CC BY
126
БИОТЕРАПИЯ ЭКСПРЕССИЯ ИНТЕРФЕРОНЗАВИСИМЫХО 53
УДК 616.006-441-08-059-092.9:611.13/.16.018:577.21.088 Т.М. Соколова1, З.А. Соколова2, М.А. Рубцова2, А.Ю. Барышников2 ЭКСПРЕССИЯ ИНТЕРФЕРОНЗАВИСИМЫХ И АПОПТОЗНЫХ ГЕНОВ
В КЛЕТКАХ КАРЦИНОМЫ ПРОСТАТЫ DU145: ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ ИНТЕРФЕРОНОВ И ИХ ИНДУКТОРОВ - ДВУСПИРАЛЬНЫХ РНК
:ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Соколова Татьяна Михайловна, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории энзимологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН
адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16; тел.: +7(499)190-30-58 e-mail: tmsokolovavir@.mail. ru
Статья поступила: 26.02.2010, принята к печати 02.03.2010.
Резюме
Цель исследования - характеристика клеток карциномы простаты DU145 в отношении экспрессии генов системы интерферона и апоптоза, имеющих важное значение для оценки прогрессии рака предстательной железы и лекарственной устойчивости. Показано положительное действие препаратов Альфарона, Ингарон и дсРНК-Ридостин и синтетического комплекса поли(И)-поли(Ц) на уровни транскрипции генов клеточной защиты и продукцию некоторых интерлейкинов. Сравнительный полуколичественный ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов позволил выявить стимуляцию синтеза мРНК ИФН-а, ИФН-Р, олигоаденилатсинтетазы, РНК-азы L, дсРНК-протеинкиназы, Fas-антигена (CD95) и, вместе с тем - подавление мРНК протоонкогена Bcl-2. Обработка клеток DU145 препаратами ИФН и дсРНК приводила к синтезу ИЛ 10 и ФНО-а и более высокой продукции ИЛ6. Полученные данные дают основание рекомендовать применение этих отечественных препаратов ИФН и дсРНК в качестве лекарственных средств у больных с РПЖ.
Ключевые слова: карцинома простаты - клеточная линия DU145, гены системы интерферона и апопто-за, препараты Альфарона, Ингарон и дсРНК-Ридостин.
T.M. Sokolova1, Z.A. Sokolova2, M.A. Rubtsova2, A.Yu. Baryshnikov2
EXPRESSION OF INTERFERON-DEPENDENT AND APOPTOSIS GENES
IN CARCINOMA PROSTATE CELLS DU145: INFLUENCE PREPARATIONS OF INTERFERON
AND ITS INDUCTOR - DOUBLE STRANDED RNAS
'D.I. Ivanovsky Institute of Virology, RAMS, Moscow
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
Abstract
The aim of this study was to describe the expression of interferon system and apoptosis genes in prostate carcinoma cells DUI45 which are known to of great importance in prostate cancer progression and therapeutic resistance. Here we show the positive effect of Alpharona, Ingaron, dsRNA-Ridostin and synthetic complex poly(I)-poly(C) in activation of cellular defense genes transcription and the protein levels of some interleukins. Comparative semiquantitative gene expression analysis by RT-PCR allowed to reveal the stimulation of IFN-a, IFN-P, oligoadenylate synthetase, RNAse L, dsRNA-protein kinase, Fas-Ag(CD95) genes transcription, on the other hand, we observed the inhibition of protooncogene Bcl-2 gene expression. Treatment of DUI45 prostate carcinoma cells with IFN and dsRNA resulted in ILI0 and TNF-a protein synthesis and increased IL6 production. Based on the data obtained, we could recommend IFNs and dsRNA for clinical treatment of patients with prostate cancer.
Key words: prostate carcinoma, DUI45, interferons, apoptosis, expression, Alpharona, Ingaron, Ridostin.
Введение
Уровни экспрессии многочисленных онкогенов и их супрессоров в эпителиальных линиях клеток и тканях рака простаты активно изучаются [7]. Однако специальных исследований активности генов системы интерферона в раковых клетках простаты не проводилось. Недавние работы указывают на вероятную этиологическую роль нового ретровируса ХМЬУ, родственного вирусу лейкоза мышей, в возникновения рака предстательной железы [8]. Поэтому важно исследовать эффекты препаратов ИФН и их индукторов, обладающих выраженной антивирусной и антипролифера-тивной активностью [2]. Кроме того, системы ИФН и апоптоза тесно взаимосвязаны между собой общими биохимическими механизмами регуляции [1; 2]. Так,
было показано, что РНКаза Ь и Bcl-2 имеют важное значение в становление РПЖ [8; 10]. В данном исследовании использовали клетки рака РПЖ БШ45. Эти клетки андрогеннезависимы, не продуцируют ПСА и имеют ряд генетических нарушений (делеции в хромосомах 1; 9; 11; хромосома 13 отсутствует).
