CC BY
47
УДК 547.821.2
ВЛИЯНИЕ МЕХАНОАКТИВАЦИИ НА СТРУКТУРУ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАНОРАЗМЕРНОГО ПРЕПАРАТА «МАГНЕРОТ»
1КАРБАНЬ О.В., 2КАНУННИКОВ М.М., 2ЧУЧКОВА Н.Н., 2САВИНОВА Н.В., 1МУХГАЛИН В В., 1ГИЛЬМУТДИНОВ Ф.З., ^КОМИССАРОВ В.Б., 2БУТОЛИН Е.Г.
1 Физико-технический институт Уральского отделения РАН, 426000, г. Ижевск, ул. Кирова, 132
2
Ижевская государственная медицинская академия, 426034, г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281
АННОТАЦИЯ. В состав лекарственного препарата «магнерот» оротат магния входит в двух изомерных формах - оксо- и дигидрокси-. Механоактивация препарата приводит к изменению структурного состояния и таутомерным превращениям оротата магния. Определены: растворимость исходного и механоактивированных препаратов в зависимости от рН водного раствора; температурная зависимость плотности и кинематической вязкости водных растворов; растворимость в октаноле. Показано, что препарат, содержащий гидрокси-форму оротат-аниона обладает повышенной биологической активностью по сравнению с препаратом, содержащим оксо- и дигидроксо-формы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: оротат магния, механоактивация, электронная структура, физико-химические свойства.
ВВЕДЕНИЕ
Заболевания сердечно-сосудистой системы занимают первое место в структуре смертности среди населения большинства стран мира, причем в странах СНГ этот уровень почти в 2 раза превышает уровень смертности в Европе. Это говорит о том, что препараты, предназначенные для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний не достаточно эффективны или слишком дороги для большинства пациентов. Наиболее распространенный подход поиска эффективных препаратов основан на разработке новых химических соединений с улучшенными свойствами. Весь цикл, включающий синтез препарата, исследования физико-химических свойств, проверку биологической активности на животных, клинические испытания занимает более 10 лет и оценивается порядка 1 млрд. долларов США. Этот подход является длительным и чрезвычайно дорогостоящим.
В настоящее время развивается еще один путь: повышение эффективности уже известных препаратов, путем выявления наиболее биологически-активной пространственной структуры. Связь между пространственной структурой и активностью является фундаментальной характеристикой действия лекарственных препаратов в связи с тем, что от их молекулярной структуры зависит способность вещества проникать в организм (или клетку), его транспорт к месту воздействия, взаимодействие с определенными рецепторами, что определяет степень и направленность биологического действия [1]. Поэтому выявление взаимосвязи «структура-свойство» для выбора наиболее биологически активной структуры препарата является актуальным.
Оротат магния известный препарат. Его преимущество по сравнению с другими лекарственными препаратами на основе простых солей магния заключается в том, что фармакологическое действие препарата определяется не только катионом магния, но и оротат-анионом. Существует три изомера (таутомера) --аниона: оксо-форма с двумя карбоксильными группами и одной двойной связью в гетероцикле; гидрокси-форма с одной карбоксильной группой и двумя двойными связями в гетероцикле; дигидрокси-форма с двумя гидроксильными группами и ароматическим гетероциклом [2]. В твердом состоянии оротаты существуют в виде оксо-формы, все таутомерные превращения до сих пор наблюдались только в растворах при варьировании величины рН. Распространенный препарат «магнерот» в качестве действующего вещества содержит оротат магния
преимущественно в оксо-форме, однако не известно, является ли эта форма предпочтительной по сравнению с гидрокси- и дигидрокси-формами.
Целью данной работы является выяснение возможности получения разных таутомерных форм оротата магния в твердом виде методом механоактивации и сравнительное исследование физико-химических и биологических свойств полученных таутомеров.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТА
Объектом исследования являлся препарат «магнерот» (производитель Мауэрманн-Арцнаймиттель КГ, Германия). Кроме оротата магния в состав таблетки входят вспомогательные вещества: крахмал, целлюлоза микрокристаллическая, лактоза, кармеллоза, тальк. Содержание вспомогательных веществ составляет порядка 30 % в составе таблетки «магнерота». Для сравнения была исследована электронная структура реактива «оротат магния» марки «хч».
