CC BY
24
УДК 612.017.1: (57.085.12+57.085.23)
ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА ПЕПТИДА ТАФТСИНА С КУКУРБИТ[7]УРИЛОМ НА ПРОДУКЦИЮ СУПЕРОКСИДНОГО РАДИКАЛА IN VITRO И IN VIVO
Екатерина Александровна ПАШКИНА1, Геннадий Юрьевич ЛЮБИМОВ1, Любовь Викторовна ГРИШИНА1, Ольга Анатольевна ГЕРАСЬКО2, Елена Владимировна ЯКУШЕНКО1, Владимир Александрович КОЗЛОВ1
1 ФГБУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
2 ФГБУН Институт неорганической химии имени А.В. Николаева СО РАН 630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 3
Настоящая работа посвящена исследованию влияния иммуномодулятора тафтсина, находящегося в комплексе с кукурбит[7]урилом, на продукцию супероксидного радикала фагоцитирующими клетками. Предполагалось, что комплексообразование защитит молекулу тафтсина от биодеградации и пролонгирует действие пептида. Установлено, что комплекс обладает аналогичным действием на продукцию супероксидного радикала по сравнению со свободным тафтсином как in vitro, так и in vivo. Кукурбит[7]урил не влиял на способность клеток продуцировать супероксидный радикал.
Ключевые слова: кукурбит[7]урил, тафтсин, пептиды, иммуномодулятор, супероксидный радикал, комплексообразование.
Тетрапептид тафтсин представляет собой естественный иммуномодулятор, способный стимулировать фагоцитоз и образование активных форм кислорода нейтрофилами и макрофагами [4, 11]. Однако время действия тафтсина в организме невелико, поскольку он неустойчив к действию некоторых внутренних факторов. В качестве одного из способов защиты пептида от биодеградации можно применять комплексообразование целевых молекул по типу «гость - хозяин». Известно, что такое комплексообразование пептида с наноразмерным кавитандом кукур-бит[7]урилом способно защитить белок от действия пептидаз [10]. Кукурбит[7]урил проявляет низкую токсичность в экспериментах как in vitro, так и in vivo [13], что позволяет использовать его при работе с культурами клеток и лабораторны-
ми животными. Ранее нами определена константа связывания кукурбит[7]урила с тафтсином, составившая (2,1 ± 0,4) х 103 М-1, и изучено влияние комплекса на пролиферативную активность клеток и продукцию цитокинов [3]. Результаты этих исследований показали, что комплекс обладает более выраженным стимулирующим действием на продукцию у-интерферона по сравнению со свободным препаратом, что, возможно, указывает на защиту кукурбит[7]урилом молекулы тафтсина от гидратации различного рода пептидазами.
В связи с этим нам представляется возможным и оправданным дальнейшее изучение влияния тафтсина в комплексе с кукурбит[7]урилом на функциональную активность иммунокомпе-тентных клеток, и в первую очередь на продук-
Пашкина Е.А. - младший научный сотрудник лаборатории клинической иммунопатологии, e-mail:pashkina.e.a@ya.ru
Любимов Г.Ю. - к.м.н., научный сотрудник лаборатории регуляции иммунопоэза, e-mail: glubimov@rambler.ru
Гришина Л.В. - к.б.н., научный сотрудник лаборатории клинической иммунопатологии, e-mail: l_grishina@bk.ru
Герасько О.А. - д.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории химии кластерных и супрамолекулярных соединений, e-mail: olager@niic.nsc.ru
Якушенко Е.В. - д.м.н., научный сотрудник лаборатории регуляции иммунопоэза, e-mail: e-yakushenko@mail.ru
Козлов В.А. - д.м.н., проф., академик РАН, директор, e-mail: niiki01@online.nsk.su
цию фагоцитами активных форм кислорода, поскольку уже известно, что тафтсин и его аналоги способны повышать генерацию супероксидного радикала вышеупомянутыми клетками [8, 12].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использованы мыши-самцы гибриды F1 (CBA*C57Bl/6) в возрасте 2 мес., полученные из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск). Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей (Страсбург, 1986).