Задачи исследования
1. Определить методом полуколичественного ОТ-ПЦР конститутивные уровни транскрипции ключевых мРНК систем интерферона (а-, Р- и у-ИФН, ферментов олигоаденилатсинтетазы (ОАС), РНК-азы Ь и дсРНК-зависимой протеинкиназы), мРНК факторов апоптоза Fas-Ag и Bcl-2 и мРНК белка цитоскелета - гамма-актина;
2. Выявить влияние препаратов интерферонов, производимых в нашей стране (альфарона и инга-рон), а также двуспиральных (дс) РНК (синтетический комплекс поли(И)-поли(Ц) и ридостин) на генную активность клеток DU145 и секрецию ими цитокинов. Эти данные важны не только для обнаружения изменений в уровнях экспрессии генов клеточного иммунитета в клетках рака простаты, но и для поиска новых дополнительных лекарственных средств коррекции систем клеточной защиты у больных РПЖ.
Материалы и методы
Клетки DU145
Опухолевая клеточная линия DU145 (рак предстательной железы) была получена из лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Клеточная линия имеет монослойный характер роста. Клетки линии DU145 культивировали в соответствующей полной среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10мМ HEPES (Sigma, США), 2мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гентамицина (ICN, США), аминокислоты, витамины (ICN, США). Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста и снимали с пластика раствором Версена.
Обработка клеток DU145 препаратами ИФН и дсРНК
Осуществляется внесением препаратов в свежую питательную среду RPMI-1640 с 10% ТЭС. Контрольные варианты клеток (без добавления препаратов ИФН и дсРНК) и опытные варианты клеток (с добавлением препаратов) дублированы в 2 флаконах. Дозы препаратов иФн альфарона (рекомбинантный человеческий а2-ИФН, «Фармаклон») 500 МЕ/мл, ингарон (рекомбинантный человеческий у-ИФН, «Фармаклон») 1000 МЕ/мл, поли(И)-
поли(Ц) 100 мкг/мл (Sigma, США) и ридостин (РНК киллерных штаммов дрожжей, содержащая 10% дсРНК, НПО «Вектор») 1000 мкг/мл. Инкубация клеток с препаратами ИФН проведена при 37 °С в течение 24 ч, с препаратами дсРНК - 2 ч при 37 °С. Затем клетки дважды промывали раствором фосфатного буфера с 0,1 M NaCl (рН 7,4) и выделяли РНК.
Транскрипцию мРНК определяли полуколичественным методом ОТ-ПЦР Выделение РНК из клеток DU145 проводили с помощью набора для выделения суммарной клеточной РНК (RNAgents Total RNA isolation system «Promega»). К монослою клеток (~10-7) добавляли буфер лизиса в объеме 600 мкл и экстрагировали в присутствии 0,2 М ацетата натрия (рН 5,5). РНК осаждали изопропанолом при -20 С, осадок промывали 70 %-ным этанолом. Осадок РНК растворяли в воде с добавлением ингибитора нуклеаз (RNAsin 40 ед/мкл «Promega»). Половина тотальной РНК была очищена поли(А)РНК на магнитных частицах с пришитым олиго(dT)30 («Силекс», Москва). Реакцию ОТ проводили на препарате суммарной РНК и поли(А) РНК с гексануклеотидными (random) и олиго^^^ праймерами при 42 С 1 ч. В инкубационной смеси концентрация фермента обратная транскриптаза MuLV составляла 200 ед/мкл. Аликвоты полученных кДНК разводили в 5-1000 раз и добавляли в ПЦР. Специфические пары праймеров для исследованных видов мРНК рассчитаны по известной первичной структуре с по-
мощью компьютерной программ Олиго3.4 [3; 4]. ПЦР проводили по следующей схеме: 50 циклов амплификации на матрицах кДНК в смеси с термостабильной Tag-полимеразой (5 ед/мкл) при Т отжига 50-52 °С, ДНК-инкубатор Bioexcellence.