Механоактивация препарата «магнерот» проводилась в шаровой планетарной мельнице АГО-2 в течение 1, 3 и 6 ч. Согласно данным анализа методом эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной (аргоновой) плазмой (спектрометр Spectroflame) в составе механоактивированных порошков отсутствуют какие-либо неорганические примеси, источником которых могут быть шары и стенки сосудов для измельчения.
Исследование морфологии порошка оратата магния после механоактивации проводились методом атомно-силовой микроскопии на сканирующей зондовой лаборатории Интегра Прима (NT-MDT) в прерывисто-контактной методике на воздухе. Порошок предварительно крепился на пленку полистирола, полученную испарением этилацетата из раствора полистирола в этилацетате. Пленка наносилась на ситал, с последующим закреплением порошка под ультрафиолетовым излучением.
Рентгеноструктурный анализ порошков проводился на дифрактометре Bruker D8 dvance с использованием CuKa-излучения. В качестве детектора был использован твердотельный Si(Li) спектрометр Sol-XE (Bruker).
Истинную плотность порошков определяли пикнометрическим методом (пикнометр объемом 5 см3).
Исследования рентгеновских абсорбционных спектров (NEXAFS) выполнены с использованием оборудования Российско-Германского канала электронного накопителя BESSY II.
Рентгеновские фотоэлектронные спектры возбуждались MgKa-излучением на модифицированном спектрометре ЭС-2401 [3]. Математическая обработка спектров проводилась по методике, основанной на преобразовании Фурье с улучшенной процедурой сходимости.
Биологические свойства оротата магния исследованы методом микроэлектрофореза на буккальных клетках и эритроцитах, а также на белых беспородных лабораторных крысах на модели гипомагниемии и стероидного остеопорза.
Сущность метода микроэлектрофореза заключается в измерении амплитуды колебания клеток в поле зрения микроскопа. В электрофоретической камере клетки совершают вынужденные возвратно-поступательные движения при смене знака напряжения на электродах (10 В, с частотой 0,1 Гц). Частота колебаний клеток равна частоте смены знаков на электродах, но амплитуда колебаний может быть различной в зависимости от заряда клеточной поверхности, который является показателем физиологического состояния клетки [4, с. 33-35].
На модели гипомагниемии было исследовано влияние оротата магния на восстановление уровня магния в сыворотке крови, цитологические показатели красной и белой крови, биоэлектрическую активность популяции эритроцитов и лимфоцитов. Гипомагниемия достигалась введением крысам в течение 14 дней внутрибрюшинно диуретика фуросемида (Furosemidi 1%) в дозе 30 мг/кг.
Стероидный остеопороз моделировали путем подкожного введения преднизолона в дозе 50 мг/кг массы крысы в течение 14 дней [5]. Состояние обмена коллагена оценивали по содержанию в гомогенате тела 2 и 3 поясничных позвонков (губчатый тип костной ткани): суммарного коллагена по количеству гидроксипролина[6]; свободного гидроксипролина [6]; нейтральносолерастворимой фракции коллагена [7]. В эксперименте использовали 32 беспородные крысы массой 80 - 130 г., которые были разделены на группы: 1) животные, у которых моделировали стероидный остеопороз путем подкожного введения преднизолона; 2) животные со стероидным остеопорозом, которым вводили исходный препарат «магнерот»; 3) животные со стероидным остеопорозом, которым вводили препарат, механоактивированный в течение 1 ч.
При проведении опытов соблюдали положения Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Структура механоактивированного оротата магния. На рис. 1 представлено АСМ-изображение частицы порошков оротата магния после 1 ч механоактивации. Частицы порошка имеют форму эллипсоида вращения размером от 100 до 200 нм (рис. 1), также наблюдаются отдельные наночастицы размером 40 нм. Размер кристаллитов в частицах составляет 40 нм. Наночастицы объединяются в слабо связанные агрегаты размером до 5 мкм. Исследования структуры наноразмерных порошков на широком ряде материалов показали, что подобная иерархия характерна для органических и неорганических диэлектриков.
