CC BY
35
А.А. Костя ев1, А.К. Мартусевич2
Зависимость кристаллогенных свойств плазмы донорской крови от температуры замораживания и вида криопротектора
1 ФГБУН Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови
ФМБА России, г. Киров 2 ФГБУ Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России, г. Нижний Новгород
А.А. Kostyaev1, A.K. Martusevich2
Crystal-growth properties of donor blood plasma in relation to freezing temperature and the kind of cryoprotectant used
1 F.S.B.R.I Kirov Haematology and Blood Transfusion Research Institute. The Federal Medical-Biological Agency (FMBA), Kirov 2 Traumatology and Orthopaedic Research Institute, Nizhny Novgorod
Ключевые слова: криопротекторы, плазма крови, кристаллогенные свойства, биокристалломика.
Keywords: cryoprotectant, blood plasma, crystal growth properties, biocrystallomics.
Целью работы было исследование сохранности кристаллогенных свойств плазмы крови с учетом вида криопротектора (гемоконсерванта) и режима его замораживания. Оценку характера кристаллизации биологического субстрата, в который предварительно был внесен криоконсервант (5% раствор диметил-сульфоксида, тромбокриодмац или 5% раствор глицерина в сочетании с 4% раствором глюкозы), проводили методом световой микроскопии до начала и после завершения замораживания. Выли выбраны четыре температурных режима: 22—24°С, 37°С, —80°С и —196°С. Для изучения характера сокристаллиза-ции систему <биожидкость —криоконсервант» (1:1) создавали invitro в пробирке с кровью одного донора. Капли плазмы с гемоконсервантом высушивали при комнатной температуре спонтанно на прозрачном стекле. Установлено, что по кристаллогенным свойствам фаций высушенных капель плазмы наиболее физиологичен диметилсульфоксид,причем предпочтительным является режим замораживания, соответствующий —196°С.
The aim of this work is to understand how to maintain blood plasma crystal-growth properties using various freezing protocols and crioprotectants. Using light microscope we observed crystallization of a biological substrate, with and without adding cryoprotectant (either 5% dimethylsulfoxyde, Trombocryodmac, or 5% Glycerine +4% Glucose) before and after freezing. We used four temperature regiments: 22—24°C, 37°C, —80°C and —196°C. We found out, that by the crystal-growing properties, the most suitable crioprotectant for human physiology is dimethylsulfoxyde, and most preferable temperature regiment is —196°C
Известно, что кровь и ее компоненты являются одними из наиболее важных материалов биологического происхождения, значение которых в современной медицине трудно переоценить [1; 11]. В настоящее время метод консервации крови и ее компонентов при низких и ультранизких температурах служит превалирующим способом их длительно-
го хранения вне организма человека без потери клетками функциональных свойств [1; 2; 9; 10; 12]. При этом особую значимость приобретают методы тестирования биологической активности гемоконсервантов и оценки адекватности режимов сохранения биоматериала [2; 3; 9; 10; 13]. Нами на протяжении последних 5 лет изучаются возмож-
ности использования методов биокристалло-мики для решения этого круга задач [4—8]. В связи сизложенным целью работы стало исследование сохранности кристаллогенных свойств плазмы крови с учетом вида крио-протектора и режима консервирования биосубстрата «плазма + криопротектор».
Материалы и методы
Оценку кристаллогенных свойств биологического субстрата, в который предварительно был внесен криопротектор (5% раствор диметилсульфоксида (ДМСО), тромбокриодмац (ТКД) или 5% раствор глицерина в сочетании с 4% раствором глюкозы), проводили до начала и после завершения консервации. Были выбраны режимы консервации (экспозиции) при положительных (22—24 С и 37С) и отрицательных (—80°С и — 196 С) температурах. Для изучения характера со-кристаллизации систему «биожидкость — криоконсервант» исследовали на предметном стекле, на котором впоследствии производили ее спонтанную (без термической стимуляции) дегидратацию. Исследование кристаллизации сформированных жидких систем осуществляли путем качественного и количественного анализа с использованием комплекса визуаметрических параметров [6].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Statistica 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе работы нами были уточнены особенности кристалл огенной активности самих криопротекторов (рис. 1). Установлено, что все они в индивидуальном виде обладают минимальной способностью к формированию кристаллических и/или псевдокристаллических структур.