ДНК-амплификаты анализировали электрофорезом в 1,5 %-ных агарозных гелях с бромистым этидием. Размер специфических продуктов устанавливали по положению ДНК-маркеров (DNA ladder 100-1000 bp).
Определение цитокинов методом ИФА
После инкубации клеток DU145 с препаратами ИФН и дсРНК (как описано выше) культуральную жидкость собирали для количественного определения интерлекинов ИЛ6, ИЛ10, фактора некроза опухолей ФНО-а и а2-ИФН с помощью наборов реагентов ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург) согласно инструкции производителя. Результаты учитывали на приборе Titertek Multiskan при X 450 нм.
Результаты и обсуждение
Транскрипционная активность
ИФН-зависимых и апоптозных генов
в клетках DU145
В табл. 1 суммированы результаты определения полуколичественным методом ОТ-ПЦР экспрессии группы генов системы ИФН и апоптоза в клетках DU145. Исследованы шесть генов кодирующих белки системы ИФН (а-; P-и у-ИФН, ферменты олигоаденилатсинтетазу, РНК-азу L и дсРНК-зависимую протеинкиназу) и два гена-фактора регуляции апоптоза Fas-Ag и Bcl-2. Также проанализирована транскрипционная активность гена белка цитоскелета - гамма-актина.
Такой способ полуколичественного определения мРНК в клетках различного происхождения позволил ранее выявить изменения в экспрессии ИФН-зависимых и апоптозных генов при ряде вирусных инфекций и оценить эффективность действия антивирусных препаратов и индукторов ИФН [5; 6]. Представленные результаты получены на препаратах суммарной мРНК и поли(А)РНК из DU145 клеток (табл. 1; рис. А-Б). Установленные уровни транскрипции для очищенной поли(А)РНК были на 1-2 порядка ниже, чем для суммарной мРНК, по-видимому, вследствие потерь в процессе выделения фракции мРНК на олиго(дТ)-магнитных частицах, а также по причине отсутствия поли(А)-участков у части клеточных мРНК.
Поэтому применение метода выделения на олиго(дТ)-магнитных частицах, хотя и устраняет возможное загрязнение препарата другими видами нуклеиновых кислот, заметно занижает уровни определяемых мРНК. В то же время ОТ-ПЦР анализ на поли(А)РНК позволил увидеть эффективность действия препаратов ИФН и дсРНК на экспрессию клеточных генов.
Из представленных данных видно, что клетки DU145 характеризуются очень высокими конститутивными уровнями синтеза мРНК белка цитоскелета
- у-актина, процессинг которого однако нарушен: в составе ПЦР-продуктов (по данным электрофореза в агарозном геле, рис. Б) найдены более высокомолекулярные амплификаты.
В клетках DU145 достаточно высокие уровни экспрессии генов семейства а-ИФН, что согласуется с нашими данными о фибробластах и клетках крови человека [4; 5; 6].
БИОТЕРАПИЯ ЭКСПРЕССИЯ ИНТЕРФЕРОНЗАВИСИМЫХО 55
Таблица 1
Влияние препаратов ИФН и дсРНК на транскрипционную активность ИФН-зависимых и апоптозных генов в клетках БШ45
Виды мРНК Конститутивный уровень (разведения кДНК) Уровни после обработки препаратами ИФН и дсРНК (разведения кДНК)
Альфарона Ингарон Поли(И)-поли(Ц) Ридостин
аИФН 100 1Л 100 10Л 10 <1Л 100 10Л 100 1Л
РИФН 10 <1Л 1 <1Л 1 <1Л 100 10Л 10 <1Л
уИФН <1 <1 <1 <1 <1
ОАС 10 <1Л 10 1Л 50 5Л 50 5Л 50 5Л
РНК-аза Ь 10 1Л 10 10Л 50 5Л 10 5Л 10 5Л
ПК68 1 1 1 1 10
Ра8-Лй (СБ95) 10 10 100 100 100
Вс1-2 10 <1 <1 1 10
Г -актин 1000 1Л Нарушен процессинг мРНК 1000 10Л Индукция Восстановлен процессинг мРНК 1000 10Л Индукция 1000 10Л Индукция 1000 10Л Индукция Восстановлен процессинг мРНК
А - результат получен с поли(А)РНК
Таблица 2
Продукция цитокинов клетками РЦ145 под действием ИФН и дсРНК___________________________________
Виды цитокинов Продукция цитокинов пг/мл (контроль без препаратов) Продукция цитокинов в пг/мл (после воздействия препаратов ИФН и дсРНК)
Альфарона Ингарон Поли(И)-поли(Ц) Ридостин
ИЛ6 250 250 670 860 680
ИЛ10 <30 250 500 600 500
ФНО-а <10 550 810 700 410
а-2 ИФН <50 <50 <50 <50 100
ИЛ - интерлейкины. Определение методом иммуноферментного анализа с наборами ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург)
Рис. Уровни мРНК ИФН и ИФН-зависимых ферментов (А) и факторов апоптоза и у-актина (Б) в клетках Би 145: Электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле с бромистым этидием.