При увеличении времени механоактивации до трех часов размеры агрегатов практически не изменяются (рис. 2, а), однако меняют такие параметры как плотность и форма. Частицы в агрегатах связаны наряду со слабыми адгезионными силами прочными диффузионными. Агрегаты приобретают слоистую структуру, с толщиной слоев порядка 70 - 180 нм (рис. 2, Ь). Средний размер частиц 162 нм, при этом зеренная структура в частицах не наблюдается, что свидетельствует об аморфизации порошка.
Рис. 2. АСМ-изображения частиц оротата магния после 3 ч (а) и 6 ч (Ь) механоактивации
Дальнейшая механообработка (6 часов) приводит к превалированию процесса агрегатирования над измельчением. Частиц имеют размер от 300 до 1000 нм. При этом различить частицы и плотные мелкие агломераты размером порядка 1 мкм невозможно. Частицы с плотными плоскими контактами образуют слоистые агломераты с частицами размером порядка 50 нм. При сканировании на атомно-силовом микроскопе такой агломерат ведет себя как единое целое.
Рис. 1. АСМ-изображемия частиц оротата магния после 1 ч механоактивации
На рис. 3 приведены дифрактограммы образцов смесей исходных и механоактиви-рованных оротатов. Видно, что в исходном состоянии оротат магния имеет кристаллическую структуру. Крахмал в составе препарата демонстрирует рефлексы в области углов 2 Шйа 20° [8]. После 1 ч механоактивации структура становится аморфно-кристаллической: об этом свидетельствует размытие рефлексов
рентгеновской дифрактограммы, а через 6 ч 2 ШеПа
механоактивации оротат магния полностью Рис. 3. Рентгеновские дифрактограммы аморфизуется. °р°тата магния
Аморфизация приводит к уменьшению истинной плотности механоактивированного наноразмерного порошка «магнерота» и составляет: 1,802; 1,341; 1,338 г/см3 для исходного, механоактивированного 1 ч и механоактивированного 6 ч препарата.
Химическое состояние исходного и механоактивированного оротата магния. Спектры КБХАРБ на К-крае С пиримидиновых оснований обладают очень схожей тонкой структурой. В них наблюдается четыре хорошо разрешенных п*-резонанса, два о*-резонанса вблизи 296 и 304 эВ. Пики п*-резонансов относятся к электронным переходам с неэквивалентных остовных уровней с1б различных атомов углерода в молекулах на делокализованные п*-несвязывающие молекулярные орбитали. В спектрах урацила наблюдаются пики 284,6; 286,0; 288,0 и 289,5 эВ. В спектре тимина низкоэнергетичный пик смещается в сторону более высоких энергий на 0,4 эВ (285 эВ), что объясняется появлением метильного заместителя [9]. Однако следует отметить, что на рисунке, иллюстрирующем химическое строение урацила, приведены структуры соответствующие оксо-формам и не приведены какие-либо данные об изомерном состоянии урацила и тимина. Азотсодержащие гетероциклы имеют характер связи близкий ароматическим, однако, явно выраженный ароматический характер связей имеют только дигидрокси-формы соединений.
На рис. 4 представлены №ХАБ8 спектры С1Б-края поглощения чистого оротата магния и препарата «магнерот». Изомерное состояние оротата магния не исследовалось.
