CC BY-ND
15
ДЕКАБРЬ №12 (237) ЗНиСО
41
t± -р
3
к вопросу изучения действия соединении азота на организм на примере оценки влияния нитроксилирования на кристаллогенные свойства сыворотки крови
А.К. Мартусевич, С.П. Перетягин, С.П. Ашихмин, О.Б. Жданова
estimation of nitroxylation effects on crystallogenic properties of human blood serum
A.K. Martusevich, S.P. Peretyagin, O.B. Zhdanova, S.P. Ashihmin
Кировская государственная медицинская академия; Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии
Проведена оценка особенностей реализации кристаллогенных свойств сыворотки крови здоровых людей при обработке газообразным монооксидом азота. Установлено, что в результате обработки крови монооксидом азота в газовой фазе кристаллогенные свойства сыворотки крови претерпевают ряд специфических и неспецифических трансформаций, наиболее четким из которых является формирование рельефной полосы в краевой зоне фации.
Ключевые слова: сыворотка крови, кристаллогенные свойства, монооксид азота, трансформация.
The aim of this work is estimation of crystallogenic properties specialties of human blood serum at its processing by gaseous nitric oxide. It was stated, that crystallogenic properties of blood serum are transformated at nitroxylation. Main specialty of this facias is relief strip in specimen marginal zone.
Keywords: serum, kristallogennyeproperties, carbon monoxide, nitrogen transformation.
Высокая токсичность оксидов азота, которые присутствуют в сравнительно больших количествах в отходящих газах агрегатов промышленности, ставит их в один ряд с такими опасными загрязнителями воздушного бассейна, как твердые пылевые частицы и оксиды серы. Монооксид азота образуется в большей степени при окислении азота воздухом под воздействием высоких температур в факеле сгорания топлива (термические оксиды) и в меньшей — из азотосодержащих органических веществ, находящихся в составе твердого и жидкого видов топлива. Тем не менее, перевод заводов на экологически более чистые виды топлива (с угля на природный газ), который позволил устранить целый ряд загрязнений, не приводит, тем не менее, к снижению выбросов оксидов азота.
За последние два десятилетия было установлено, что молекула N0 обладает широким спектром биологического действия, которое условно можно разделить на регуляторное, защитное и вредное. В настоящее время пристальное внимание уделяется монооксиду азота (N0) как многогранному биорегулятору различных физиологических и патологических процессов, поэтому уточнение характера и механизмов его действия в отношении жидких биологических систем весьма актуально [1; 5]. В предыдущих исследованиях показано, что одним из таковых является кристаллогенная стабильность биосубстрата, модулируемая значимыми внешними и внутренними факторами [2; 3; 4; 5]. Установлено, что данный комплексный показатель существенно изменяется при обработке биологической жидкости кислородом или озоном, действии лазерного излучения, качественно и количественно трансформируется при введении в жидкость различных метаболитов (лактат, пиру-ват, мочевина и др.) [4].
Цель работы — оценка особенностей реализации кристаллогенных свойств сыворотки крови здоровых людей при обработке газообразным монооксидом азота.
Материалы иметодыисследования. Материалом исследования служили образцы крови 10 практически здоровых людей-доноров. Для проведения эксперимента 5 мл цельной крови помещалось в пробирку и производился прямой барботаж газовым потоком, содержащим монооксид азота, с помощью специально собранной установки. Генерация холодной плазмы, содержащей NO, осуществлялась с помощью аппарата «Плазон» (Россия) при концентрации действующего вещества в выбранных режимах 800 мкг/л. Время бар-ботирования составляло 3 мин, экспозиция после воздействия — 5 мин. По завершении экспозиции производилось центрифугирование образцов при 1500 об/мин. в течение 15 мин. Полученная сыворотка крови в объеме 100 мкл. наносилась на предметное стекло в соответствии с методом тезиокристаллоскопии [2; 3]. В качестве базисного вещества использовался 0,9 % раствор хлорида натрия. Дегидратация проводилась до формирования дефинитивной фации. Высушенные микропрепараты оценивались морфологически и визуаметрически с применением собственной системы полуколичественных параметров [4]. Статистическая обработка данных выполнялась с использованием программного пакета SPSS 11.0.
Результаты и их обсуждение. Исследование характера трансформации кристаллогенных и инициирующих свойств сыворотки крови осуществлялось как феноменологически (на основании общей оценки морфоструктуры сформированных кристаллоскопических и тезиграфических фаций), так и с использованием морфометриче-ских параметров. Классическое морфологическое описание особенностей структуризации биологической жидкости позволило установить, что обработка крови монооксидом азота приводит к образованию в краевой зоне микропрепарата рельефной полосы, отчетливо выступающей над поверхностью образца. Следует подчеркнуть, что данная полоса обнаруживается как при собственной кристаллизации биожидкости, так и при
42
ЗНиСО
ДЕКАБРЬ №12 (237)
сокристаллизации последней с изотоническим базисным веществом — 0,9 % раствором хлорида натрия.
Происхождение найденной полосы рассматривается на основании общих представлений о физико-химической природе процессов, происходящих в высыхающей капле [2; 3; 4]. Согласно сформировавшемуся в литературе мнению, краевая зона — это место сосредоточения белковых макромолекул, входящих в состав дегидратируемой биосреды [4]. В условиях обработки цельной крови N0 в газовой фазе с учетом примененной концентрации вещества (800 мкг/л) может происходить нитроксилирование белков. Известно, что одним из маркеров данного процесса служит уровень нитротирозина [4; 5]. Предшествующие исследования обнаружили, что при обработке крови монооксидом азота в данном режиме концентрация нитротирозина в биологической жидкости существенно возрастает. Следовательно, можно предположить, что выявленная полоса является морфоструктурным отображением нитрозативного стресса, возникшего в проведенном эксперименте.
