy Pereulok, Rostov-on-Don 344022, Russia Contacts: Elena Aleksandrovna Chernogubova [email protected]
cv а cv
ев
Background. Radiation therapy is one of the leading treatments for early and late stage prostate cancer. Radiation therapy is one of the leading treatments for early and late stage prostate cancer. The significant frequency of prostate cancer progression after radiation therapy makes it relevant to study the molecular mechanisms of the development of radioresistance, to identify prognostic markers of its development.
Objective: identification and analysis of the mechanism of action of microRNAs regulating radioresistance of prostate cancer cells on the model of the androgen-independent DU145 cell line.
Materials and methods. We used human prostate adenocarcinoma cell lines: DU145-hormone-independent prostate cancer cell line and DU145-RR - its radioresistant variant. Differential microRNA expression was measured in cultured DU145 and DU145-RR cells 1, 8 days after a single gamma irradiation at a dose of 4 Gy. To analyze the differential expression of microRNAs in the initial and radioresistant variants of DU145 cells, the HiSeq 2000 platform (Illumina Inc., USA) was used. The miRBase v.21 database was used to identify microRNAs. The miRTarbase 7.0 and KEGG PATHWAY databases were used for bioinformatic analysis
Results. The results of the study showed that the aberrant expression of miR-101-3p, -148a-3p, -21-3p, -532-5p, -92a-3p in DU145-RR cells upregulated compared to that in DU145 cells, and miR-125b-5p, -23a-3p, -424-3p - downregulated. It has been shown that the role of these microRNAs is associated with the provision of functional interaction between ^ DNA methyltransferases, the transcriptional regulator of the proto-oncogenic protein Myc, and PTEN phosphatase in the
o regulation of the activity of MAPK and PI3K protein kinase signaling cascades. Constitutive activation of these cas-
cades leads to an increase in cell survival, migration, proliferation, and growth. cj Conclusion. A wide range of target genes and a significant change in the expression profiles of microRNAs in various
jn conditions, including the transition of malignant cells to a radioresistant status, makes microRNAs promising prognos-
tic markers of radioresistance in prostate cancer.
Key words: prostate cancer, radioresistance, microRNA, DU145
For citation: Makhotkin M.A., Chebotarev D.A., Tyutyakina M.G. et al. The role of microRNAs in the development of radioresistance of prostate cancer cells (experimental study). Onkourologiya = Cancer Urology 2021;17(4):85-93. (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9776-2021-17-4-85-93.
Введение
Лучевая терапия — один из ведущих методов лечения рака предстательной железы (РПЖ) на ранней и поздней стадиях развития. Значительная частота про-грессирования РПЖ после лучевой терапии делает актуальными изучение молекулярных механизмов развития радиорезистентности, выявление прогностических маркеров ее развития, определение мишеней таргетной терапии и разработку новых стратегий лечения для преодоления радиорезистентности.
Именно развитие радиорезистентности опухолевых клеток часто определяет низкую эффективность лучевой терапии [1, 2]. Радиорезистентность локализованного РПЖ представляет собой серьезную терапевтическую проблему, поскольку у 20—70 % пациентов с РПЖ после лучевой терапии возникает биохимический рецидив [3]. Почти у половины пациентов с биохимическим рецидивом в течение 15 лет развивается клинический рецидив заболевания, а у 1/3 пациентов — метастатический кастрационно-резистентный РПЖ [4]. Согласно клиническим данным опухолевая ткань 50 % больных с рецидивирующим течением РПЖ через 5 лет после проведения лучевой терапии будет обладать выраженной радиорезистентностью [5]. Понимание молекулярных механизмов радиорезистентности опухолевых клеток может позволить решить проблему развития рецидивов после лучевой терапии у больных РПЖ и предотвратить прогрессирование заболевания.
Идентификация и анализ биомаркеров радиорезистентности опухолевых клеток вызывают большой научный интерес. В настоящее время перспективными диагностическими и прогностическими биомаркерами РПЖ с точки зрения изучения являются микроРНК [6]. МикроРНК — малые некодирующие молекулы РНК, которые участвуют в эпигенетической регуляции многих физиологических и патологических процессов, выступают «скульпторами транскриптома», при этом являясь наиболее консервативными по последовательностям и механизмам экспрессии [7—9]. МикроРНК формируют координированную регуляторную систему, которая контролирует такие фундаментальные биологические процессы, как дифференцировка тканей, пролиферация, апоптоз, реакция на стресс и др. В последнем десятилетии появилось большое количество исследований, посвященных роли микроРНК в канцерогенезе. Изменения профилей экспрессии микроРНК были обнаружены при развитии большинства злокачественных опухолей, причем микроРНК могут выступать в роли онкогенов, драйверов злокачественной трансформации и являться опухолевыми супрессорами [10].