р
а)
Я(С=О
Я(С=О
р (С=С) аром
Р*(С=С) гетероцик
(С-ОН)
а (С-С), а (С-М
280
| I I I I | 'I I I I | I I I I | I I I I | I I I I |
295 300 305 310 315 320 280
а (С=М) 6ч
295 300 305 310 315 320
Рис. 4. МЕХЛР8 спектры С1«-края поглощения чистого оротата магния (а) и препарата «магнерот» (А)
В обоих спектрах наблюдается интенсивный пик при 285,0 эВ, соответствующий электронному переходу (С=С) и свидетельствующий о присутствии ароматического
цикла. Низкоэнергетичный пик с Есв = 284,2 эВ в спектре оротата магния существенно уменьшается по интенсивности в спектре «магнерота» и проявляется в виде плеча. Пик при 286,0 эВ в спектре оротата магния имеет большую интенсивность по сравнению с пиками
285,0 и 284,2 эВ, а в спектре «магнерота» его интенсивность заметно ниже. Пик 286,0 эВ может относиться к электронному переходу С=С=О в молекулах полисахаридов или
С=О в составе оротат-аниона. В пики 288,5 и 290,5 эВ дают вклад электронные переходы С=О и С=ОН. Соотношение интенсивности этих пиков практически одинаково в спектрах оротата магния и «магнерота». Можно предположить, что как в составе чистого реактива «оротат магния», так и препарата «магнерот» оротат магния находится в нескольких таутомерных формах. Введение в состав образца порядка 30 вес.% вспомогательных веществ не оказывают существенного влияния на №ХАБ8 спектры С1б-края поглощения. После 1 и 6 ч механоактивации видно, что воздействие практически не изменяет №ХАБ8 спектры С1Б-края поглощения «магнерота».
Рентгеноэлектронные С1б-, N18-, 018-спектры представлены на рис. 5. В спектрах С1б доминирует составляющая с Есв = (285,0±0,2) эВ от атомов углерода в составе адсорбированного слоя углеводородов на поверхности частиц порошков (СН2)П группы.
исходный
.4C-OH
адс. C=O C-OH
1 час
6 часов
-C-O-C
C-H C-OH
C-H C-OH
вода адс.
280 285 290 295 395 400 405 530
Энергия связи, эВ
Рис. 5. РФЭС спектры препарата «магнерот»
Эта составляющая использовалась для калибровки рентгеноэлектронных спектров. Составляющая с Есв = (286,2±0,2) эВ относится к атомам углерода в составе с гидроксильными группами (С-ОН). Гидроксильные группы присутствуют в гидрокси- и дигидрокси-формах «магнерота», а также в составе полисахаридов, которые входят в состав «магнерота» в виде вспомогательных веществ. Компонента (287,0±0,2) эВ относится к атомам углерода в связи (-С-О-С-) в молекулах полисахаридов. Компонента (289,0±0,2) эВ относится к атомам углерода связанного с кислородом и азотом (О=С-Ы) в оксо- и гидрокси-формах оротат-анионов. В области от (290,0±0,2) эВ до (292,0±0,2) эВ наблюдаются shake-up сателлиты, которые характерны для органических соединений с ароматическими связями [10].
В О^-спектрах выделяются компоненты от атомов кислорода в составе карбонильной (С=О, Есв = (531,8±0,2) эВ) и гидроксильной (С-ОН, Есв = (533,4±0,2) эВ) групп. Компонента с Есв = (534,2±0,2) эВ относится к атомам кислорода в молекулах адсорбированной воды, а низкоэнергетичная компонента с Есв = (531,2±0,2) эВ относится к атомам кислорода, связанным с металлической подложкой, на которую помещен образец.
В N1s-спектрах интенсивная составляющая (400,5±0,2) эВ может быть приписана азоту в связи NHC=O. Составляющие с Есв = (398,4±0,2) эВ и Есв = (399,6±0,2) эВ относятся к атомам азота в составе ароматического гетероцикла и неароматического гетероцикла, соответственно.
Наиболее информативными оказались ШБ-спектры, поскольку они отражают изменения, происходящие с оротат-анионом. В С1б- и 01Б-спектрах велики вклады от атомов углерода и кислорода в составе вспомогательных веществ. Сравнение ШБ-спектров «магнерота» в исходном состоянии и после механоактивации позволяет заключить, что в исходном препарате оротат магния находится в оксо-форме с небольшой примесью ароматической дигидрокси-формы. После 1 ч механоактивации появляется гидрокси-форма оротата магния, а после 6 ч механоактивации гидрокси-форма разрушается, при этом возрастает доля дигидрокси-формы.
Физико-химические свойства. Биологический ответ организма на лекарство, прежде всего, зависит от его растворимости, которая обусловливает распределение вещества в этом организме и во многом определяет фармакокинетические свойства лекарственного препарата. Растворимость оказывает существенное влияние на проникновение препарата из кишечника в кровь, то есть на такие процессы, как всасывание, фильтрация, диффузия и др.
