CC BY
20
А.К. Мартусевич1, А.А. Костя ев2
Влияние криоконсервантов с различным сроком хранения на кристаллогенные свойства плазмы крови
1 ФГБУ Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздрава России, г. Нижний Новгород 2 ФГБУН Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России, г. Киров
A.K. Martusevich1, A.A. Kostyaev2
How cryopreservatives with different shelf life effect crystallogenic properties of blood plasma
1 Nizhny Novgorod Traumatology and Orthopaedics Research Institute 2 F.S.B.R.I Kirov Haematology and Blood Transfusion Research Institute. The Federal Medical-Biological Agency (FMBA)
Введение
Известно, что криоконсервация крови и ее компонентов является превалирующим способом их длительного хранения без потери функциональных свойств [1; 8; 9; 11]. С учетом того обстоятельства, что использование крови и ее компонентов во многих
случаях не может быть заменено синтетическими аналогами [1; 11], сохранение данного биоресурса становится жизненно важным. При этом особую ценность приобретают методы тестирования биологической активности криок онсервантов и оценки адекватности режимов сохранения биоматериала [2; 8; 9; 12]. Кроме того, принципиаль-
ное значение имеет сохранность криозащит-ных свойств консервантов в процессе их хранения перед использованием. Нами на протяжении последних 5 лет изучаются возможности методов биокристалломики для решения этого круга задач [3—7].
Цель работы — оценка кристаллоген-ныгх свойств системы «плазма крови — крио-консервант» при использовании криоконсер-ванта с неистекшим и продленным сроками годности (на примере раствора тромбокри-одмац).
Материалы и методы исследования
Для создания системы использовали свежезаготовленную кровь от одного донора и гемоконсервант тромбокриод-мац (ТКД) на основе криопротектора ди-метилацетамида (ДМАЦ) с неистекшим и искусственно истекшим сроками годности. Систему «биожидкость — криоконсер-вант» создавали .........путем смешивания донорской крови с криопротектором, последующей экспозиции при 37С в течение 4 и 24 часов. Дегидратацию капель плазмы проводили на предметном стекле при комнатной температуре — 20—25 С. Исследование кристаллизации сформированных жидких систем осуществляли путем качественного и количественного анализа с использованием комплекса визуаме-трических параметров [6].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Statistica 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе работы нами были уточнены особенности кристаллогенной активности самих криопротекторов. Установлено, что все они в индивидуальном виде обладают минимальной способностью к формированию кристаллических и/или псевдокристаллических структур.
Особенности кристаллогенеза крио-протекторов, четко просматриваемые и при докритериальной оценке микропрепаратов, нашли отражение в значениях полуколичественных показателей (рис. 1). Так, кри-сталлогенная активность ТКД минимальна в обеих точках наблюдения, а формируемые структурные элементы имеют выраженные признаки деструкции и отчетливую краевую зону. Остальные криозащит-ные средства после 24 часов термостатиро-вания образовывали специфичную фацию с вариабельным количеством одиночных и дендритных кристаллов.
ява
ТКД | ДМСО | Глицерин + ТКД | ДМСО | Глицерин +
4 часа гшокоза ^ ^^ гаюкоза
ТКД | ДМСО | Глицерин +
Рис. 1. Визуаметрический анализ фаций различных криокон-сервантов через 4 и 24 часа экспозиции при 37°С. ТКД - тромбокриодмац, ДМСО - диметилсульфоксид
Плазма + ТКД
Плазма + ДМСО
Плазма + 5% глицерин + 4% глюкоза
Рис. 2. Результат сокристаллизации плазмы крови здоровых доноров с различными криопротекторами (ув. х 56).
ТКД - тромбокриодмац, ДМСО - диметилсульфоксид
2,5
0,5
Кроме того, проводили оценку характера и особенностей сокристаллизации изучаемых криоконсервантов с аликвотным количеством плазмы крови (рис. 2).
На рис. 3 представлены сравнительные данные по кристаллоскопическим картинам структуризации фаций каждой из исследуемых биосистем. Следует подчеркнуть, что максимальным ингибирующим эффектом в отношении плазмы крови здоровых доноров обладает комбинация криоконсервантов «глицерин + глюкоза», в фациях с которой даже через 24 часа термостатирования кристаллические структуры практически не образуются. Менее выраженные ингибирующие свойства были присущи ТКД, формирующему при сокристаллизации с изучаемой биологической жидкостью многочисленные «разломы». Последние присутствовали во всех зонах микропрепарата. Агрегаты аморфных образований были преимущественно расположены в промежуточной зоне.
Фации, полученные при совместной дегидратации плазмы крови и диме-тилсульфоксида (ДМСО), морфологически наиболее соответствуют характеру натив-ной структуризации данного биосубстрата: в образце четко выделяются все основные зоны; «разломы» краевой зоны регулярны, центростремительны; в центральной зоне наблюдается умеренное количество кристаллических элементов.
Различный характер структуризации изучаемых биосистем полностью подтверждают результаты визуаметрического анализа фаций (см. рис. 3). Так, наиболее выраженными и максимально приближенны -ми к физиологическим кристаллогенными свойствами обладает биосистема, содержащая ДМСО. Применение глицерина и глюкозы в качестве криопротектора, напротив, ингибирует скорость и активность структу-рообразования. ТКД занимает промежуточное положение между ними. Это проявляется в уровне всех основных морфометриче-ских показателей как через 4, так и через 24 часа экспозиции при 37°С.