Также известно, что при РПЖ экспрессия микроРНК в опухолевых клетках и микроокружении опухоли модулируется ионизирующим излучением [11]. Многочисленные текущие исследования с использованием секвенирования нового поколения (next
generation sequencing, NGS) и технологии микрочипов посвящены анализу экспрессии микроРНК в клетках до и после воздействия ионизирующего излучения. Показано, что при клеточном ответе на радиацию при РПЖ происходит увеличение уровней экспрессии микроРНК miR-9, -9-1, -16, -18b, -22, -24, -25, -29a, -29b, -30a, -34a, -34c, -92a-2, -95, -130a, -146a, -154, -191, -200c, -222, -320a, -365-1, -365-2, -372, -379, -383, -449, -488, -520c, -520f, -548h, -550a, -4521; снижение уровней экспрессии miR-15a, -30d, -100, -106b, -107, -122a,-125a,-133b,-135b,-143,-145,-187,-196a,-197, -199a, -218, -320b, -342, -361, -374a, -487, -501, -521, -671, -3607, -4284; а микроРНК miR-141 и miR-221, отдельные микроРНК семейства let-7 и кластера miR-17-92 демонстрируют как снижение, так и увеличение уровня экспрессии [12—19].
Цель исследования — идентификация и анализ механизма действия микроРНК, регулирующих радиорезистентность клеток РПЖ на модели андрогеннеза-висимой клеточной линии DU145.
Материалы и методы
Роль микроРНК в развитии радиорезистентности клеток РПЖ изучали в эксперименте на следующих клеточных линиях аденокарциномы предстательной железы человека: DU145 — гормононезависимой клеточной линии РПЖ и DU145-RR — ее радиорезистентном варианте. Радиорезистентная линия DU145-RR была получена с использованием дробного облучения у-квантами фракциями по 4 Гр с недельным интервалом между последовательными облучениями, накопленная доза составила 44 Гр [20]. Радиорезистентность исходной и радиорезистентной клеточных линий оценивали с помощью клоногенного теста [20, 21].
Клетки культивировали в среде Игла МЕМ (Био-лоТ, Россия) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, США) и 50 мкг/мл гента-мицина при температуре 37 °С в 5 % атмосфере CO2. Тотальную РНК и фракции малых РНК выделяли с использованием miRNeasy Mini Kit (QIAGEN, США) и RNeasy Min Elute Cleanup Kit (QIAGEN, США). Количественное определение тотальной РНК проводили на приборе Qubit 3.0 Fluorometer (Life Science Technologies, США). Оценку спектра микроРНК в исходном и радиорезистентном вариантах клеток DU145 выполняли c помощью секвенирования на платформе HiSeq 2000 (Illumina Inc., США). Для идентификации микроРНК использовали базу данных miRBase v.21 [22].
К микроРНК относили последовательности, имеющие каноническую длину и не более одной замены нук-леотида. Анализ различий профилей экспрессии микроРНК проводили с использованием модификации точного метода Фишера, реализованного в статистическом пакете edgeR, для нормализации уровня экспрессии сравниваемых вариантов применяли метод ТММ (Trimmed Mean of M-values), показатель изменчивости BCV (biological coefficient ofvariation) принимали равным 0,1 [23]. В анализ были включены микроРНК, представленные хотя бы в одной из сравниваемых секвенированных библиотек комплементарных ДНК 25 и более ридами. Статистически значимыми принимали изменения экспрессии при уровне FDR (false discovery rate) <0,05.
Дифференциальную экспрессию микроРНК определяли в культивируемых клетках исходного и радиорезистентного вариантов DU145 на 1-е и 8-е сутки после однократного у-облучения в дозе 4 Гр.
Для биоинформатического анализа использовали базы данных miRTarbase 7.0 и KEGG PATHWAY [24, 25].
cv а
JN «t
CS
U
et
U
N а N it
Таблица 1. Спектр аберрантно экспрессирующихся микроРНК в клетках линий DU145 и DU145-RR после у-облучения Table 1. Spectrum of aberrantly expressed miRNAs in DU145 and DU145-RR cells after y-irradiation
Изменение экспрессии микроРНК
Change in microRNA expression
Увеличение экспрессии l lpregiilal.ed of expres
Однонаправленные индуцированные радиацией изменения экспрессии в клетках DU145-RR и DU145 Unidirectional radiation-induced changes of expression in DU145-RR and DU145 cells
let-7d-5p
miR-10a-5p
miR-15b-5p
miR-99b-5p miR-19a-3p
miR-146a-5p miR-19b-3p
miR-148b-3p miR-21-5p
miR-181d-5p miR-100-5p
miR-183-5p miR-181a-5p
miR-191-5p miR-181c-5p
miR-577 miR-424-5p
miR-548y
miR-744-5p
miR-7974
cv а CV «t
CS
Аберрантно экспрессируемые микроРНК DU145-RR без однонаправленных изменений в клетках исходной линии Aberrantly expressed microRNA of DU145-RR without unidirectional changes in cells of the original line
miR-21-3p
miR-92a-3p
miR-101-3p
miR-148a-3p
miR-532-5p
Окончание табл. 1 End of table 1
miR-23a-3p miR-125b-5p miR-424-3p
■
u <
u
N о N it
Результаты
Сравнение результатов полного профилирования микроРНК методом высокопроизводительного секвени-рования в клетках исходного и радиорезистентного вариантов линии DU145 позволило выделить спектр аберрантно экспрессирующихся микроРНК в клетках линий DU145 и DU145-RR после у-облучения (табл. 1).