В целях уточнения визуаметриче-ских особенностей фаций различных крио-консервантов проведен морфометрический анализ последних через 4 и 24 часа экспозиции при 37°С. Особенности кристалло-генезакриопротекторов, четко просматриваемые при докритериальной оценке микропрепаратов, нашли отражение и в значениях полуколичественных показателей (рис. 2). Так, кристаллогенная активность ТКД минимальна в обеих точках наблюдения, а формируемые структурные элементы имеют выраженные признаки деструкции и отчетливую краевую зону. Остальные кри-озащитные средства к завершению дегидратации образовывали специфичную фацию с вариабельным количеством одиночных и дендритных кристаллов.
На втором этапе исследования проводили оценку характера и особенностей сокристаллизации трех изучаемых крио-консервантов с аликвотным количеством плазмы крови, полученной от доноров. Результат дегидратации оценивали через 4 и 24 часа экспозиции при 37°С. На ри-
ТКД
ДМСО
5% глицерин+ 4% глюкоза
Рис. 1. Кристаллоскопическая картина фаций различных криоконсервантов (ув. х56)
Рис. 2. Визуаметрический анализ фаций различных криоконсервантов через 4 и 24 часа экспозиции при 37°С
Кр | ИС СДФ | Кз 4 часа
4
з Кр | I
Кр | ИС | СДФ | Кз 24 часа
□ ТКД
□ ДМСО
■ Глицерин+гяюкоза
Рис. 4. Морфометрический анализ фаций, полученных при со-кристаллизации плазмы крови здоровых доноров и различных криопротекторов через 4 и 24 часа экспозиции при 37°С
2,5
2
1,5
0,5
сунке 3 представлены сравнительные данные по кристаллоскопическим картинам структуризации каждой из исследуемых биосистем. Следует подчеркнуть, что максимальным ингибирующим эффектом в отношении плазмы крови здоровых доноров обладает комбинация криоконсерван-тов «глицерин + глюкоза», в фациях с которой кристаллические структуры практически не образуются. Менее выраженные ингибирующие свойства присущи ТКД, который формирует при сокристаллизации с изучаемой биологической жидкостью многочисленные «разломы», присутствую -щие во всех зонах микропрепарата, а также агрегаты аморфных образований, расположенные преимущественно в промежуточной зоне.
Фация, полученная при совместной дегидратации плазмы крови и ДМСО, морфологически наиболее соответствует характеру нативной структуризации данного биосубстрата: в образце четко выделяются все основные зоны; «разломы» краевой зоны ре-
гулярны, центростремительны; в централь -ной зоне наблюдается умеренное количество кристаллических элементов.
Различный характер структуризации изучаемых биосистем полностью подтверждают результаты визуаметрического анализа фаций (рис. 4). Так, наиболее выраженными и максимально приближенными к физиологическимкристаллогенными свойствами обладает биосистема, содержащая ДМСО. Применение глицерина и глюкозы в качестве криопротектора, напротив, ингибирует скорость и активность структу-рообразования. ТКД, в основе которого содержится диметилацетамид (ДМАЦ), занимает промежуточное положение между ними. Это проявляется на уровне всех основных морфометрических показателей как через 4, так и через 24 часа экспозиции при 37°С.
На основании данной серии экспериментов установлено, что по «мягкости» физиологического эффекта в отношении плазмы крови в незамороженном состоянии консер-
Рис. 3. Результат сокристаллизации плазмы крови здоровых доноров с различными криопротекторами (ув. х56)
ванты формируют ряд: ДМСО > ТКД > глицерин + глюкоза.
В третьей серии экспериментов выполнен анализ влияния режима замораживания систем «плазма крови — криоконсервант» на их кристаллогенные свойства. Выявлено, что через 4 часа экспозиции при 37 С интакт-ных и подвергавшихся замораживанию биосистем, содержавших в качестве криопротектора ДМАЦ (ТКД), формируются различные кристаллоскопические картины. Так, если сокристаллизациябиосреды с криокон-сервантом приводила к фации, образованной немногочисленными аморфными элементами, то предварительное их охлаждение увеличивало кристаллогенный потенциал системы, о котором судили по кристаллизуемости и индексу структурности, обратно пропорционально степени ее замораживания.