На основании этой серии экспериментов установлено, что по «мягкости» физиологического эффекта в отношении сыворотки крови в незамороженном состоянии кон-
серванты формируют ряд: ДМСО > ТКД > 5% глицерин + 4% глюкоза.
На третьем этапе работы проводили сравнительную оценку характера сокристаллизации криоконсерванта с неистекшим и продленным сроками годности (на примере ТКД). Установлено, что применение гемо-консерванта с неистекшим сроком годности в большей степени способствует сохранению типичной картины структуропостроения сыворотки крови. Это проявляется в физиоло-гичности наблюдаемой в данном случае краевой зоны. Так, через 4 часа термостатирования регистрируются наличие «опоясывающих» разломов, более выраженное выделение «отдельностей», в центральной зоне наблюдается концентрирование кристаллического компонента (рис. 4А), а через 24 часа экспозиции при 37°С — формирование достаточно физиологичной фации с радиальными разломами и оформленной центральной зоной, включающей единичные аморфные и кристаллические элементы (рис. 5А).
Использование криоконсерванта с истекшим сроком годности оказывает существенное негативное влияние на кристалло-генную активность биологического субстрата, на что указывают хаотичное расположение разломов текстуры, слабое контурирование краевой белковой зоны фации, а также минимальные признаки кристаллизации в центральной зоне микропрепаратов через 4 часа термостатирования (рис. 4Б).
Эти тенденции сохраняются и через 24 часа экспозиции системы при 37°С: к этому времени в центральной зоне фации практически отсутствуют кристаллические эле-
Ш
□ ТКД
□ ДМСО
" ■ Глицерин+глюкоза
Кр | ИС СДФ 4 часа
Кр
ИС | СДФ | Кз 24 часа
Рис. 3. Морфометрический анализ фаций, полученных при сокристаллизации плазмы крови здоровых доноров с различными криопротекторами. ТКД - тромбокриодмац, ДМСО - диметилсульфоксид
2
о -
А. Система «плазма крови - ТКД Б. Система «плазма крови - ТКД
с неистекшим сроком годности» с продленным сроком годности»
Рис. 4. Картина дегидратации системы «плазма крови - ТКД» через 4 часа термостатирования
А. Система «плазма крови - ТКД с неистекшим сроком годности»
Б. Система «плазма крови - ТКД с продленным сроком годности»
Рис. 5. Картина дегидратации системы «плазма крови - ТКД» через 24 часа термостатирования
менты, а радиальные разломы регистрируются только в краевой зоне не по всему периметру образца (рис. 5Б).
Выводы
1. Установлено, что кристаллогенная активность варьирует в зависимости от химического состава криозащитного агента, при этом по отношению к плазме крови сре-
ди изученных криоконсервантов наиболее физиологичен диметилсульфоксид. Применение криоконсерванта с истекшим сроком годности еще до начала замораживания трансформирует негативную кристалл огенную активность сыворотки крови, а следовательно, и ее физико-химические свойства.
Литература
1. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова думка, 1994.
2. Гулевский А.К., Михалев О.И., Рязан-цев В.В. О физических состояниях и криозащигных свойствах растворов хо-линхлорида // Криобиология. 1987. № 1. С. 17-21.
3. Мартусевич А.К. Биокристалломика как наука о спонтанном, направленном и управляемом биокристаллогенезе // Информатика и системы управления. 2008. № 2. С. 145— 148.
4. Мартусевич А. К., Воробьев A.B., Гриши -на A.A., Русских А.П. Физиология и патология кристаллостаза: общая парадигма и перспективы изучения // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 1. С. 135—139.
5. Мартусевич А.К., Зимин Ю.В. Экспериментальная кристалл омика — модели -рование биокристаллогенеза // Вестник новых медицинских технологий. 2008. Т. 15. № 1. С. 14—17.
6. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф. Кристаллография биологической жидкости как метод оценки ее физико-химических свойств // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т. 143. № 3. С. 358—360.
7. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф., Иван-никова Е.В., Жукова Н.Э. Характер действия физико-химических факторов на особенности структуризации сыворотки крови человека in vitro // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2012. Вып. 43. С. 112—115.
8. Сведенцов Е.П., Деветьярова О.Н., Туманова Т. В. и др. Введение лейкоцитов в холодовой анабиоз (-20С) по экспоненциальной программе // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005. № 3. С. 558-566.
9. Сведенцов Е.П., Туманова Т. В., Худяков А.Н. и др. Сохранение биологических мембран ядерных клеток крови при температуре —80С / / Биологические мембраны. 2008. Т. 25. № 1. С. 23—29.
10. Цуцаева А. А., Котляров А. О., Кудоко-цева О.В. Механизмы индукции и репарации нелетальных криоповреждений // Цитология. 2004. Т. 46. № 9. С. 879.
11. Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. On the problem of dehydration and intra-cellular crystallization during freezing of cell suspension // Cryobiology. 1976. Vol. 13. № 2. P. 147—152.
12. Zaytseva O.O., Polejaeva T.V., Sveden-tsov E.P. et al. Efficiency of application original preservatives for conservation leukocytes at — 40°C // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. 2011. Vol. 7. № 4. Р. 197—206.а
Контакты:
Костяев Андрей Александрович,
руководитель лаборатории консервирования крови и тканей ФГБУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови, доктор биологических наук. Тел.: 8-332-67-33-87. E-mail: labcon@mail.ru