Для дальнейшего анализа отобраны микроРНК без однонаправленных изменений в клетках исходной линии, которые включают как микроРНК, показавшие противоположно направленные изменения индуцированной радиацией аберрантной экспрессии в клетках DU145-RR по сравнению с таковой в клетках DU145, так и микроРНК, аберрантно изменяющиеся в клетках DU145-RR, но не демонстрирующие изменений в клетках DU145 (см. табл. 1). Дифферен-
циальная экспрессия этих микроРНК в клетках DU145-RR по сравнению с DU145 отражает сохраняющиеся в клеточных поколениях изменения метаболизма. Рассмотрены вероятные механизмы приспособлений клеток линий рака к повышенной мутагенной нагрузке с учетом изменения экспрессии именно этой группы микроРНК.
Источником информации о генах-мишенях отобранных нами микроРНК служили результаты, представленные в базе данных miRTаrbаse 7.0. При этом учитывали только результаты, полученные с использованием «строгих» методов, подтверждающих взаимодействие микроРНК—мишень. В результате KEGG-анализа идентифицированы значимые биологические пути, в которые вовлечены микроРНК, отобранные в клетках DU145-RR (табл. 2).
Таблица 2. Гены-мишени микроРНК, участвующие в процессах регуляции радиорезистентности клеток DU145-RR Table 2. MicroRNA target genes involved in the regulation of DU145-RR cell radioresistance
Гены-мишени
МикроРНК Уровень экспрессии 1 Target genes
MicroRNA Level oi expression Апоптоз Клеточный цикл Репарация ДНК
1 Apoptosis Cell cyde | DNA repair
miR-101-3p Повышен Upregulated MCL1 CCND1
miR-148a-3p Повышен Upregulated BCL2, BCL2L11, BAX CDKN1B, CDC25B
miR-21-3p Повышен Upregulated - - -
miR-532-5p Повышен Upregulated - - -
miR-92a-3p Повышен Upregulated BCL2L11 - -
miR-125b-5p Снижен Downregulated MCL1, BCL2, BAK1, BCL2L2, BBC3 CDKN2A, CDKN2D
miR-23a-3p Снижен Downregulated - - -
miR-424-3p Снижен Downregulated - - -
Обсуждение
Результаты исследования показали, что аберрантная экспрессия miR-101-3p, -148а-3р, -21-3р, -532-5р, -92а-3р в клетках DU145-RR повышается по сравнению с таковой в клетках DU145, а miR-125b-5p, -23а-3р, -424-3р — снижается (см. табл. 2). Других экспериментальных данных об изменении экспрессии этих ми-кроРНК при клеточном ответе на радиацию при РПЖ нами не обнаружено. Таким образом, участие идентифицированных микроРНК в формировании радиорезистентности в клетках DU145-RR описано впервые.
Далее рассмотрены возможные молекулярные механизмы и сигнальные пути, участвующие в развитии радиорезистентности при РПЖ.
Для miR-21-3p, -23a-3p и -21-5p фосфатаза PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) является мишенью (см. рисунок). Под контролем фос-фатазы PTEN находится активность киназы AKT (se-rine/threonine-protein kinase), которая катализирует отщепление фосфатной группы в положении 3D-инозитольного кольца фосфатидилинозитол-3-фосфатов, тормозя передачу сигнала по сигнальному
CV а
JN «t
CS
U
et
U
DU145-RR
Облучение / Irradiation
miR-148a-3p miR-101-3p miR-92a-3p
DNMT
Метилирование ДНК/DNA methylation
/\
Повреждение ДНК / DNA damage
MYC
miR-21a-3p miR-23a-3p -►
miR-1255-5p\
È
IMA PK/ ERK
PI3K/AKT
/ \
f-л
Деление
клеток /
Cell dioision
Рост и выживание клеток / Cell growth and survival
Репарация ДНК / DNA repair
Клеточный циел / Cell cycle
Апоптоз / Apoptosis
РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ / RADIORESISTANCE
N о N it
Усиление экс прессии гена ил и активация сигнильного пути |
Upregulated gene expression or actvation o0 the signatincj pathway
МикриРСК с повышенной экспрепсией /
UpreguSatged microRNA
-L Подавление экспрессии гена илл ингибирование сигнального пути/
Downreguiated gege exprersion or inhibition of thit signaling pathway
МикроРНК с пониженной экспрессией /
Downregulated microRNA
X Отсутствие регуляции /
Lack of regulation
Участие микроРНК в формировании радиорезистентности в клетках DU145-RR. AKT — RAC-альфа-серин/треонин-протеинкиназа; DNMT — ДНК-метилтрансфераза; ERK — внеклеточная сигнал-регулирующая киназа; PI3K — фосфатидилинозитол-3-киназа; PTEN — гомолог фосфатазы и тензинарасполагается в хромосоме 10; MAPK — митоген-активируемая протеинкиназа; mTOR — мишеньрапамицинау млекопитающих Participation of microRNAs in the formation of radioresistance in DU145-RR cells. AKT — RAC-alpha serine/threonine-protein kinase; DNMT — DNA methyltransferase; ERK — extracellular signal-regulated kinase; PI3K — phosphatidylinositol-3-kinase; PTEN — phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10; MAPK — mitogen-activatedprotein kinase; mTOR — mammalian target of rapamycin