В табл. 1 приведены растворимости исходных и механоактивированных оротатов в зависимости от кислотности (рН) среды. Кислотность выбрана в соответствие с кислотностью среды различных отделов желудка и кишечника. Растворимость механоактивированных наноразмерного порошка «магнерота» и оротата магния выше, чем исходных и при этом растворимость чистого оротата магния зависит от кислотности среды (рН). Скорость растворения механоактивированного «магнерота» в воде (рН 6,5) повышается в 1,5 раза по сравнению с исходным.
Таблица 1
Растворимость препаратов
Время механоактивации, ч Концентрация, г/100 г Н2О
рН 2 рН 4 рН 6,5 рН 8,6
Оротат магния 0 0,14 0,23 0,23 0,20
1 0,16 0,23 0,23 0,20
6 0,21 0,29 0,27 0,24
«магнерот» 0 0,060 - 0,075 0,072
1 0,060 - 0,078 0,075
6 0,63 - 0,078 0,075
Величины рН водных растворов (0,5 вес.%) «магнерота» близки: 5,76 и 5,80 для исходного и механоактивированного 1 час, соответственно. Плотность водных растворов исходного «магнерота» незначительно выше, чем механоактивированного. Термический коэффициент объемного расширения раствора исходного «магнерота» ниже, чем механоактивированного, что свидетельствует о большей гидрофобности механоактивированного препарата (табл. 2).
Таблица 2
Температурная зависимость плотности водных растворов исходного и механоактивированного 1 ч препарата «магнерот» (0,5 вес.%)
Время механоактивации,ч Плотность, г/см Термич. коэфф. объемного расширения, (10-50 °С)-10-4
10 °С 20 °С 30 °С 40 °С 50 °С
0 1,0013 0,9995 0,9980 0,9951 0,9899 2,4
1 1,0019 1,0005 0,9990 0,9960 0,9905 2,8
Повышение гидрофобности приводит также к понижению вязкости водных растворов механоактивированного «магнерота» (табл. 3). Повышение гидрофобности сопровождается повышением липофильности препарата, а, следовательно, повышением его биологической доступности. Анализ количества «магнерота» перешедшего из водного раствора (рН 7,4) в октанол (в системе «октанол-водный раствор», моделирующую мембрану желудочно-кишечного тракта) подтверждает более высокую липофильность механоактивированного препарата по сравнению с исходным: через 1,5 часа в октанол из водного раствора исходного препарата концентрации 0,5 вес.% переходит 11 %, а из водного раствора механоактивированного препарата 20 %.
Температурная зависимость вязкости водных растворов исходного и механоактивированного 1 ч препарата «магнерот» (0,5 вес.%)
Раствор, время механоактивации, ч Вязкость
10 °С 20 °С 30 °С 40 °С 50 °С
0 1,3308 1,0384 0,8339 0,6800 0,5661
1 1,3262 1,0184 0,8154 0,6677 0,5600
Таким образом, обобщая вышеизложенные результаты исследований, можно заключить следующее:
— в исходном состоянии оротат магния в препарате «магнерот» находится в двух изомерных состояниях - оксо- и дигидрокси; механоактивация в течение 1 ч приводит к формированию гидрокси-формы оротата магния, через 6 ч механоактивации гидрокси-форма разрушается, при этом повышается доля дигидрокси-формы оротата; изменения структурного состояния оротат-аниона и соотношения разных изомерных форм оротат-аниона может привести к изменению биологических свойств препарата;
— препарат, содержащий гидрокси-форму оротата магния отличается от исходного препарата большей липофильностью, поэтому следует ожидать улучшения его биодоступности;
— механоактивация приводит к уменьшению частиц порошка препарата и аморфизации; по-видимому, это является причиной повышения скорости растворения механоактивированного препарата в воде, при этом растворимость практически не изменяется.
