CC BY
19
УДК 547.82 + 577.113 + 544.147
Лебедева А.Ю., Черникова Е.Ю., Федорова О.А.
КОНКУРЕНТНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БИССТИРИЛОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ С КУКУРБИТ[7]УРИЛОМ И ДВУХЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК
Лебедева Анна Юрьевна, инженер-исследователь, аспирант лаборатории фотоактивных супрамолекулярных систем №107 ИНЭОС РАН им. А. Н. Несмеянова, e-mail: annabell_li@mail.ru;
Черникова Екатерина Юрьевна к.х.н, н.с. лаборатории фотоактивных супрамолекулярных систем №107 ИНЭОС РАН им. А.Н. Несмеянова;
Федорова Ольга Анатольевна д.х.н., профессор РХТУ им. Д.И. Менделеева, заведующий лабораторией фотоактивных супрамолекулярных систем ИНЭОС РАН им. А.Н. Несмеянова. Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, Россия 119991, Москва, ул. Вавилова д. 28
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская площадь, д. 9
В данной работе изучено образование супрамолекулярных комплексов дибензо- и диаза-18-краун-6-содержащих бисстириловых красителей с кукурбит[7]урилом и двухцепочечной ДНК тимуса теленка в буферном растворе. Проведено исследование конкурентных взаимодействий в тройной системе ДНК-краситель-кукурбит[7]урил. Изучение процессов комплексообразования проводилось с помощью методов спектрофотометрического и флуориметрического титрований.
Ключевые слова: бисстириловые красители, кукурбитурилы, ДНК, комплексообразование, оптическая спектроскопия.
COMPETITIVE INTERACTION BETWEEN BIS(STYRYL) DYES, DOUBLE-STRANDED DNA AND CUCURBIT [7]URIL
Lebedeva A.Yu.1, Chernikova E.Yu.1, Fedorova O.A.1, 2
1 A. N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds of RAS, Moscow, Russia.
2 D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
In this study the formation of supramolecular «guest-host» complexes bis(styryl) dyes based on di(benzo)- or di(phenilaza)-18-crown-6 ether with cucurbit[7]uril and double-stranded calf thymus DNA in buffer was investigated. A study of competitive interactions in the ternary DNA-bis(styryl)dye-cucurbit[7]uril system was carried out. A complex formation was studied by using spectrophotometric and fluorometric titrations.
Key words: bis(styryl) dyes, cucurbituril, DNA, complex formation, optical spectroscopy.
Изучение закономерностей взаимодействия органических молекул с ДНК представляет значительный интерес с точки зрения медицины и биологических исследований. Подобные
исследования помогают понять механизм действия лекарственных препаратов, а также способствуют созданию широкого круга флуоресцентных маркеров для визуализации биологических объектов в методах флуоресцентной микроскопии, гель-электрофореза, цитометрии и др. На сегодняшний день стириловые красители нашли широкое применение в качестве чувствительных зондов для неспецифичного флуоресцентного окрашивания белков в гелях [1]. Кроме того, благодаря значительному разгоранию флуоресценции красителей при связывании с ДНК и способности проникать в клетку, эти соединения были предложены для внутриклеточной визуализации ДНК [1]. Таким образом, получение стириловых красителей, способных направленно связываться с ДНК, является актуальной задачей.
Ранее нами были получены и охарактеризованы бисстириловые красители, содержащие фрагмент
дибензо- или диаза-18-краун-6-эфира (Схема 1). Положительно заряженные гетероароматические фрагменты в красителях могут обеспечивать координацию с ДНК. Для оценки связывания красителей 1 и 2 с двухцепочечной ДНК тимуса теленка в буферном растворе рН = 7 нами были проведены исследования с использованием методов оптической спектроскопии. В спектрах поглощения красителей при добавлении небольшого количества ДНК наблюдалось понижение оптической плотности, а при избытке ДНК - батохромный сдвиг и восстановление оптической плотности (Рис.1а). При флуориметрическом титровании красителя 1 также при недостатке ДНК наблюдается тушение флуоресценции, а при избытке ДНК - разгорание флуоресценции в 5 раз. В случае красителя 2 при небольшом количестве ДНК флуоресценция меняется мало, а при избытке происходит разгорание в 8 раз (Рис. 1б). Наблюдаемые спектральные изменения указывают на то, что данные красители связываются с ДНК. При недостатке ДНК и при большом избытке наблюдаются различные модели связывания.
сю4
сю4
сю*
2
Схема 1
600 630
Длина волны, нм Длина волны, им
Рис.1. Спектрофотометрическое титрование красителя 1 в буфере(а): 1 - спектр поглоения свободного красителя, 2 - спектр красителя в присутствии 0,5 экв. ДНК, 3 - спектр красителя в присутствии 92 экв. ДНК; флуориметрическое титрование красителя 2 при Хех = 503 нм в буфере (б): 1 - спектр флуоресценции свободного красителя, 2 - спектр
флуоресценции красителя в присутствии 44 экв. ДНК.