пути PDK/AKT/mTOR [26]. На молекулярном уровне PTEN противодействует функциям фосфо-инозитид-3-киназы (phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K), которая способствует пролиферации и выживанию клеток частично за счет активации киназы mTOR (mammalian target of rapamycin) [26]. Результаты функциональных исследований показали, что PTEN является высокоэффек-о тивным супрессором опухолей, но он часто мутирует, делетирован или эпигенетически подавляется при различных онкологических заболеваниях человека, включая РПЖ [27-29]. Инактивация и делеция PTEN, ко-g торые часто возникают при метастатическом РПЖ, приводят к активации AKT [30]. По крайней мере у 70 % пациентов с РПЖ наблюдается потеря или из-Р менение одного аллеля PTEN, что может привести к активации пути PI3K/AKT [31]. Потеря активности g PTEN играет роль в устойчивости опухоли к химиоте-рапевтическим и противоопухолевым агентам [32, 33]. Поскольку мутации и делеции PTEN могут приводить ав к аномальной активации AKT, полагают, что он игра-о ет важную роль в устойчивости РПЖ к радиотерапии о [34]. Аномальная экспрессия PTEN в клетках РПЖ а* отмечается в 42 % случаев [35]. Таким образом, показе зано, что при локализованном РПЖ PTEN-зависимые о и независимые от PTEN механизмы активации AKT играют важную роль в нарушении регуляции сигнального пути PTEN/PI3K/AKT. При этом PTEN выступает в качестве переключателя между протеинкиназными сигнальными каскадами PI3K/AKT и MAPK/ERK [36]. Все данные указывают на то, что PTEN играет ключевую роль в регуляции чувствительности к радиотерапии в клетках РПЖ и может использоваться в качестве терапевтической мишени для терапии РПЖ.
Сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR участвует в процессах клеточного цикла и способствует возникновению и развитию опухолей, играет важную роль в регуляции роста и выживании клеток, особенно при прогрессировании и метастазировании [37]. Кроме этого, известно, что экспрессия белка теплового шока 90 (HSP90) значительно возрастает при РПЖ, а HSP90-опосредованный PI3K/AKT/mTOR-путь идентифицирован в качестве основного пути, связанного с радиорезистентностью клеток РПЖ [38]. Новые данные показывают, что сигнальный путь PI3K/AKT/ mTOR, аутофагия, эпителиально-мезенхимальный переход и раковые стволовые клетки участвуют в ме-тастазировании РПЖ, а также играют ведущую роль в развитии радиорезистентности и являются причиной рецидива опухоли после лучевой терапии [39-43].
Необходимо отметить, что протеинкиназные сигнальные каскады MAPK и PI3K участвуют в контроле радиационной чувствительности клеток. Так, с одной стороны, ингибирование PDK/AKT/mTOR-пути снижает резистентность клеток линий РПЖ к действию ионизирующего излучения, с другой - изменение
активности MAPK/ERK-пути может влиять на радиочувствительность клеток [5, 43]. Это связано с тем, что оба пути участвуют в регуляции ключевых процессов, определяющих чувствительность клеток к воздействию радиации, — апоптоза, прохождения клеточного цикла и репарации ДНК. Результаты KEGG-анализа показали, что мишенями отобранных в клетках DU145-RR микроРНК являются гены, прямо или косвенно включенные в контроль этих процессов (см. табл. 2). Обращает на себя внимание отсутствие микроРНК, связанных с процессами репарации ДНК в клетках DU145-RR. По-видимому, участие микроРНК в формировании радиорезистентности клеток DU145 связано не с репарацией ДНК, а с модуляцией процессов апоптоза и прохождения клеточного цикла. Ключевую роль в ответе клеток на индукцию повреждений ДНК играет транскрипционный фактор р53. PTEN активирует экспрессию р53, защищая от деградации, опосредованной MDM2 (mouse double minute chromosome amplified oncogene) [44].
Следствием увеличения экспрессии miR-21-3p и miR-92a-3p, геном-мишенью которых является PTEN, также считается блокирование транскрипционной активности ТР53 в клетках DU145-RR [45, 46]. В результате за счет ингибирующего фосфорилиро-вания Raf-1 (RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase) происходят активация PI3K/AKT-сигнального пути и подавление MAPK/ERK-каскада (см. рисунок). С другой стороны, снижение экспрессии miR-125b-5p, для которой мишенью также является генp53, может способствовать микроРНК-зави-симой посттранскрипционной активации экспрессии p53 в DU145-RR [47].