Для получения перитонеальных элиситиро-ванных нейтрофилов и макрофагов для дальнейшего их исследования внутрибрюшинно вводили 1 мл 10%-го стерильного пептона. Через 3 ч мышь умерщвляли декапитацией и из брюшной полости 10 мл холодной среды RPMI-1640 вымывали перитонеальные нейтрофилы, аналогичным образом через 96 ч после введения пептона выделяли перитонеальные макрофаги. Клетки культивировали в С02-инкубаторе (5 % CO2, 37 °С) в 96-луночных планшетах (Costar®, США) в среде RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», Россия), содержащей 0,3 % L-глутамина, 5 мМ HEPES-буфера, 4 % гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки крови эмбрионов коров (ООО «БиолоТ», Россия) в концентрации 2 млн/мл в течение 1 ч (нейтрофилы) либо 1 млн/мл в течение 4 ч (макрофаги). Культивирование проводили в присутствии комплекса кукурбит[7]урила (синтезирован в Институте неорганической химии СО РАН, Новосибирск) с тафтсином («НПФ ВЕРТА») (0,5 мМ кукурбит[7]урила и 1 мкг/мл тафтсина), в качестве контроля использовались клетки, культивированные со свободными кукурбит[7]ури-лом и тафтсином в тех же концентрациях, а также интактные клетки.
В эксперименте in vivo для внутрибрюшин-ного введения использовались растворы кукур-бит[7]урила (синтезирован в ФГБУ Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН, Новосибирск) и тафтсина («НПФ ВЕРТА») в фосфатно-солевом буфере («Биолот»). Животные были разделены на группы по 8-10 мышей, которым внутрибрюшинно трехкратно в течение недели проводили инъекции: первой группе -комплекс тафтсина с кукурбит[7]урилом (25 мкг тафтсина в 0,25 мл 4М раствора кукурбит[7]ури-ла), второй - 25 мкг тафтсина в 0,25 мл буфера, третьей - 0,25 мл 4М раствора кукурбит[7]урила, четвертой - 0,25 мл фосфатно-солевого буфера.
Резидентные перитонеальные макрофаги, получаемые для оценки клеточности после инъекций препаратами и исследования продукции супероксидного радикала in vivo, выделяли вымыванием 10 мл холодной среды RPMI-1640 без предварительного введения в брюшную полость какого-либо дополнительного препарата. Культивирование проводили в течение часа в 24-лу-ночных планшетах в концентрации 2 х 106 клеток на лунку с использованием культуральной среды RPMI-1640, содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров и 0,3 % L-глутамина.
Продукцию супероксидного радикала оценивали с помощью модифицированного нами спектрофотометрического метода определения восстановления р-нитросинего тетразолия (НСТ) до формазана [1, 5]. Клетки дважды промывали бесцветным раствором фосфатно-солевого буфера с 0,1%-м содержанием глюкозы. К отмытому монослою клеток добавляли 0,5 мл раствора фос-фатно-солевого буфера с 0,1%-м содержанием глюкозы с добавлением 2 мг/мл зимозана (Олайн-ский завод биопрепаратов), предварительно оп-сонизированного сывороткой мышей, и 1 мг/мл НСТ («Диа-М»). Планшет с пробами термостати-ровали при 37 °С в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением в лунки 50 мкл 5N HCl, надосадочную жидкость декантировали и гранулы формазана растворяли в 0,5 мл диметил-сульфоксида («Panreac», Италия). Оптическую плотность измеряли на мультимодальном планшетном ридере («Berthold Technologies», США) при длине волны 540 нм. Результаты выражали в условных единицах оптической плотности.