Дорожки: 1 - клетки без обработки препаратами; 2 - альфарона 500 МЕ/ мл; 3 - ингарон 1000 МЕ/мл; 4 - поли(И)-поли(Ц) 100 мкг/мл; 5 - ридостин 1000 мкг/мл. Справа приведены размеры специфических ПЦР продуктов в нуклеотидных парах.
А - ОТ-ПЦР-продукты полученные на поли(А)РНК.
Б - ОТ-ПЦР-продукты получены на суммарной РНК, разведения кДНК 1/10. мРНК у-актина* - ОТ-ПЦР на поли(А)РНК. ОАС* - оТ-пЦр на суммарной РНК, разведение кДНК 1/10.
56 БИОТЕРАПИЯ ЭКСПРЕССИЯ ИНТЕРФЕРОНЗАВИСИМЫХО
Вместе с тем, в клетках DU145 повышенная активность генов бета-ИФН, ИФН-зависимых ферментов олигоаденилатсинтетазы (ОАС1), рибонуклеазы (РНК-азы) L, дсРНК-зависимой протеинкиназы (ПК68) и протоонкогена Bcl-2. Перечисленные повышенные показатели системы ИФН объясняют присущую клеткам резистентность к воздействию внешних стрессовых факторов, характерную для трансформированных линий клеток. Показано, что все исследованные препараты повышают синтез мРНК гамма-актина и нормализует процессинг ее транскриптов с образованием зрелой формы, стимулируют транскрипцию мРНК ОАС1 и РНК-азы L. Воздействие на клетки DU145 препарата альфарона (рекомбинантного а-2 ИФН) вызывает стимуляцию транскрипцию поли(А)РНК аИФН, ОАС, РНК-азы L, ПК68 и FasAg (CD95; см. табл. 1, рис. А-Б). Поли(И)-поли(Ц заметно индуцирует синтез поли(А)РНК Р-ИФН, повышает уровни мРНК а-ИФН и мРНК ПК68. Препараты ингарон (рекомбинантный у-ИФН) и дсРНК оказывают определённый позитивный эффект на экспрессию апоптозно-го гена Fas. Все препараты, кроме ридостина, подавляет экспрессию протоонкогена Bcl-2, что является существенным для ограничения роста опухолевых клеток и активации в них процессов апоптоза [1; 11].
Индукция цитокинов
в клетках DU145 препаратами ИФН и дсРНК
Процесс воспаления - один из ключевых медиаторов развития РПЖ. ИЛ6 участвует в позитивной регуляции P13K/AKT пути и андрогенрецепторной индукции [11]. Необходимо охарактеризовать способность раковых клеток секретировать в культуральную жидкость воспалительный цитокин ИЛ6, иммунорегу-ляторный ИЛ10 и апоптозный индуктор ФНО-а;
а также - синтезировать а-2 ИФН и ответить на вопрос, будет ли увеличиваться в раковых клетках продукция этих факторов после воздействия препаратов ИФН и дсРНК, которые, как известно, участвуют в воспалительном ответе. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 2. По сравнению с контролем (культуральная жидкость клеток БИ145 без добавления препаратов) использованные препараты (ингарон, поли(И)-поли(Ц) и ридостин) увеличивали в клетках Би 145 синтез ИЛ6. В ответ на ИФН и дсРНК клетки БИ145 синтезировали ИЛ 10, который обладает противоспалительной активностью и ФНО
- активатор апоптоза. Поскольку повышенные уровни ИЛ6 являются плохим прогностическим признаком прогрессии рака простаты [9], а ИЛ 10 может как усиливать, так и подавлять клеточные реакции иммунитета, эффект препаратов ИФН и дсРНК на клетки БИ145 является благоприятным в основном в отношении индукции ФНО, вызывающем гибель раковых клеток. Такой препарат как ДсРНК-ридостин индуцировал в клетках БИ145 синтез определяемых количеств альфа2-ИФН. В целом клетки БИ145 можно отнести к чувствительным к действию ИФН и дсРНК в отношении индукции антивирусного состояния и клеточного апоптоза. Однако надо учитывать, что ИФН относятся к воспалительным цитокинам и индуцируют синтез других факторов воспаления. Преимуществом препаратов ИФН является более низкая токсичность по сравнению с химиопрепаратами и цитостатиками. Полученные данные представляют особую важность не только для обнаружения изменений в уровнях экспрессии генов клеточного иммунитета в клетках рака простаты, но и для поиска новых дополнительных лекарственных средств коррекции систем клеточной защиты у больных РПЖ.
