CC BY
29
УДК 544.032.2
ВЛИЯНИЕ МЕХАНОАКТИВАЦИИ В ШАРОВОЙ ПЛАНЕТАРНОЙ МЕЛЬНИЦЕ НА СОСТАВ, СТРУКТУРУ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАКТАТА КАЛЬЦИЯ
1КАНУННИКОВА О.М., 1КАРБАНЬ О.В., 1 АКСЕНОВА ВВ., 1ГИЛЬМУТДИНОВ Ф.З., 2соловьев А. А., 3ПЕРЕВОЩИКОВА Н.Б., 1ЛАДЬЯНОВ В.И.
1 Физико-технический институт Уральского отделения РАН, 426000, г. Ижевск, ул. Кирова, 132
2
Ижевская государственная медицинская академия, 426034, г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281 Удмуртский государственный университет, 426034, г. Ижевск, ул. Университетская, 1
АННОТАЦИЯ. Исследовано влияние механоактивации в шаровой планетарной мельнице на состав и структуру аморфного лактата кальция. Выявлена взаимосвязь изомерной структуры лактат-аниона и биологических свойств лактата кальция.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: лактат кальция, карбонат кальция, АСМ, РФА, ИК-спектроскопия, РФЭС, поляриметрия, микроэлектрофорез.
ВВЕДЕНИЕ
Механоактивация является перспективным методом повышения эффективности действия лекарственных препаратов благодаря формированию метастабильной структуры, обладающей повышенной биологической активностью [1]. Представляет интерес улучшения свойств давно используемых препаратов, с известными воздействием на организм человека и побочными эффектами. К таким препаратам относятся простые соли органических кислот. В [2] показано многократное повышение эффективности глюконата кальция в результате механоактивации в шаровой планетарной мельнице. Механоактивация приводит к диспергированию порошка и его аморфизации, что приводит к увеличению растворимости и скорости растворения, повышающие биологическую доступность препарата [3]. Комплексные исследования показали, что при механоактивации происходит изменение пространственной структуры глюконат-аниона: формируется незамкнутый цикл. Причем измененная структура аниона сохраняется в водных растворах глюконата кальция [4, 5].
Целью данной работы являлось исследование структурно-химических превращений лактата кальция, происходящих при механоактивации в шаровой планетарной мельнице и сопоставление их с изменениями биологических свойств.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования являлся лактат кальция. Механоактивация проводилась в шаровой планетарной мельнице АГО-2. Согласно данным анализа методом эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной (аргоновой) плазмой (спектрометр Spectшflame) в составе механоактивированных порошков отсутствуют какие-либо неорганические примеси, источником которых могут быть шары и стенки сосудов для измельчения.
Исследование морфологии порошка лактата кальция после механоактивации проводилось методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) на сканирующей зондовой лаборатории Интегра Прима (NT-MDT) в прерывисто-контактном режиме на воздухе. Порошок предварительно крепился на пленку полистирола, полученную испарением этилацетата из раствора полистирола в этилацетате. Пленка наносилась на ситалл, с последующим закреплением порошка под ультрафиолетовым излучением.
Структурно-фазовый (РФА) анализ порошков проводился на дифрактометре Дрон-6 с использованием СиКа-излучения (36 кВ, 30 мА).
ИК-спектры порошков и их водных растворов были получены на ИК-Фурье спектрометре ФСМ 1202 (ООО «Мониторинг»). Исследуемые порошки запрессовывались в таблетки с КВг.
Рентгеновские фотоэлектронные спектры возбуждались М§Ка-излучением на спектрометре ЭС-2401. Математическая обработка спектров проводилась по методике, основанной на преобразовании Фурье в улучшенной процедурой сходимости.
Анализировалась растворимость порошков лактата кальция.
Поляриметрические исследования водных растворов (0,02 моль/л) исходного и механоактивированного лактата кальция проведены с излучением длиной волны 589 нм при температуре 20 °С.
Концентрация лактата кальция в образцах определялась титрованием ЭДТА.