Дифференциальная чувствительность клеток к действию ионизирующего излучения определяется как традиционными мутациями, так и эпигенетическими изменениями генома, модулирующими функцию генов, прямо или косвенно влияющих на радиорезистентность. Метилирование ДНК является одним из главных эпигенетических механизмов, лежащих в основе радиорезистентности при РПЖ [48]. Ионизирующее излучение вызывает сайт-специфическое гипер- и гипо-метилирование, играющее ключевую роль в аберрантной экспрессии микроРНК, индуцированной радиацией и сохраняющейся в ряду клеточных поколений [21, 22]. Метилирование ДНК обеспечивается специфическими ферментами ДНК-метилтрансферазами (DNA methyltrans-ferase, DNMT). В связи с этим обращает на себя внимание, что в клетках DU145-RR отмечено увеличение экспрессии miR-101-3p, -148a-3p и -92a-3p, репрессирующих функцию ДНК-метилтрансфераз DNMT1, DNMT3A и DNMT3B (см. рисунок) [49, 50].
Экспрессия микроРНК зависит от транскрипционной активности их генов и посттранскрипционного дифференциального созревания. Ключевую роль в регуляции экспрессии микроРНК наряду с p53 играет
транскрипционный регулятор Мус. Мус и р53 участвуют в контроле регуляции экспрессии микроРНК как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне [51]. Увеличение экспрессии miR-101-3p и miR-148a-3p в клетках DU145-RR может приводить к подавлению активности ДНК-метилтрансфераз и, соответственно, к активации транскрипции гена МТС, что, в свою очередь, увеличивает экспрессию miR-92a-3p, участвующей в регуляции PTEN (см. рисунок).
Сведения о miR-424-3p ограниченны. Низкая экспрессия miR-424-3p тесно связана с агрессивным фенотипом РПЖ [52]. Роль miR-532-5p при РПЖ в настоящее время также мало изучена. Предполагают, что высокая экспрессия miR-532-5p в экзосомах мочи является предиктором рецидива РПЖ, но молекулярные механизмы развития рецидива все еще не ясны [53]. Таким образом, изменение экспрессии miR-424-3p и miR-532-5p, по-видимому, связано с развитием агрессивных форм РПЖ. Это позволяет предположить, что снижение экспрессии miR-424-3p и увеличение экспрессии miR-532-5p в клетках DU145-RR являются маркерами развития радиорезистентности.
Таким образом, результаты исследования позволяют предположить, что участие идентифицированных микроРНК в формировании радиорезистентности в клетках DU145-RR связано с регуляцией активности сигнальных каскадов Р13К/АКТ и MAPK/ERK, обеспечивающих выживание и рост клеток (см. рисунок).
Заключение
В настоящее время известны основные факторы, определяющие чувствительность к ионизирующему излучению: уровень воздействия активных форм кислорода, продолжительность клеточного цикла, состояние систем активации апоптоза, активность механизмов репарации повреждений ДНК и др. Однако значительная частота развития рецидивов онкологических заболеваний при радиотерапии делает актуальным дальнейшее изучение молекулярных механизмов развития радиорезистентности. Актуальными задачами современной биомедицины в преодолении радиорезистентности являются выявление прогностических маркеров развития и определение мишеней таргетной терапии.
Нами идентифицированы микроРНК, изменение профиля экспрессии которых играет роль в развитии радиорезистентности клеток гормононезависимой линии РПЖ DU145, проанализированы клеточные процессы и сигнальные пути, модификация которых, по-видимому, лежит в основе клеточного ответа на ионизирующее облучение при РПЖ.
Широкий спектр генов-мишеней и существенное изменение профилей экспрессии микроРНК при различных состояниях, включая переход злокачественных клеток в радиорезистентный статус, делают микроРНК перспективными кандидатами для поиска таких маркеров и мишеней.
CV а
JN «t
CS
U
et
U
N а N it
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Chaiswing L., Weiss H.L., Jayswal R.D. et al. Profiles of radioresistance mechanisms
in prostate cancer. Crit Rev Oncog
2018;23(1-2):39-67.
DOI: 10.1615/CritRevOncog.2018025946.
2. Kamran S.C., D'Amico A.V. Radiation therapy for prostate cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2020;34(1):45-69. DOI: 10.1016/j.hoc.2019.08.017.
3. Calleris G., Marra G., Dalmasso E. et al. Is it worth to perform salvage radical prostatectomy for radio-recurrent prostate cancer? A literature review. World J Urol 2019;37(8):1469-83. DOI: 10.1007/s00345-019-02749-z.
4. Nakabayashi M., Xie W., Buckle G. et al. Long-term follow-up of a phase II trial of chemotherapy plus hormone therapy for biochemical relapse after definitive local therapy for prostate cancer. Urology 2013;81(3):611-6.
DOI: 10.1016/j.urology.2012.12.025
5. Chang L., Graham P.H., Hao J. et al. PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors enhance radiosensitivity in radioresistant prostate cancer cells through inducing apoptosis, reducing autophagy, suppressing NHEJ and HR repair pathways.