При замораживании криопротектора до —80С и экспозиции смешанной с ним крови при 37°С в течение 24 часов в образцах системы «плазма крови — ТКД» наблюдали формирование минимальной, но достаточно четкой краевой зоны; в центральной зоне — многочисленные неоформленные структурные элементы. Следует отметить, что в данном случае в картине фаций обнаруживаются широкие «разломы» краевой зоны, распространяющиеся вплоть до центра образца. При более глубокой (до — 196°С) заморозке криопротектора фация высушенной плазмы остается цельной, но отчетливого формирования краевой зоны и регулярных кристаллических элементов в ней не происходит. Морфометрический анализ образцов данной серии подтверждает указанные тенденции: за счет многочисленных структурных элементов в фациях биосистем, смешанных с криопротектором, который перенес охлаждение до —80°С, регистрируются более высокие значения индекса структурности и кристаллизуемости как через 4, так и через 24 часа экспозиции при 37°С по отношению к исходному состоянию биосистемы и более глубоком охлаждении (рис. 5). В то же время в результате замораживания до —196С уровень большинства морфометрических параметров фаций в меньшей степени отличался от контрольного.
различных температурных режимах замораживания через 4 и 24 часа экспозиции при 37°С
В целом в серии с использованием в качестве криопротектора ТКД наиболее оптимально сохранились кристаллогенные свойства плазмы при ее замораживании при температуре — 196С по сравнению с режимом замораживания при —80°С. Данная тенденция обнаруживалась как через 4, так и через 24 часа экспозиции при 37°С.
Вторым изучаемым консервантомбыл ДМСО, результаты сокристаллизации которого через 4 часа экспозиции при 37°С представлены на рисунке 6. В рассматриваемой точке наблюдения при предварительном замораживании криопротектора до —80°С отмечали выраженное ингибирование кристал-логенеза плазмы с формированием единичных одиночно-кристаллических структур в центре образца, тогда как при его охлаждении до —196°С общая структурная организация фации сохранялась аналогичной контрольному образцу.
Показано, что через 24 часа экспозиции при 37°С структурные различия между фациями биосистем, подвергнутых воздействию исследуемых режимов замораживания, минимализируются. Наблюдавшиеся в этот срок вариации показателей кристал-ломики преимущественно касались организации краевой и промежуточной зон микропрепаратов.
Анализ результатов собственной кристаллизации сформированных биосистем также указал на более быстрые темпы структуризации образцов, подвергнутых заморозке до —196С, что просматривалось по уровню индекса структурности, кристаллизуемо-сти и степени деструкции фации через 4 часа экспозиции при 37°С (см. рис. 6). Как уже
кристаллоскопических фаций плазмы
2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 -0 - i □ без замораживания □ -80°С ■ -196°С
Т
i Î- 1
пТпТ rï 1 \
Кр ИС СДФ Кз 4 часа Кр ИС СДФ | Кз 24 часа
было отмечено, значения показателей, характерные для изучаемых режимов криокон-сервации, через 24 часа экспозиции при 37°С сближались, но более физиологичным оставался режим охлаждения до — 196С.
Таким образом, 5% раствор ДМСО во всех пробах демонстрировал большую сохранность физиологической картины структуризации, чем ТКД. Кроме того, при замораживании в условиях охлаждения до —80°С процессы дегидратации и структуризации плазмы крови протекали быстрее, чем при —196°С, однако сохранность кристаллоген-ных свойств сформированной системы «плазма крови — криоконсервант», как и в случае использования ТКД, была выше при замораживании при —196С.
Последним из рассматриваемых нами криопротекторовбыла комбинация: 5% раствор глицерина + 4% раствор глюкозы. С учетом того, что практически все сахара — сильные ингибиторы кристаллогенеза, во всех пробах данной серии нами выявлены существенно меньшие скорость и активность кристаллообразования, что наиболее наглядно иллюстрирует результат структуризации биосистем через 4 часа экспозиции при 37°С (рис. 7). Особенно выражена указанная тенденция в отношении консервации при —80°С, когда регистрируется практически тотальное ингибирование кристаллизации.