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя медиану (Me), 25-ю и 75-ю процентиль (LQ, HQ), и представляли в виде Me (LQ, HQ). Различия между группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна - Уитни, достоверными считали результаты прир < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Обнаружено, что комплекс тафтсина с кукур-бит[7]урилом, так же как и свободный пептид, в экспериментах in vitro достоверно повышает продукцию супероксидного радикала как нейтрофи-лами, так и макрофагами (см. таблицу). Достоверных различий между действием свободного пептида и комплекса не обнаружилось. Возможно, это связано с отсутствием разрушающих пептид ферментов в культуральной среде и коротким временем культивирования, недостаточным для ферментной биодеградации молекул свободного пептида внутриклеточными протеазами. Важно,
Таблица
Продукция супероксидного анион-радикала перитонеальными фагоцитами (усл. ед.) под действием кукурбит[7]урила и тафтсина
Группа Нейтрофилы (in vitro), n = 8 Макрофаги (in vitro), n = 14 Макрофаги (in vivo), n = 18
Контроль 0,269 (0,209-0,282) 0,450 (0,409-0,524) 0,204 (0,150-0,240) 1
Кукурбит[7]урил 0,258 (0,238-0,285) 0,496 (0,451-0,558) 0,251 (0,167 -0,291) 2
Тафтсин 0,363 (0,349-0,415) 0,649 (0,636-0,679) * 0,285 (0,257-0,305) *
Комплекс 0,388 (0,377-0,416) 0,611 (0,605-0,677) * 0,241 (0,208-0,305) *
Примечание. 1 - п = 16, 2 - п = 11; * - отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо прир < 0,05.
что сам кукурбит[7]урил не вызывает достоверных изменений в продукции супероксидного радикала.
Сходная картина наблюдалась и при действии комплекса кукурбит[7]урила с тафтсином в экспериментах in vivo, когда его внутрибрюшин-но вводили лабораторным животным. В данном случае у мышей наблюдалась повышенная продукция супероксидного радикала резидентными перитонеальными макрофагами относительно контрольной группы (см. таблицу). Введение свободного тафтсина также увеличивало интенсивность восстановления НСТ относительно контроля, что соответствует уже известным данным о влиянии тафтсина на макрофаги in vivo [7]. Достоверных различий в продукции супероксидного радикала после введения комплекса и свободного пептида не наблюдалось. Кукурбит[7]урил при внутрибрюшинном введении, так же как и в исследовании in vitro, не влиял на способность клеток восстанавливать НСТ.
Следовательно, тафтсин в комплексе c кукур-бит[7]урилом, как и свободный пептид, способен оказывать влияние на функциональную активность перитонеальных макрофагов и нейтрофи-лов, увеличивая продукцию ими супероксидного радикала. В этой работе нами впервые показано, что полученный комплекс обладает действием in vivo, и связывание тафтсина с кукурбит[7]урилом не снижает его биологической эффективности. Изначально предполагалось, что исследуемый комплекс будет активнее влиять на продукцию супероксидного радикала в связи с пролонгированием стимулирующего действия тафтсина. Однако ожидаемого эффекта получено не было, что, вероятно, связано с тем, что комплекс в эксперименте in vivo может поддерживать постепенное высвобождение превышенного количества пептида, вследствие чего не способен усилить стимуляцию продукции супероксидного радикала из-за превышения максимально эффективной дозы пептида. Возможно, различие между действием
свободного пептида и комплекса следует изучать в рамках иной экспериментальной модели.
Известно, что увеличение продукции активных форм кислорода опосредует бактерицидный механизм фагоцитирующих клеток. Свободный пептид тафтсин, согласно литературным данным, также обладает антибактериальной активностью [9]. Следовательно, можно предположить, что комплекс будет повышать способность фагоцитирующих клеток противостоять бактериям, а возможно, и другим патогенам, повышая бактерицидную активность клеток.
В отдельной серии экспериментов мы исследовали влияние комплекса тафтсина с кукур-бит[7]урилом на показатели клеточности перито-неального экссудата мышей с целью исследовать возможность тафтсина привлекать клетки макро-фагального ряда в очаг воспаления дополнительно к резидентным макрофагам. При воспалении или стимуляции иммунитета в очаг воспаления мигрируют моноциты с фенотипом, отличным от фенотипа резидентных макрофагов [2]. На сегодняшний день считается, что основная функция резидентных макрофагов - гомеостатическая и регуляторная, в противовес к макрофагам воспаления, играющим роль эффекторных клеток в воспалительных процессах.