Cell Death Dis 2014;5(10):e1437. DOI: 10.1038/cddis.2014.415.
6. Долотказин Д.Р., Шкурников М.Ю., Алексеев Б.Я. Роль микроРНК в диагностике рака предстательной железы. Онкоурология 2020;16(4):172—80. [Dolotkazin D.R., Shkurnikov M.Yu., Alekseev B.Ya. The role of microRNA
in the diagnosis of prostate cancer. Onko-urologiya = Cancer Urology 2020;16(4): 172-80. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/17269776-2020-16-4-172-180.
7. Федянин М.Ю., Игнатова Е.О., Тюляндин С.А. Роль микроРНК
при солидных опухолях. Злокачественные опухоли 2013;(1):3—14. [Fedyanin M.Yu., Ignatova E.O., Tyulyandin S.A. Role of microRNAs in solid tumors. Zlokachestvennye opuholi = Malignant Tumours 2013;(1): 3—14. (In Russ.)].
DOI: 10.18027/2224-5057-2013-1-3-14.
8. Запорожченко И.А., Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П. Основы биологии микроРНК: строение, биогенез и регу-ляторные функции (обзорная статья). Биоорганическая химия 2020;46(1):3—17. [Zaporozhchenko I.A., Rykova E.Y.,
Laktionov P.P. The fundamentals of miRNA biology: structure, biogenesis, and regulatory functions. Bioorganicheskaya khimiya = Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2020;46(1):3-17. (In Russ.)]. DOI: 10.1134/S106816202001015X. 9. Bartel D.P. Metazoan MicroRNAs. Cell 2018;173(1):20-51. DOI: 10.1016/j.cell.2018.03.006.
10. Farazi T.A., Hoell J.I., Morozov P., Tuschl T. MicroRNAs in human cancer. Adv Exp Med Biol 2013;774:1-20. DOI: 10.1007/978-94-007-5590-1_1.
11. Labbé M., Hoey C., Ray J. et al. MicroRNAs identified in prostate cancer: correlative studies on response to ionizing radiation. Mol Cancer 2020;19(1):63. DOI: 10.1186/s12943-020-01186-6.
12. Xu C.G., Yang M.F., Fan J.X., Wang W. MiR-30a and miR-205 are downregulated in hypoxia and modulate radiosensitivity of prostate cancer cells by inhibiting autophagy via TP53INP1. Eur Rev
Med Pharmacol Sci 2016;20(8):1501-8.
13. Tao Z., Xu S., Ruan H. et al. MiR-195/-16 family enhances radiotherapy via T cell activation in the tumor microenvironment
cv а
JN «t
CS
U
et
U
N а N it
by blocking the PD-L1 immune checkpoint. Cell Physiol Biochem 2018;48(2):801—14. DOI: 10.1159/000491909
14. Mao A., Liu Y., Wang Y. et al. miR-449a enhances radiosensitivity through modulating pRb/E2F1 in prostate cancer cells. Tumour Biol 2016;37(4):4831—40. DOI: 10.1007/s13277-015-4336-8.
15. Mao A., Zhao Q., Zhou X. et al. MicroRNA-449a enhances radiosensitivity by downregulation of c-Myc in prostate cancer cells. Sci Rep 2016;6:27346.
DOI: 10.1038/srep27346
16. Mercatelli N., Coppola V., Bonci D. et al. The inhibition of the highly expressed miR-221 and miR-222 impairs the growth of prostate carcinoma xenografts in mice. PLoS One 2008;3(12):e4029.
DOI: 10.1371/journal.pone.0004029.
17. Wang F., Mao A., Tang J. et al. microRNA-16-5p enhances radiosensitivity through modulating Cyclin D1/E1-pRb-E2F1 pathway in prostate cancer cells. J Cell Physiol 2019;234(8):13182—90.
DOI: 10.1002/jcp.27989.
18. Li B., Shi X.B., Nori D. et al. Down-regulation of microRNA 106b is involved in p21-mediated cell cycle arrest in response to radiation in prostate cancer cells. Prostate 2011;71(6):567—74. DOI: 10.1002/pros.21272.
19. McDermott N., Meunier A., Wong S.
et al. Profiling of a panel of radioresistant prostate cancer cells identifies deregulation of key miRNAs. Clin Transl Radiat Oncol 2017;2:63-8. DOI: 10.1016/j.ctro.2017.01.005.
20. Чеботарев Д.А., Махоткин М.А., Набока А.В. и др. Получение радиорезистентных вариантов клеток линий HeLa и DU145. Наука Юга России 2017;13(4):101—6. [Chebotarev D.A., Makhotkin M.A., Naboka A.V. et al. Obtaining of radioresistant variants
of HeLa and DU145 cell lines. Nauka yuga Rossii = Science of the South of Russia 2017;13(4):101—6. (In Russ.)]. DOI: 10.23885/2500-0640-2017-3-4-101-106.