Выводы
1. Получены количественные конститутивные характеристики транскрипции конститутивных генов ИФН (а-, P-и у-) и ИФН-зависимых ферментов (ОАС, РНК-азы L, дсПК), регуляторов апоптоза - Fas-гена и про-тонкогена Bcl-2 и белка цитоскелета - у-актина на клетках DU145, выведенных в клеточную линию из метастазов мозга мужчины с РПЖ [12].
2. При воздействии на клетки DU145 отечественных препаратов а2-ИФН (альфарона), у-ИФН (ингарон) и препаратов дсРНК (ридостин и синтетического комплекса поли(И)-поли(Ц)) происходит активация транскрипции генов системы ИФН и апоптозного Fas-гена в сочетании с подавлением транскрипции гена Bcl-2. Обнаружена также индукция процессинга транскриптов мРНК у-актина.
3. Препараты ИФН и дсРНК вызывают в клетках DU145 РПЖ повышенную продукцию цитокинов: возрастает секреция воспалительного ИЛ-6, ФНО-а иммунорегуляторного ИЛ-10, а также синтезируется а2-ИФН при воздействии дсРНК -ридостин.
Литература
1. БарышниковА.Ю., ШишкинЮ.В. Иммунологические проблемы апоптоза - М.: Едиториал УРСС, 2002. - 320 с.
2. Ершов Ф.И., Киселёв О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств) - М.: Гэотар Медицина, 2005. - 368 с.
3. Соколова Т.М., Урываев Л.В. Способ определения цитокинового статуса человека на генетическом уровне. Патент на изобретение №2181773, 27 апреля 2002 г.
4. Соколова Т.М., Бибикова О.В., Быстров Н.С., Урываев Л.В. Экспрессия генов системы интерферона и клеточного апоптоза в пробах крови человека // Вопросы вирусологии. - 2005. - № 1. - С. 19-23.
5. Соколова Т.М., Урываев Л.В., Тазулахова Э.Б и др. Индивидуальные изменения экспрессии генов системы интерферона в клетках крови человека под влиянием амиксина и циклоферона // Вопросы вирусологии. - 2005. - № 2. - С. 32-6.
6. Соколова Т.М., Федорова Н.Е., Меджидова М.Г. и др. Механизмы клеточной резистентности к цитомегаловирусу связаны с транскрипционной активностью генов лейкоцитарного и иммунного интерферонов // Медицинская иммунология. - 2007. - № 4-5. - С. 457-66.
7. Creighton C.J. A gene transcription signature associated with hormone independence in a subset of both breast and prostate cancers // BMC Genomics. - 2007. - Vol. 8. - P. 199-210.
8. Dong B., Kim S., Hong S. et al. An infectious retrovirus susceptible to an IFN antiviral pathway from human prostate tumors // PNAS. - 2007. - Vol. 105(5). - P. 1655-60.
9. George DJ., Halabi S., Shepard T.F. et al. The prognostic significance of plasma interleukin-6 levels in patients with metastatic hormon-erefractory prostate cancer: Results from cancer and leukemia group B 9480 // Clin Cancer Res. - 2005. - Vol. 11. - P. 1815-20.
10. McCartyM.F. Targeting multiple signaling pathways as a strategy for managing prostate cancer: Multifocal signal l modulation therapy // Integr. Cancer Ther. - 2004. - Vol. 3(4). - P. 349-80.
11. McKenzie S., Kyprianou N. Apoptosis evasion: the role of survival pathways in prostate cancer progression and therapeutic resistance // J Cell Biochem. - 2006. - Vol. 97(1). - P. 18-32.
12. Stone K.R., Mickey D.D., Wunderli H. et al. Isolation of a human prostate carcinoma cell line (DU145) // Int. J. Cancer. - 1978.
- Vol. 21(3). - P. 274-81.