Клеточность перитонеального экссудата в контрольной группе мышей после инъекции фос-фатно-солевым буфером находилось в пределах 0,85-3 млн клеток от одного животного (медиана 1,39; 25-75 процентили 1,22-2,18), в то время как в группе, получавшей внутрибрюшинные инъекции тафтсина, клеточность достоверно была выше и составляла 0,55-6 млн клеток (медиана 2,40; 25-75 процентили 2,00-3,90). Внутрибрю-шинное введение комплекса также достоверно повышало клеточность перитонеального экссудата, разброс от минимального до максимального значения 1,44-4,55 млн клеток (медиана 2,97; 25-75 процентили 1,96-3,45). В группе мышей, получавших кукурбит[7]урил, клеточность со-
ставила от 0,625 до 4,5 млн (медиана 2,40; 25-75 процентили 2,10-3,22), достоверных различий по сравнению с контролем не наблюдалось, однако прослеживалась тенденция к увеличению числа клеток в перитонеальном экссудате. Полученные результаты говорят о том, что комплекс, как и свободный тафтсин, увеличивает число привлекаемых воспалительных клеток, преимущественно состоящих из макрофагов и нейтрофилов, в брюшной полости, что соответствует литературным данным о влиянии иммуностимулирующего пептида тафтсина на миграцию и хемотаксис [6]. Соответственно, усиление in vivo продукции активных форм кислорода выделенными нами перитонеальными макрофагами может быть вызвано усиленной тафтсином миграцией воспалительных макрофагов, обладающей более выраженной фагоцитарной активностью по сравнению с резидентными макрофагами.
Однако результаты in vitro показывают, что при условиях, когда препараты вносятся после выделения клеток, а значит, нет гетерогенности клеточного пула, вызванной разными условиями для миграции, все же наблюдаются достоверные различия по продукции супероксидного радикала между интактными клетками и клетками, инкубированными в присутствии тафтсина либо комплекса тафтсина с кукурбит[7]урилом. Соответственно, полученные in vivo результаты по продукции супероксидного радикала отражают оба явления, происходящие вследствие влияния свободного пептида либо его комплекса - и повышение гетерогенности клеточного пула, и стимуляцию внутриклеточных процессов данными препаратами. Сравнительная оценка вклада данных явлений требует дополнительных исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Кукурбит[7]урил не влияет на способность клеток продуцировать супероксидный радикал. Комплексообразование тафтсина c кукур-бит[7]урилом не изменяет способности пептида стимулировать продукцию супероксидного радикала нейтрофилами и макрофагами как in vitro, так и in vivo. Кроме того, пептид в комплексе, как и свободный тафтсин, при внутрибрюшинном введении увеличивает число фагоцитирующих клеток в перитонеальном экссудате. Таким образом, тафтсин в комплексе с кукурбит[7]урилом оказывает стимулирующее действие на функциональную активность фагоцитирующих клеток, включая повышение миграционной способности клеток и увеличение продукции супероксидно-
го радикала. Следовательно, комплекс тафтсина с кукурбит[7]урилом представляет интерес для дальнейшего исследования его иммуноактивных свойств.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Любимов Г.Ю., Зенков Н.К., Вольский Н.Н. и др. Хемилюминесценция перитонеальных макрофагов при действии макрофаг-активирующего фактора // Иммунология. 1992. (1). 40-43.
2. Оноприенко Л.В. Молекулярные механизмы регуляции активности макрофагов (обзорная статья) // Биоорган. химия. 37. (4). 437-451.
3. Пашкина Е.А., Щепотина Е.Г., Гришина Л.В. и др. Иммуноактивные свойства тафтсина при комплексообразовании его с кукурбит[7]урилом // Вестн. Уральской мед. акад. науки. 2011. (2-2). 50-51.