Сравнительные исследования биологической активности исходного и механоактивированного лактата кальция проводились методом микроэлектрофореза на буккальных клетках и эритроцитах. Сущность метода микроэлектрофореза заключается в измерении амплитуды колебания клеток в поле зрения микроскопа. В электрофоретической камере клетки совершают вынужденные возвратно-поступательные движения при смене знака напряжения на электродах (10 В, с частотой 0,1 Гц). Частота колебаний клеток равна частоте смены знаков на электродах, но амплитуда колебаний может быть различной в зависимости от заряда клеточной поверхности, который является показателем физиологического состояния клетки [6]. Исследование проводили с использованием комплекса «Цитоэксперт».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исходном порошке частицы микронных размеров - более 50 мкм. После 30 мин механоактивации порошок состоит из агрегатов слоистых частиц в форме трапецеидальной призмы (рис. 1). Размер частиц в агрегатах значителен: от 1,5 до 8 мкм. Толщина пластин в частице 150 - 200 нм. После 1 ч механоактивации форма частиц сохраняется, но размер частиц в агрегатах уменьшается и составляет от 300 до 2 мкм, а сами агрегаты не превышают 5 мкм. Средний размер частиц составляет 1,1 мкм при сохранении слоистой структуры. В порошке механоактивированном в течение 3 ч наблюдаются агрегаты из частиц 250 - 500 нм. Агрегаты слабо связаны и разрушаются под воздействием иглы кантилевера при сканировании. Средний размер частиц 330 нм. Толщина пластин также уменьшается до 25 нм. При увеличении времени механоактивации до 6 часов наряду с дальнейшим измельчением частиц (средний размер 140 нм) начинаются процессы агрегирования, приводящие к уплотнению агрегатов, при сохранении их размеров порядка 5 нм.
На рис. 2 представлены рентгеновские дифрактограммы исходного и механоактивированного лактата кальция. В отличие от образцов, исследованных в [7] исходный лактат кальция имел аморфную структуру. На рентгеновских дифрактограммах всех механоактивированных образцов на фоне гало от аморфной фазы лактата кальция видны интенсивные рефлексы от карбоната кальция. С увеличением времени механоактивации происходит слабое снижение интенсивности (в основном это проявляется на самой сильной линии), связанное с уменьшением размера зерна и ростом уровня микронапряжений. В ходе механоактивации происходит частичное разложение лактата кальция с образованием карбоната кальция - малорастворимого соединения (0,0015 мг/100 г Н2О).
г\|
Т-I
о
Е ^
ь
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 X, ит
С ^
1.0 2.0 3,0 А. О 5.0 Хг игг
Рис. 1. АСМ-изображения порошка лактата кальция после механоактивации в течение: а) 30 мин, б) 1 ч, в) 3 ч, г) 6 ч
2©
15 25 35 45 55 65 75 85 95 2©
Рис. 2. Рентгеновские дифрактограммы исходного (а) и механоактивированного лактата кальция: б) 30 мин механоактивации, в) 1 ч механоактивации, г) 3 ч механоактивации, д) 6 ч механоактивации
Исследование растворимости механической смеси исходного лактата кальция и карбоната кальция показало, что растворимости компонентов практически не изменяются. В то время как механоактивированная смесь лактата кальция и карбоната кальция имеет более высокую растворимость, чем лактат (табл. 1). Причем содержание карбоната кальция, образовавшегося в результате механоактивации при деструкции лактата кальция, с увеличением времени механоактивации увеличивается.
Таблица 1
Состав и физико-химические свойства водных растворов лактата кальция
Время механоактивации, ч Содержание лактата кальция, вес.% Растворимость, г/100г Н2О рН водного раствора 0,02 моль/л Термический коэффициент объемного расширения (р-10-4) водного раствора 0,02 моль/л
0 98 8,36 6,47 2,2
0,5 89 8,36 6,62 2,4
1,0 87 8,80 6,38 2,4
3,0 84 9,05 6,30 2,4
6,0 84 9,03 6,26 2,2
Повышение растворимости веществ в результате механоактивации может быть обусловлено несколькими причинами: изменение кристаллической или молекулярной (изомерной) структуры; уменьшение размеров частиц порошков; образование композитов и межмолекулярных комплексов.
Растворимость зависит от размеров частиц согласно уравнению Оствальда-Фрейндлиха [8]. Хотя данное уравнение подвергалось в литературе критике, экспериментальные результаты показывают, что растворимость действительно увеличивается для достаточно мелких кристаллитов - не более 20 нм. Например, растворимость гризеофульвина в воде увеличивается от 11,9 мкг/100 г Н2О (микрокристалл) до 60,2 мкг/100 г Н2О (нанокристалл) [9], ацетата метилгидроксипрогестерона - от 1,2 мг/100 г Н2О до 3,5 мг/100 г Н2О [10], нимесульфида от 11 мг/100 г Н2О до 25 мг/100 г Н2О [11]. Таким образом, хотя проверить выполнение уравнения в количественном аспекте затруднительно, на качественном уровне оно выполняется.