21. Чеботарев Д.А., Махоткин М.А., Набока А.В. et al. Участие микроРНК в регуляции радиорезистентности клеток HeLa и DU145. Генетика 2019;55(9):1011—20. [Chebotarev D.A., Makhotkin M.A., Naboka A.V. et al. Involvement of MicroRNAs
in regulation of radioresistance of HeLa and DU145 Cells. Genetika = Russian Journal of Genetics 2019;55(9):1011—20. (In Russ.)]. DOI: 10.1134/S1022795419090047.
22. Kozomara A., Griffiths-Jones S. miRBase: integrating microRNA annotation
and deep-sequencing data. Nucleic Acids Res 2011;39:D152—7. DOI: 10.1093/nar/gkq1027.
23. McCarthy D.J., Chen Y., Smyth G.K. Differential expression analysis
of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Res 2012;40(10):4288-97. DOI: 10.1093/nar/gks042.
24. Chou C.H., Shrestha S., Yang C.D. et al. miRTarBase update 2018: a resource
for experimentally validated microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res 2018;6(D1):D296-302. DOI: 10.1093/nar/gkx1067.
25. Kanehisa M., Furumichi M., Tanabe M. KEGG: new perspectives on genomes, pathways, diseases and drugs. Nucleic Acids Res 2017;45(D1):D353-61. DOI: 10.1093/nar/gkw1092.
26. Sansal I., Sellers W.R. The biology and clinical relevance of the PTEN tumor suppressor pathway.
J Clin Oncol 2004;22(14):2954-63. DOI: 10.1200/JCO.2004.02.141.
27. Sircar K., Yoshimoto M., Monzon F.A.
et al. PTEN genomic deletion is associated with p-Akt and AR signalling in poorer outcome, hormone refractory prostate cancer. J Pathol 2009;218(4):505-13. DOI: 10.1002/path.2559.
28. De Muga S., Hernandez S., Agell L. et al. Molecular alterations of EGFR and PTEN in prostate cancer: association with highgrade and advanced-stage carcinomas. Mod Pathol 2010;23:703-12.
DOI: 10.1038/modpathol.2010.45.
29. Reid A.H., Attard G., Ambroisine L. et al. Molecular characterisation of ERG, ETV1 and PTEN gene loci identifies patients at low and high risk of death from prostate cancer. Br J Cancer 2010;102:678-84.
DOI: 10.1038/sj.bjc.6605554.
30. Wang S., Gao J., Lei Q. et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell 2003;4(3):209-21.
DOI: 10.1016/s1535-6108(03)00215-0.
31. Gray I.C., Stewart L.M., Phillips S.M. et al. Mutation and expression analysis of the putative prostate tumour-suppressor gene PTEN. Br J Cancer 1998;78(10):1296-300.
DOI: 10.1038/bjc.1998.674
32. Faratian D., Goltsov A., Lebedeva G. et al. Systems biology reveals new strategies
for personalizing cancer medicine and confirms the role of PTEN in resistance to trastuzumab. Cancer Res 2009;69(16):6713-20. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-09-0777.
33. Mao C., Liao R.Y., Chen Q. Loss of PTEN expression predicts resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies in patients with metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 2010;102(5):940. DOI: 10.1038/sj.bjc.6605575.
34. Zafarana G., Ishkanian A.S., Malloff C.A. et al. Copy number alterations of c-MYC and PTEN are prognostic factors
for relapse after prostate cancer radio-
therapy. Cancer 2012;118(16):4053-62. DOI: 10.1002/cncr.26729.
35. Teng D.H., Hu R., Lin H. MMAC1/ PTEN mutations in primary tumor specimens and tumor cell lines. Cancer Res 1997;57(23):5221-5.
36. Zhou J., Du T., Li B. et al. Crosstalk between MAPK/ERK and PI3K/AKT signal pathways during brain ischemia/reperfusion.
ASN Neuro 2015;7(5):1759091415602463. DOI: 10.1177/1759091415602463.
37. Xu F., Na L., Li Y., Chen L. Roles of the PI3K/AKT/mTOR signalling pathways in neurodegenerative diseases and tumours. Cell Biosci 2020;10:54. DOI: 10.1186/s13578-020-00416-0.
38. Chang L., Ni J., Beretov J. et al. Identification of protein biomarkers and signaling pathways associated with prostate cancer radioresistance using label-free LC-MS/MS proteomic approach. Sci Rep 2017;7:41834. DOI: 10.1038/srep41834.
39. Burgio S.L., Fabbri F., Seymour I.J. et al. Perspectives on mTOR inhibitors
for castration-refractory prostate cancer. Curr Cancer Drug Targets 2012;12(8):940-9. DOI: 10.2174/156800912803251234.
40. Griffin C., McNulty J., Pandey S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int J Oncol 2011;38(6): 1549-56. DOI: 10.3892/ijo.2011.977.
41. Nauseef J., Henry M. Epithelial-to-mesenchymal transition in prostate cancer: paradigm or puzzle? Nat Rev Urol 2011;8(8):428-39.
DOI: 10.1038/nrurol.2011.85.