Биологические свойства исходного и механоактивированного препарата «магнерот»
Биоэлектрическая активность клеток. В эксперименте, посвященном изучению электрокинетических свойств клеток крови в растворах исходного и механоактивированных препаратов «магнерот», выяснено, что наибольшая доля активных клеток, а также амплитуды колебаний клеток, ядра и цитолеммы наблюдается в растворах препарата «магнерот» после 1 ч механоактивации, содержащего гидрокси-форму оротата магния (табл. 4 и 5). Электрокинетический потенциал клеток обеспечивается структурным состоянием поверхности клеток, которые в свою очередь связаны со скоростью протекания метаболических процессов в клетке, ионообменными свойствами частиц и т.п. Увеличение количества внеклеточного магния влияет на заряд мембраны, изменяя его отрицательные характеристики. В связи с этим подвижность цитолеммы и кариолеммы меняется. Разрушение гидрокси-формы приводит к понижению активности клеток в растворе препарата, механоактивированного в течение 6 ч.
Таблица 4
Показатели биоэлектрической активности клеток буккального эпителия
Вещество, время механоактивации, ч Показатели биоэлектрической активности клеток буккального эпителия
доля активных клеток, % амплитуда колебаний
ядра цитолемма клетки
«магнерот» 0 28±3,6 0 1±0,2 1±0,3
1 100±12,0 6±0,4 1,9±0,3 2,7±0,3
6 100±2,1 1±0,2 0,6±0,1 1,5±0,2
Полученные результаты свидетельствуют о том, что именно гидрокси-форма является наиболее активным изомером оротата магния. Окси- и дигидрокси-формы обладают существенно меньшей биологической активностью. Поэтому исследования на лабораторных животных проводились с использованием исходного препарата «магнерот» и препарата, механоактивированного в течение 1 ч.
Показатели биоэлектрической активности клеток крови
Вещество, время механоактивации, ч Показатели биоэлектрической активности клеток крови
доля активных эритроцитов, % амплитуда колебаний
Оротат магния 0 83±2,6 7±1,7
1 96±2,5 16±3,2
6 83±3,2 10±2,8
Исследования на модели гипомагниемии. Более выраженное активирующее действие гидрокси-формы оротата магния (в составе механоактивированного 1 ч препарата) оказывает на клетки иммунной системы (лимфоциты), что коррелирует с гомеостатической функцией этой формы магния оротата при введении ее в организм лабораторных животных.
При введении гидрокси-формы количество магния в плазме крови повышается на 64 %, в отличие от результатов группы сравнения (оксо-форма), в которой количество магния в плазме крови не увеличивается (табл. 6). Более быстрый оклик организма на прием гидрокси-формы коррелирует с более высокой растворимостью и скоростью растворения этой формы по сравнению с оксо-формой.
Таблица 6
Макроэлементы в сыворотке крови лабораторных животных при формировании гипомагнезиемии и лечении оротатом магния (ммоль/л)
Элемент Контроль (интактные животные) ГМЕ (группа сравнения) Лечение 6 дней
1 ч исходный «магнерот»
Магний 1,75±0,08 0,902±0,18 1,12±0,10 0,855±0,05
Натрий 143,95±0,21 142,825±0,08 141,0±0,40 142,7±0,18
калий 4,86±0,90 4,39±1,52 5,495±0,14 4,405±1,56
После введения механоактивированного оротата магния цитологические показатели белой крови возвращаются к нормальным значениям, но не красной крови (табл. 7). Гемоглобин и эритроциты продолжают падать, но более значительно в группе с исходным препаратом. Аналогичная тенденция с тромбоцитами: количество этих клеток снижено в обеих группах при лечении в течение 6 дней без тенденции к нормализации как в группе с исследуемым препаратом, так и фармакопейным, но снижение более выражено во второй группе.