Размеры частиц механоактивированных порошков лактата кальция не менее 180 нм, что не может приводить к уменьшению растворимости лактата кальция.
В исходном состоянии лактат кальция имеет аморфную структуру, которая сохраняется после механоактивации. Появление примеси кристаллического малорастворимого карбоната кальция не может привести к повышению растворимости.
Образование карбоната кальция уже после 30 мин механоактивации подтверждает
появление в ИК-спектре пропускания механоактивированных образцов полосы поглощения 1 2 при ~ 875 см- , соответствующей деформационным колебаниям СО3 -, и увеличение
интенсивности полосы валентных колебаний СО32- при 1430 см-1, где, помимо СаСО3, дает
вклад полоса деформационных колебаний -ОН адсорбированной (в таблетку КВг) воды
(рис. 3).
Величина рН водных растворов незначительно уменьшается с увеличением времени механоактивации лактата кальция. При исследовании лактата кальция, механоактивированного в вихревой мельнице, наблюдалось незначительное повышение величины рН, что объяснялось гидролизом карбоната кальция, образовавшегося при деструкции лактата кальция. Понижение величины рН можно объяснить тем, что карбонат-анион не участвует во взаимодействии с водой. Можно предположить формирование
межмолекулярных комплексов лактата кальция и карбоната кальция: карбонат-анион связывается с лактат-анионом и в связанном состоянии переходит в водный раствор. Понижение рН связано с формированием гидроксида кальция. Возможно, что этот эффект является также причиной незначительного повышения растворимости механоактивированного лактата кальция с примесью карбоната кальция по сравнению в исходным лактатом кальция без примесей.
В спектрах водных растворов лактата Са полоса карбонила в спектре исчезает, и появляются две новые полосы, отвечающих асимметричному па8(СОО-) при 1585 см-1 и симметричному "У^СОО-) при 1430 см-1 колебаниям карбоксилат-аниона. В спектре растворов как исходного лактата Са, так механоактивированного наблюдается плечо у полосы уа8(СОО-) (1735 см-1), соответствующее колебаниям карбонила. Появление плеча можно объяснить присутствием в лактате кальция примеси молочной кислоты или стереоизомера. Соотношение интенсивности основной полосы и плеча сохраняется примерно постоянным при механоактивации.
800 820
п-1-г
840 860
V, от"
880 900
1350
1400
1450
6ч 3ч
1ч
30мин
исх
1500
V, от
Рис. 3. ИК-спектры исходного и механоактивированного лактата кальция
РФЭС спектры представлены на рис. 4. Наиболее интенсивная линия (285,0 эВ) относится к связям С-Н от концевых групп СН3- лактат-аниона и от углерода адсорбированного слоя углеводородов. Составляющие с энергиями связи 286,2 (пик I) и 287,4 эВ (пик II) в С1Б-спектре исходного образца, по-видимому, относятся к атомам углерода, связанных с гидроксильными группами в молекулах примеси молочной кислоты (присутствующей в исходном лактате кальция, согласно результатам ИК-спектроскопии) или лактата кальция разных оптических изомеров (энантиомеров). Высокоэнергетичный пик с Есв = 289,0 эВ относится к атомам углерода в составе карбоксильной группы лактат-аниона и карбонат-аниона. Без учета составляющей от углерода в составе адсорбированного слоя (285 эВ) в исходном порошке и после 30 мин. механоактивации соотношение пиков I и II равно ~ 2:1. После 1 - 6 ч механоактивации это соотношение изменяется и становится равным ~ 1,0:1,5.
282 284 286 288 290 292
Рис. 4. С1« рентгеноэлектронные спектры лактата кальция после различного времени механоактивации
Повышение растворимости веществ в результате механоактивации может быть обусловлено несколькими причинами: изменение кристаллической или молекулярной структуры; уменьшение размеров частиц порошков; образование композитов и межмолекулярных комплексов. Размеры частиц механоактивированных порошков лактата кальция не менее 180 - 200 нм, что не может приводить к уменьшению растворимости лактата кальция.
В исходном состоянии лактат кальция имеет аморфную структуру, которая сохраняется после механоактивации. Появление примеси кристаллического малорастворимого карбоната кальция также не может привести к повышению растворимости механоактивированного лактата кальция с примесью карбоната кальция.