Кукурбит[п]урилы (СВ[7]) - органические макроциклические кавитанды состава (С6Н6К402)п, построенные из нескольких (5<п<10) гликольурильных фрагментов, соединенных через метиленовые мостики. Такие молекулы-контейнеры привлекают внимание исследователей с целью разработки средств направленной доставки лекарственных препаратов. Они обеспечивают пролонгированное действие лекарственных средств, улучшают их растворимость, защищают от биодеградации и снижают токсический эффект [2]. Положительно заряженные стириловые красители способны взаимодействовать с СВ[п] посредством ион-дипольных и гидрофобных взаимодействий. Для исследования были выбраны кукурбитурилы с семью гликольурильными фрагментами, так как такой размер полости является подходящим для связывания стирилпиридинов. Ранее комплексы гость-хозяин бисстириловых красителей 1-2 с СВ[7] были исследованы в водном растворе [3]. В настоящей работе процесс комплексообразования был изучен в фосфатном буфере при рН=7 с помощью спектрофотометрического и
флуориметрического титрований. Добавление
аликвот раствора СВ[7] к раствору красителей приводит к уменьшению интенсивности максимума длинноволновой полосы поглощения лиганда и значительному смещению в область больших длин волн (ДХтах = 30 нм для красителя 1 и ДА1пах = 33 нм для красителя 2), что свидетельствует об образовании комплексов включения (Рис. 1а). Батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения объясняется отрицательным
сольватохромным эффектом при переходе молекул лигандов из более полярного окружения в менее полярную полость кукурбитурила. Обработка данных спектрофотометрического титрования показала наличие в растворе двух видов инклюзивных комплексов состава кукурбитурил-краситель 1:1 (к^Кц = 6,55 ± 0,30) и 2:1 (к^К21 = 10,76 ± 0,31) для красителя 1. Для красителя 2 точно рассчитать устойчивость комплексов не удалось,
поскольку их logKl
7. Флуориметрическое
титрование бисстириловых красителей раствором СВ[7] приводит в разгоранию флуоресценции красителей: в 16 раз для красителя 1и 330 раз в случае красителя 2 (Рис. 2б).
>
Рис.2. Спектрофотометрическое титрование красителя 1 СВ[7] в буфере (а), флуориметрическое титрование
красителя 2 СВ[7] при Хех = 458 нм в буфере (б).
В литературе представлено мало примеров, изучающих тройную систему краситель - ДНК -СВ[7], однако такие исследования могут быть полезны для улучшения чувствительности флуоресцентных маркеров [4]. Благодаря большему сродству красителя к СВ[7], чем к ДНК, становится возможно вытеснить краситель из комплекса с нуклеиновой кислотой в полость молекулы-контейнера. Данный процесс контролировался с
помощью оптических исследований. К буферному раствору красителя в присутствии 10-кратного избытка ДНК добавляли аликвоты раствора СВ[7], что приводило к батохромному сдвигу максимума полосы поглощения в направлении полосы соответствующей комплексу красителя с СВ[7] (Рис. 3). Данный процесс был также подтвержден спектрами флуоресценции.
Рис.3. Спектрофотометрическое титрование красителя 1 в присутствии 10 экв. ДНК СВ[7] в буфере (а), спектрофотометрическое титрование красителя 2 в присутствии 10 экв. ДНК СВ[7] в буфере (б).
Таким образом, в данной работе были исследованы комплексы бисстириловых
краунсодержащих красителей с ДНК тимуса теленка, а так же с молекулами-контейнерами кукурбит[7]урилами. Так же было показано, что систему краситель - ДНК можно разрушить при добавлении раствора CB[7]. Наблюдаемый эффект можно объяснить предпочтительным связыванием красителя с CB[7].
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-33-00748 мол а.
Список литературы
1. Akbay N. et al. The Mechanism of Benzothiazole Styrylcyanine Dyes Binding with dsDNA: Studies by Spectral-Luminescent Methods // J Fluoresc. - 2008. -Vol. 18. - P. 139 - 147.
2. Лебедева А. Ю., Ткаченко C. В., Черникова Е. Ю. и др. Исследование спектральных и комплексообразующих свойств краун-содержащего бисстирилового красителя с молекулами-контейнерами // Успехи в химии и химической технологии. - 2016. - Т. XXX, №11. - С. 36 - 38.
3. Ткаченко С.В., Ощепков М.С., Цветкова О.И. и др. Исследование комплексообразующих свойств краунсодержащих бисстириловых красителей в присутствии молекул-хозяев: циклодекстрина и кукурбитурила. // Успехи в химии и химической технологии. - Т. XXVII, №2 (142). - 2013. - С. 75 -81.
4. Shiguo Sun,Ye Yuan, Zhiyong Li, Si Zhang et al. Interaction of a hemicyanine dye and its derivative with DNA and cucurbit[7]uril // New J. Chem. - 2014. - Vol. 38. - P. 3600 - 3605.