В целом, рассматривая морфологические особенности кристаллизации сыворотки крови после ее обработки газовым потоком, содержащим N0, наблюдались признаки умеренной хаотизации фации, снижения кристаллогенного потенциала биосреды в сочетании с минимальным уменьшением выраженности деструктивных изменений кристаллов. Сравнительный анализ инициирую-
щих свойств интактной и обработанной моноок- ^^ сидом азота крови позволил установить, что после н— нитроксилирования происходит «обеднение» Э кристаллической структуры фации, заключающееся в снижении количества и плотности «раз- ^ ломов» краевой зоны, уменьшении инициаторно- 3 го потенциала и смещении вида преобладающих элементов с дендритных кристаллов на одиночно- ^ кристаллические. Помимо наиболее четкой поло- ^Е сы, обнаруживаемой в краевой зоне образца, в ^ промежуточной зоне присутствуют многочисленные (иногда — с варьирующим диаметром), менее ° рельефные (нежели основная) дополнительные полосы. С учетом представлений о тезиграфии как естественном биофизическом аналоге хроматографии можно предположить, что данный феномен обусловлен наличием в биосреде значительного количества белков, в различной степени потерявших нативные физико-химические свойства и/или конформационную структуру вследствие нитроксилирования.
Также о патологическом характере преобразований инициированного кристаллогенеза сыворотки крови свидетельствует умеренное нарастание признаков деструкции кристаллов после обработки монооксидом азота.
Количественное описание трансформаций дегидратационной структуризации изучаемого биосубстрата под влиянием барботажа N0 производилось с использованием системы визуаметри-ческих параметров. Установлено, что при нитрок-силировании отмечено статистически значимое
1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
£
ИС
Кр
СДФ
Кз
□ без обработки
□ обработка N0
Рис. 1. Собственная кристаллизация. Результаты визуаметрического анализа кристаллогенных и инициирующих свойств сыворотки крови при различных режимах нитроксилирования (* статистическая значимость различий р < 0,05). Сокращения:
ИС — индекс структурности, Кр — кристаллизуемость, СДФ — степень деструкции фации, Кз — выраженность краевой зоны, ТИ — тезиграфический индекс, К — кристалличность,
СДФ — степень деструкции фации
ДЕКАБРЬ №12 (237) ЗНифО
43
5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
rfl
* T
pb * * pF-
-S-i
31
ТИ
К
СДФ
Кз
El без обработки El обработка NO
Рис. 2. Инициированная кристаллизация. Результаты визуаметрического анализа кристаллогенных и инициирующих свойств сыворотки крови при различных режимах нитроксилирования (* статистическая значимость различий р < 0,05) Примечания:
ИС — индекс структурности, Кр — кристаллизуемость, СДФ — степень деструкции фации, Кз — выраженность краевой зоны, ТИ — тезиграфический индекс, К — кристалличность,
СДФ — степень деструкции фации
снижение индекса структурности и кристаллизуе-мости сыворотки крови, подтверждающее выраженное падение кристаллогенной активности биоматериала (рис. 1). Такая тенденция сопровождается уменьшением радиуса краевой зоны образца, указывая на редукцию количества натив-ных белков, а также умеренным нарастанием степени деструкции фации.
Визуаметрическая оценка тезиграмм опытных и контрольных образцов сыворотки крови дала возможность верифицировать снижение и инициаторного потенциала биожидкости, на что указывает уменьшение уровня тезиграфического индекса и кристалличности (рис. 2). В то же время параметр характерной оформленности краевой зоны образцов существенно не изменяется, что может быть связано с увеличением гетерогенности молекулярных масс протеинов биожидкости. Кроме того, в тезиграфических фациях сыворотки крови после обработки N0 наблюдалось нарастание степени деструкции элементов.
Заключение. Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что в результате обработки крови монооксидом азота в газовой фазе кристаллогенные свойства сыворотки крови претерпевают ряд специфических и неспецифических трансформаций, где наиболее четкий сдвиг характера собственного и инициированного кристаллообразования биосреды выражается в формировании рельефной полосы в краевой зоне фации, потенциально обусловленное нитрокси-лированием белков.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях / А.Ф. Ванин / Вестник РАМН. 2000. № 4. С. 3—5.
2. Мартусевич А.К. Кристаллография биологической жидкости как метод оценки ее физико-химических свойств / А.К. Мартусевич, Н.Ф. Камакин //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т 143, № 3. С. 358—360.
3. Мартусевич А.К. Метод тезиокристаллоскопии в идентификации качества лекарственного препарата / А.К. Мартусевич, О.Б. Жданова //Фармация. 2006. № 6. С. 15—17.
4. Мартусевич А.К. Характер действия физико-химических факторов на особенности структуризации сыворотки крови человека in vitro / А.К. Мартусевич [и др.] // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2012. Вып. 43. С. 112—115.
5. Nitric Oxide. Basic Research and Clinical Application / Ed. R.J. Gryglewsky, P. Minuz. Amsterdam; Berlin; Oxford; Tokyo; Washington: IOS Press, DC, 2001.
Контактная информация:
Жданова Ольга Борисовна, тел.: 8 (919) 522-40-93, e-mail: oliabio@yandex.ru
Contact information: Zhdanova Olga, phone: 8 (919) 522-40-93, e-mail: oliabio@yandex.ru