Таблица 7
Показатели белой и красной крови лабораторных животных в условиях формирования модели гипомагнезиемии и лечении магния оротатом
Показатель Контроль (интактные животные) ГМЕ (группа сравнения) Гидрокси-форма магния оротата Оксо-форма магния оротата
Лейкоциты 11,2±1,81 16,96±5,001 11,58±1,3 12,3±3,9
Лимфоциты 5,9±1,3 10,02±1,3 6,45±1,2 7,03±1,9
Гранулоциты 3,55±0,08 5,4±0,07 4,1±0,04 4,17±0,11
Гемоглобин 153,5±7,2 140,2±4,81 125,0±4,08 110,33±12,28
Эритроциты 8,165±0,39 6,984±0,27 6,81±0,18 5,85±0,31
Средний объем эритроцита 54,62±2,60 59,08±2,28 58,33±3,51 60,2±4,55
Тромбоциты 1184,5±243,72 947±127,57 936±87,22 843±68,37
Исследования на модели стероидного остеопороза. Состояние обмена коллагена определяется взаимодействием процессов биосинтеза и распада данного биополимера. На ускорение синтеза коллагена указывает увеличение содержания суммарного коллагена и
его нейтральносолерастворимой фракции. Катаболические процессы приводят к повышению содержания свободного гидроксипролина и снижению суммарного коллагена в тканях.
У животных со стероидным остеопорозом концентрация нейтральносолерастворимой фракции коллагена снижалась на 54,7 % по сравнению с контролем. Применение обоих форм оротата магния стимулировало синтетическую активность остеобластов в костной ткани крыс с остеопорозом. Однако при введении механоактивированного «магнерота» содержание исследуемой фракции коллагена было выше на 130,4 % (р<0,01) по сравнению с аналогичным показателем, изучаемым при введении оксо-формы препарата.
Уровень свободного гидроксипролина в костной ткани животных со стероидным диабетом превышал контрольные значения на 400,8 % (р<0,001). Использование препаратов магния привело к уменьшению этих изменений. Так, при введении исходного и механоактивированного «магнерота» крысам с остеопорозом количество свободного гидроксипролина снизилось на 60 и 53,7 % (р<0,05), соответственно.
Содержание суммарного коллагена у животных с остеопорозом было ниже данных контрольной группы на 42,8 % (р<0,01). Введение оротата магния нивелировало эти изменения. Применение оксо-формы препарата позволило достигнуть уровня исследуемого показателя контрольных животных, тогда как использование гидрокси-формы оротата магния привело к увеличению суммарного коллагена на 65,3 % (р<0,001) по сравнению с контролем.
Таким образом, введение как исходного, так и механоактивированного препаратов «магнерот» корректирует нарушение обмена коллагена костной ткани. При этом интенсификация анаболических процессов в обмене коллагена более выражена при использовании препарата, содержащего гидрокси-форму оротата магния.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В состав лекарственного препарата «магнерот» оротат магния входит в двух изомерных формах - оксо- и дигидрокси-. Механоактивация препарата приводит к изменению структурного состояния и таутомерным превращениям оротата магния. После 1 ч механоактивации формируется гидрокси-форма оротат-аниона, а после 6 ч механоактивации гидрокси-форма разрушается, при этом наблюдается увеличение доли дигидрокси-формы оротат-аниона.
Механоактивация практически не влияет на растворимость препарата, при этом скорость растворения механоактивированного нанорзамерного препарата увеличивается в 1,5 раза по сравнению с исходным. Растворимость исходного и механоактивированного препаратов немонотонно зависит от рН раствора: наименьшая растворимость наблюдается при рН=2, максимальная - при рН=4. Структурное различие изомеров оротата магния сохраняется в водном растворе. Показано, что препарат, содержащий гидрокси-форму оротат-аниона обладает повышенной биологической активностью по сравнению с препаратом, содержащим оксо- и дигидрокси-формы.
Работа выполнена по проекту Программы Президиума РАН № 12-П-2-1065.
Авторы выражают благодарность Собенниковой М.В. за проведение анализа элементного состава образцов маханоактивированного оротата магния, определение скорости растворения и растворимости в октаноле и к.м.н. Соловьеву А.А. за проведение анализа методом микроэлектрофореза.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ломовский О.И. Прикладная механохимия: фармацевтика и медицинская промышленность // Обработка дисперсных материалов и сред. 2001. № 11. С. 81-100.
2. Тюкавкина Н. А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия : учебник для ВУЗов. М. : Дрофа, 2004. 544 с.
3. Канунникова О.М., Гильмутдинов Ф.З., Кожевников В.И., Трапезников В.А. Методы фотоэлектронных исследований неорганических материалов : учебное пособие. Ижевск : Изд-во Удм. ун-та, 1995. 393 с.