Как правило, энантиомеры имеют одинаковую или слабо различающуюся растворимость. При этом растворимость рацемической смеси существенно отличается от растворимости чистых энантиомеров (может быть как больше, так и меньше). Поэтому можно предположить, что возможной причиной повышения растворимости является изменение изомерной структуры лактата кальция. Сравнивая величины растворимости с соотношением интенсивности компонент РФЭС С1б - спектра, которые предположительно относились к атомам углерода в составе разных энантиомеров, видно, что повышение растворимости наблюдается при соотношении интенсивностей пиков от разных энантиомеров ~ 1,0:1,5.
В табл. 2 приведены результаты анализа оптической активности водных растворов лактата кальция. Все растворы относятся к растворам левовращающих энантиомеров лактата кальция. Повышение оптической активности наблюдается для водных растворов лактата, механоактивированного в течение 1 - 6 ч и коррелирует с повышением относительной интенсивности пика I С1Б-спектра, приписываемой одному из энантиомеров или молочной кислоте.
Можно предположить, что:
- исходный лактат кальция представляет собой смесь энантиомеров, причем, доминирует Ь-изомер;
- в составе исходного лактата кальция присутствует примесь Ь-молочной кислоты, которая вносит свой вклад в поляризацию;
- механоактивация лактата кальция приводит к его деструкции с образованием карбоната кальция, который взаимодействует с примесью молочной кислоты с образованием Ь-изомера, что приводит к увеличению угла вращения плоскости поляризации водного раствора; возможно также, что часть существующего Б-изомера также переходит в Ь- изомер;
- повышение растворимости механоактивированного лактата кальция с примесью карбоната кальция может быть связано с уменьшением доли рацемической смеси или с формированием межмолекулярных комплексов лактата и карбоната кальция.
Таблица 2
Угол вращения плоскости поляризации водных растворов лактата кальция (0,02 моль/л)
Время механоактивации, ч Угол вращения, °
0 1,6
0,5 1,6
1,0 2,7
3,0 2,7
6,0 2,2
Физиологическое и биохимическое действие оптических изомеров часто совершенно различно [12]. Например, белки, синтезированные искусственным путём из Б-аминокислот, не усваиваются организмом; бактерии сбраживают лишь один из изомеров, не затрагивая другой; Ь-никотин в несколько раз ядовитее Б-никотина. Уже давно встала задача использовать, по возможности, наиболее действенную форму, что вызвало к жизни разработку способов стереоселективного синтеза (обычно с катализаторами), приемов разделения рацемических смесей и методов определения отдельных энантиомеров.
В табл. 3 приведены результаты исследования микроэлектрофоретической подвижности живых клеток крови и буккальных клеток в водных растворах исходного и механоактивированного лактата кальция. Видно, что механоактивированный лактат кальция обладает меньшей биологической активностью по отношению к клеткам крови, чем исходный. По-видимому, в данном случае Ь-изомер имеет меньшую биологическую активность по сравнению с Б-изомером. По отношению к буккальным клеткам зависимость обратная - более активным оказывается Ь-изомер.
Таблица 3
Микроэлектрофоретическая подвижность живых клеток крови (эритроцитов) и буккальных клеток в водных растворах (0.02 моль/л) исходного и механоактивированного лактата кальция
Время механоактивации лактата кальция, ч Буккальные клетки Клеть (эрит] :и крови юциты)
Доля(%) активных клеток Амплитуда колебаний, мкм Доля (%) активных клеток Амплитуда колебаний клеток, мкм
клетки ядра плазмолемма
0 34 0 0 1,2 100 14,0
0,5 40 0 0 0 84 9,0
1,0 73 0 2,1 2,8 92 7,5
3,0 70 0 0,5 1,1 96 7,5
6,0 66 26 0 1,7 94 5,5
ВЫВОДЫ
При механоактивации аморфного лактата кальция в шаровой планетарной мельнице наблюдается:
- незначительное изменение размеров и формы частиц порошка;
- сохранение аморфной фазы лактата кальция;
- деструкция лактата кальция с образованием карбоната кальция, количество которого незначительно растет с увеличением времени механоактивации.
Растворимость механоактивированного лактата кальция незначительно увеличивается, несмотря на образование карбоната кальция. Возможной причиной является сокристаллизация лактата и карбоната кальция.
Растворы исходного и механоактивированного лактата являются оптически активными (левовращающими). Угол вращения плоскости поляризации растворов механоактивированного лактата кальция выше, чем растворов исходного лактата кальция.
Биологическая активность Ь- изомера и Б- изомера различается по отношению к буккальным клеткам и клеткам крови.