Показано, что через сутки с момента нанесения биоматериала на предметное стекло в образце плазмы с криопротектором, ранее подвергнутом криовоздействию при —80°С, признаков структуризации практически не обнаруживается. Напротив, при более глубокой заморозке сформированная фа-
Рис. 7. Результаты визуаметрического анализа кристаллоскопических фаций плазмы крови, содержащей 5% глицерин и 4% глюкозу, при различных температурных режимах замораживания через 4 и 24 часа экспозиции при 37°С
ция в целом соответствует исходной, а в ее центральной зоне дополнительно появляется умеренное количество монокристаллов неопределенной формы.
Приведенные тенденции детерминируют и соответствующие результаты визуаме-трического анализа (см. рис. 7): практически полное отсутствие признаков кристаллизации образца при —80°С отражается в околонулевых значениях большинства показателей, а при —196°С через 4 часа экспозиции при 37°С регистрировали активацию кристаллообразования, частично нивелирующуюся к завершению анализа (24 часа экспозиции при 37°С).
Так, если в серии микропрепаратов на-тивной плазмы при добавлении криопротек-торов без замораживания признаки четкой структуризации регистрируются уже через 4 часа экспозиции при 37°С, то при охлаждении в режиме —80°С минимальная кристаллизация выявляется только через 24 часа экспозиции при 37°С. При замораживании в режиме —19 6° С скорость структуризации значительно выше, а формирующаяся картина более близка к характерной для незамороженной системы «плазма крови — крио-консервант».
Заключение
На основании проведенных исследований установлено, что по кристаллоген-ным свойствам среди изученных криоконсер-вантов наиболее физиологичен диметилсуль-фоксид, причем предпочтительным является режим замораживания, соответствующий -196°С.
Литература
1. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова думка, 1994.
2. Гордиенко E.A., Товстяк В.В., Сведенцов Е.П., Костяев A.A. Биофизика клеточных мембран/ Коми научный центр УрО РАН. Сыктывкар, 2009.
3. Гулевский А. К., Михалев О. И., Рязанцев В.В. О физических состояниях и криозащитных свойствах растворов хо-линхлорида // Криобиология. 1987. № 1. С. 17-21.
4. Мартусевич А. К. Биокристалломика как наука о спонтанном, направленном и управляемом биокристаллогенезе // Информатика и системы управления. 2008. № 2. С. 145-148.
5. Мартусевич А. К., Воробьев A.B., Гришина A.A., Русских A.n. Физиология и патология кристаллостаза: общая парадигма и перспективы изучения // Вестник Нижегородского университета им Н.И. Лобачевского. 2010. № 1. С. 135-139.
6. Мартусевич A.^, Зимин Ю.В. Экспериментальнаякристалломика — моделирование биокристаллогенеза // Вестник новых медицинских технологий. 2008. Т. 15. № 1. С. 14—17.
7. Мартусевич A.^, Камакин Н.Ф. Кристаллография биологической жидкости как метод оценки ее физико-химических свойств / / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т. 143. № 3. С. 358—360.
8. Мартусевич A.^, Камакин Н.Ф., Иванникова Е.В., Жукова Н.Э. Характер действия физико-химических факторов на особенности структуризации сыворот-
ки крови человека in vitro // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2012. Вып. 43. С. 112-115.
9. Сведенцов Е.П., Деветьярова О.Н., Туманова Т.В. и др. Введение лейкоцитов в холодовой анабиоз (-20С) по экспоненциальной программе // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005. № 3. С. 558-566.
10. Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Худяков А.Н. и др. Сохранение биологических мембран ядерных клеток крови при температуре -80°С // Биологические мембраны. 2008. Т. 25. № 1. С. 23-29.
11. Цуцаева А. А., Котляров А. О., Кудокоцева О.В. Механизмы индукции и репарации нелетальныхкриоповреждений // Цитология. 2004. Т. 46. № 9. С. 879.
12. Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. On the problem of dehydration and intracellular crystallization during freezing of cell suspension // Cryobiology. 1976. Vol. 13. Nr. 2. P. 147-152.
13. Zaytseva O.O., Polejaeva T.V., Svedentsov E.P. et al. Efficiency of application original preservatives for conservation leukocytes at -40°C // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. 2011. Vol. 7. Nr. 4. Р. 197-206.
Контакты:
Костяев Андрей Александрович
руководитель лаборатории консервирования крови
и тканей ФГБУН Кировский НИИ гематологии
и переливания крови,
доктор биологических наук.
Тел.: (8332) 67-33-87.
e-mail: labcon@mail.ru