4. Туровецкий В.Б., Золотилин С.А., Сарыче-ва Н.Ю. и др. Влияние тафтсина на функциональную активность и внутриклеточный pH перитонеальных макрофагов мышей // Бюл. эксперим. биологии и медицины 1994. (3). 265-267.
5. Amano D., Kagosaki G., Usui T. et al. Inhibitory effects of superoxide dismutase and various other protein on the nitroblue tetrazolium reduction by pha-gocytizing guinea pig polymorphonuclear leucocyte // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. 66. 272-279.
6. Babcock G.F., Amoscato A.A., Nishioka K. Effect of tuftsin on the migration, chemotaxis, and differentiation of macrophages and granulocytes // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1983. 419. 64-74.
7. Chu D.Z., Nishioka K. Tuftsin increases survival in murine peritoneal carcinomatosis // J. Biol. Response Mod. 1990. 9. 264-267.
8. Dagan S., Gottlieb P., Tzehoval E. et al. Tuftsin analogues: synthesis, structure-function relationships, and implications for specificity of tuftsin's bioactivity // J. Med. Chem. 1986. 9. 1961-1962.
9. Fridkin M., Gottlieb P. Tuftsin. Thr-Lys-Pro-Arg. Anatomy of an immunologically active peptide // Mol. Cell. Biochem. 1981. 41. 73-97.
10. Hennig A., Ghale G., Nau W.M. Effects of cucurbit[7]uril on enzymatic activity // Chem. Commun. 2007. (16). 1614-1616.
11. Najjar V.A. Tuftsin, a natural activator of phagocyte cells: an overview // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1983. 419. 1-11.
12. Spirer Z., Zakuth V., Golander A. et al. The effect of Tuftsin on the nitrous blue tetrazolium reduction of normal human polymorphonuclear leukocytes // J. Clin. Invest. 1975. 55. 198-200.
13. Uzunova V. D., Cullinane C., Brix K. et al. Toxicity of cucurbit[7]uril and cucurbit[8]uril: an exploratory in vitro and in vivo study // Org. Biomol. Chem. 2010. 8. 2037-2042.
EFFECT OF PEPTIDE TUFTSIN COMPLEX WITH CUCURBIT[7]URIL ON SUPEROXIDE ANION IN VITRO AND IN VIVO
Ekaterina Aleksandrovna PASHKINA1 Gennady Yurevich LYUBIMOV1,
Lyubov Viktorovna GRISHINA1, Olga Anatolevna GERASKO2,
Elena Vladimirovna YAKUSHENKO1, Vladimir Aleksandrovich KOZLOV1
1 Institute of Clinical Immunology of SB RAMS 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14
2 Institute of Inorganic Chemistry n.a. A.V. Nikolaev of SB RAS 630090, Novosibirsk, Akademik Lavrentyev av., 3
This paper considers the influence of the immunomodulator taftsin complexed with cucurbit[7]uril on superoxide production by phagocytes. It was assumed that the molecule taftsin complexing protects against biodegradation and prolongs the effect of the peptide. It has been established that the complex has a similar effect on the superoxide production compared to the free taftsin as in vitro, and in vivo. Cucurbit[7]uril did not affect the ability of cells to produce superoxide radical.
Key words: cucurbit [7] uril, taftsin, peptides, immunomodulator, superoxide radical, complexation.
Pashkina E.A. - junior researcher of laboratory of clinical immunopathology, e-mail: pashkina.e.a@ya.ru Lyubimov G.Yu. - candidate of medical sciences, researcher of laboratory of immunopoiesis regulation, e-mail: glubimov@rambler.ru
Grishina L.V. - candidate of biological sciences, researcher of laboratory of clinical immunopathology, e-mail: l_grishina@bk.ru
Gerasko O.A. - doctor of chemical sciences, leading researcher of laboratory of clusters and supramolecular compounds, e-mail: olager@niic.nsc.ru
Yakushenko E.A. - doctor of medical sciences, researcher of laboratory of immunopoiesis regulation e-mail: e-yakushenko@mail.ru
Kozlov V.A. - doctor of medical sciences, academician of RAS, e-mail: niiki01@online.nsk.su