Авторы выражают благодарность Терешкиной С.А. и Мокрушиной М.И. за проведение РФА анализа, Собенниковой М.В. за проведение элементного анализа, Колотовой А. за измерение углов вращения плоскости поляризации водных растворов исходного и механоактивированного лактата кальция.
Работа выполнена в рамках Программы Президиума РАН, грант 12-П-2-1065.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ломовский О.И. Прикладная механохимия: фармацевтика и медицинская промышленность // Обработка дисперсных материалов и сред. 2001. Вып. 11. С. 81-100.
2. Коныгин Г.Н., Стрелков Н.С. и др. Способ лечения гипокальциемий, остеопорозов, переломов // Патент РФ № 2268053, 2006.
3. Коныгин Г.Н., Гильмутдинов Ф.З., Быстров С.Г., Карбань О.В., Дорофеев Г.А., Елсуков Е.П., Шаков
A.А., Стрелков Н.С., Тюлькин Е.П., Поздеев В.В., Шишкин С.Б., Максимов П.Н., Филиппов А.Н., Корепанова
B.В. Механоактивированный лекарственный препарат кальция глюконат: рентгеноструктурные, микроскопические и рентгеноэлектронные исследования // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. № 2, Т. 13. С. 249-252.
4. Рыжков Д.Ф., Канунникова О.М., Шаков А.А. Исследование структурно-чувствительные свойства водных растворов глюконатов кальция и натрия // Химическая физика и мезоскопия. 2011. Т. 13, № 4. С. 569576.
5. Канунникова О.М., Шаков А.А., Рыжков Д.Ф. Исследование структурно-чувствительных свойств водных растворов механоактивированного глюконата кальция // Материаловедение. 2011. № 12. С. 15-21.
6. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. Электрофорез клеток крови в норме и патологии. Минск : Беларусь, 1974. 143 с.
7. Канунникова О.М., Михайлова С.С., Мухгалин В.В., Аксенова В.В., Гильмутдинов Ф.З., Ладьянов В.И. Структурно-химические превращения лактата кальция при механоактивации в вихревой мельнице // Химическая физика и мезоскопия. 2013. Т. 15, № 3. С. 408-414.
8. Adamson A.W., Gast A.P. Physical Chemistry of Surfaces. New York : Wiley-Interscience Publications, 1997. 804 p.
9. Grassi M., Grassi G., Lapasin R., Colombo I. Understanding drug release and absorption mechanisms: A physical and mathematical approach. Boca Raton : CRC Press, 2007. 647 р.
URL: http://bookre.org/reader?file=577158 (дата обращения 7.01.2015).
10. Grassi M., Colombo I., Lapasin R. Drug release from an ensemble of swellable crosslinked polymer particles // J. Control. Rel. 2000. V. 68. P. 97-113.
11. Grassi M., Coceani N., Magarotto L., Ceschia D. Effect of milling time on release kinetics from co-ground drug polymer systems // AAPS Annual Meeting and Exposition : Proc. Salt lake City, 2003. M1201.
12. Алексеев В. В. Оптическая изомерия и фармакологическая активность лекарственных препаратов // Соровский образовательный журнал. 1998. № 1. С. 49-55.
EFFECT OF BALL-MILLING ON COMPOSITION, STRUCTURE AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF CALCIUM LACTATE
:Kanunnikova O.M., :Karban O.V., :Acsenova V.V., 1Gilmutdinov F.Z., 2Solovyev A.A., 3Perevoschikova H.B., :Ladyanov V.I.
Physical-Technical Institute, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Izhevsk, Russia 2Izhevsk State Medical Academy, Izhevsk, Russia 3Udmurt State University, Izhevsk, Russia
SUMMARY. The influence of ball milling on the composition and structure of amorphous calcium lactate was investigated. The interrelation of the isomeric structure of the lactate anion and biological properties of calcium lactate.
KEYWORDS: calcium lactate, calcium carbonate, AFM, XRD, IR spectroscopy, XPS, polarimetry, microelectrofores.
Канунникова Ольга Михайловна, доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник ФТИ УрО РАН, e-mail: olam@nm. ru
Карбань Оксана Владиславовна, доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник, ФТИ УрО РАН
Аксенова Валерия Викторовна, кандидат физико-математических наук, научный сотрудник ФТИ УрО РАН
Гильмутдинов Фаат Залалутдинович, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, заведующий отделом ФТИ УрО РАН
Соловьев Александр Александрович, кандидат медицинских наук, доцент ИГМА Перевощикова Наталья Борисовна, доцент УдГУ
Ладьянов Владимир Иванович, доктор физико-математических наук, директор ФТИ УрО РАН