4. Харамоненко С.С., Ракитянская А. А. Электрофорез клеток крови в норме и патологии. Минск : Беларусь, 1974. 143 с.
5. Зиганшина Л.Е., Бурнашова З.А., Валеева И.Х., Салихов И.Г., Цыплаков Д.Э., Галяутдинова А.Ю., Гарифуллова Ю.В., Валиев В.С.. Сравнительное изучение влияния монофосфоната димефосфона и бифосфоната ксидифона на гистоморфометрические показатели строения позвонков крыс при моделировании глюкокортикостероидного остеопороза // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2002. № 65, № 5. С. 62-65.
6. Прошина Л.Я., Приваленко М.Н. Исследование фракционного состава коллагена в ткани печени // Вопросы медицинской химии. 1982. № 1. С. 115-119.
7. Бутолин Е.Г. Обмен биополимеров соединительной ткани при стресс-активирующих и стресс-лимитирующих воздействия : дис. д-ра мед. наук. 1993. Казань, 293 с.
8. Винокуров А. Ю. Исследование закономерностей и совершенствование технологии катионирования крахмала в водной суспензии : Автореф. дис. канд. техн. наук. М., 2013. 25 с.
9. Зубавичус Я. В. Мягкая рентгеновская синхротронная спектроскопия биоорганических материалов, воды и водных растворов. Автореферат дис. д-ра физ.-мат.наук. М. 2012. 45 с.
10. Beamson G., Briggs D. High Resolution XPS of Organic Polymers: The Scienta ESCA300 Database, Wiley Intercience, 1992. 306 p.
EFFECT OF BALL-MILLING ON THE STRUCTURE, PHYSICAL-CHEMICAL AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE NANOSCALE «MAGNEROT»
:Karban O.V., 2Kanunnikov M.M., 2Chuchkova N.N., 2Savinova N.V., 1Muhgalin V.V., 1Gilmutdinov F.Z., 2Komissarov V.B., 2Butolin E.G.
Physical-Technical Institute, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Izhevsk, Russia 2Izhevsk State Medical Academy, Izhevsk, Russia
SUMMARY. In the composition of the drug magnerot" magnesium orotate is in two isomeric forms oxo-, hydroxi-, dihydroxi-. Ball milling of the drug leads to a structural change of status and tau-tomeric transformations magnesium orotate. Defined: solubility initial and mechanically activated drugs depending on the pH of the aqueous solution; the temperature dependence of the density and kinematic viscosity of aqueous solutions; solubility in octanol. It is shown that the preparation containing hydroxi-form orotate anion has increased biological activity compared to the product containing oxo -, dihydroxi-shape.
KEYWORDS: magnesium orotate, ball milling, electronic structure, physical-chemical properties.
Карбань Оксана Владиславовна, доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник отдела структурно-фазовых превращений ФТИ УрО РАН, тел. 9225056346, e-mail: ocsa123@yahoo.com
Канунников Михаил Михайлович, студент III курса ИГМА, тел. 91220296787, e-mail: 6k6@mail.ru
Чучкова Наталья Николаевна, доктор медицинских наук, зав. кафедрой биологии с экологией ИГМА, тел. 9124662699, e-mail: mig05@inbox.ru
Савинова Наталья Вячеславовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии ИГМА, тел. 9090519323, e-mail: s9090519323@yandex.ru
Мухгалин Владислав Викторович, младший научный сотрудник отдела структурно-фазовых превращений ФТИ УрО РАН, тел. 9226838508, e-mail: muhgalin@inbox.ru
Гильмутдинов Фаат Залалутдинович, кандидат физико-медицинских наук, зав. отделом физики и химии поверхности ФТИ УрО РАН, тел.(3412) 43-15-73, e-mail: lasas@ftiudm.ru
Комиссаров Вячеслав Борисович, аспирант кафедры биологии с экологией ИГМА, тел. 9127596857, e-mail: slavkomissar@mail.ru
Бутолин Евгений Германович, доктор медицинских наук, профессор, проректор ИГМА, тел. 9126566982, e-mail: butolin@igma.udm.ru