42. Li H., Tang D.G. Prostate cancer stem cells and their potential roles in metastasis. J Surg Oncol 2011;103(6):558-62.
DOI: 10.1002/jso.21806.
43. Chang L., Graham P.H., Hao J. et al. Emerging roles of radioresistance
in prostate cancer metastasis and radiation therapy. Cancer Metastasis Rev 2014;33(2-3):469-96. DOI: 10.1007/s10555-014-9493-5.
44. Nakanishi A., Kitagishi Y., Ogura Y., Matsuda S. The tumor suppressor PTEN interacts with p53 in hereditary cancer. Int J Oncol 2014;44(6):1813-9.
DOI: 10.3892/ijo.2014.2377.
45. Xu J., Zhang W., Lv Q., Zhu D. Overexpression of miR-21 promotes
the proliferation and migration of cervical cancer cells via the inhibition of PTEN. Oncol Rep 2015;33(6):3108-16. DOI: 10.3892/or.2015.3931.
46. Riley K.J., Rabinowitz G.S., Yario T.A. et al. EBV and human microRNAs co-target oncogenic and apoptotic viral and human genes during latency. EMBO J 2012;31(9):2207-21.
DOI: 10.1038/emboj.2012.63.
47. Nagpal V., Rai R., Place A.T. et al. MiR-125b is critical for fibroblast-
to-myofibroblast transition and cardiac fibrosis. Circulation 2016;1339(3): 291-301. DOI: 10.1161/ CIRCULATIONAHA.115.018174.
48. Macedo-Silva C., Benedetti R., Ciardiello F. et al. Epigenetic mechanisms underlying prostate cancer radioresistance. Clin Epigenet 2021;13(1):125.
DOI: 10.1186/s13148-021-01111-8.
49. Jili S., Eryong L., Lijuan L., Chao Z. RUNX3 inhibit laryngeal squamous cell carcinoma malignancy under
the regulation of miR-148a-3p/DNMT1 axis. Cell Biochem Funct 2016;34(8):597-605. DOI: 10.1002/cbf.3233.
50. Zhang J., Yang C., Wu C. et al. DNA Methyltransferases in cancer: biology, paradox, aberrations, and targeted therapy. Cancers (Basel) 2020;12(8):2123.
DOI: 10.3390/cancers12082123.
51. Bui T.V., Mendell J.T. Myc: maestro of microRNAs. Genes Cancer 2010;1(6):568-75.
DOI: 10.1177/1947601910377491.
52. Richardsen E., Andersen S., Al-Saad S. et al. Low expression of miR-424-3p is highly correlated with clinical failure in prostate cancer. Sci Rep 2019;9(1):10662.
DOI: 10.1038/s41598-019-47234-0.
53. Kim M.Y., Shin H., Moon H.W. et al. Urinary exosomal microRNA profiling in intermediate-risk prostate cancer. Sci Rep 2021; 11(1):7355. DOI: 10.1038/s41598-021-86785-z.
Вклад авторов
М.А. Махоткин: биоинформатический анализ, написание текста рукописи; Д.А. Чеботарев: проведение экспериментальных исследований, анализ полученных данных; М.Г. Тютякина, А.Н. Машкарина: проведение экспериментальных исследований; В.А. Тарасов: разработка дизайна исследования, научное руководство;
М.И. Коган: разработка концепции статьи, анализ полученных данных, написание текста рукописи; Е.А. Черногубова: обзор публикаций по теме статьи, написание текста рукописи. Authors' contributions
M.A. Makhotkin: bioinformatics analysis, article writing;
D.A. Chebotarev: experimental research, analysis of the obtained data; M.G. Tyutyakina, A.N. Mashkarina: experimental research;
V.A. Tarasov: developing the research design, scientific leadership;
M.I. Kogan: developing the research concepts, analysis of the obtained data, article writing;
E.A. Chernogubova: reviewing of publications of the article's theme, article writing.
cv a JN it
CS
U
u
N a N it
ORCID авторов / ORCID of authors
М.А. Махоткин / M.A. Makhotkin: https://orcid.org/0000-0001-6757-7662 Д.А. Чеботарев / D.A. Chebotarev: https://orcid.org/0000-0003-3474-9311 М.Г. Тютякина / M.G. Tyutyakina: https://orcid.org/0000-0003-2983-997X А.Н. Машкарина / A.N. Mashkarina: https://orcid.org/0000-0002-0802-6841 М.И. Коган / M.I. Kogan: https://orcid.org/0000-0002-1710-0169 Е.А. Черногубова / E.A. Chernogubova: https://orcid.org/0000-0001-5128-4910
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания ФГБУН «Федеральный исследовательский центр Южный научный центр Российской академии наук» (номер государственной регистрации 01201363192).
Financing. The study was performed as part of the State assignment of the Federal Research Centre the Southern Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences (state registration number 01201363192).
Статья поступила: 09.08.2021. Принята к публикации: 20.10.2021. Article submitted: 09.08.2021. Accepted for publication: 20.10.2021.
