CC BY
29
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ТАТ, пептид VP22 и др. В литературе имеются данные, что некоторые пептиды системы врожденного иммунитета, в частности антимикробные пептиды нейтрофильных гранулоцитов человека и животных, тоже обладают свойствами СРР и могут рассматриваться как перспективные прототипы средств доставки противоопухолевых соединений в неопластические клетки.
Цель. Изучение интернализации пролин-богатых пептидов, несущих флуоресцентную метку, в клетки человека в культуре. Объектом исследования служили синтетические аналоги пептидов семейства бактенеци-нов и их структурные модификации: минибактенецин miniChBac7.5Na, пептиды, представляющие собой фрагменты молекулы бактенецина ChBac5 — ChBac5 20-43 и ChBac5 7-22, бактенецин ChBac3.4 и его структурная модификация ChBac3.4-m. Для сравнения использовали пептид, относящийся к группе СРР — ТАТ (фрагмент кап-сидного белка вируса иммунодефицита человека, производства фирмы Sigma, США).
Материалы и методы. Исследуемые бактенецины получали путем твердофазного пептидного синтеза на приборе Symphony X (Protein Technologies, США). Осуществляли конъюгацию пептидов с флуоресцентным красителем BODIPY FL (Invitrogen, США), как описано (Шамова и соавт., 2007). Меченые пептиды очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проникновение меченых пептидов в клетки К-562 (эритро-миелоидная лейкемия человека), ТНР-1 (моноцитарная лейкемия человека), мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) здоровых доноров in vitro количественно оценивали с помощью проточной цитоф-луориметрии по увеличению величины сигнала зелёной флуоресценции (BODIPY FL, Ex/Em 503/512) на приборе Navios™ (Beckman Coulter, США).
Результаты. Меченые пептиды в концентрации 0,2 мкМ инкубировали с клетками (100 000 клеток в 100 мкл среды RPMI 1640) в течение 60 мин при 37 °С, затем клетки осаждали центрифугированием и отмывали от избытка несвязавшегося пептида, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере и анализировали на проточном цитофлуориметре. Перед измерением в пробы вносили раствор трипанового синего до конечной концентрации 40 мкг/мл, который служил в качестве «гасителя» флуоресценции BODIPY FL, так как, не проникая внутрь живых клеток, элиминировал сигнал от меченых пептидов, находящихся на поверхности клеток-мишеней. Установлено, что все исследуемые пептиды, несущие флуоресцентную метку, детектируются в клетках. Анализ показателей, характеризующих интенсивность флуоресценции, измеренной для трех типов клеток, обработанных пептидами, показал, что более эффективно все пептиды проникают в клетки К-562 и ТНР-1 по сравнению с МКПК здоровых доноров. Показатели, полученные для бактенецинов, были сравнимы или превышали таковые, полученные для пептида ТАТ (например, для пептида ChBac5 20-43 (0.2 мкМ) показатели интенсивности флуоресценции, выраженные в относительных единицах (отн. ед-цы), в случае клеток К-562 составили 10,1+2,32, клеток ТНР-1 - 65,3+13,4, МКПК - 5,76+2,2 отн. ед-ц; в то время как соответствующие показатели для пептида ТАТ (0,2 мкМ) составили 1,9+0,08, 4,1+1,2 и 1,26+0,07 отн. ед-ц). При этом наиболее выраженную способность проникать в исследуемые опухолевые клетки продемонстрировали пептиды ChBac5 20-43 и ChBac3.4-m.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемые пролин-богатые пептиды обладают свойствами проникающих в клетки пептидов (CPP) и могут рассматриваться как прототипы соединений-переносчиков лекарственных средств в опухолевые клетки.
Работа поддержана грантом РФФИ № 17-04-02177а.
ВЛИЯНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БАКТЕРИЙ НА ИММУНОТОКСИЧНОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Нежинская Г.И.1, Ермоленко Е.И.1, 2, Евдокимова Н.Р. 1, Шабанов П.Г.1, Даниленко В.Н.3, Суворов А.Н.1, 2
1ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Ростя
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Ростя
3 ФГБУ«Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова», Москва, Ростя
Пробиотики, созданные на основе одного или нескольких штаммов бактерий (чаще всего лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков) оказывают влияние на микробиоту и практические все системы организма. Иммуномодулирующие действие пробиотических препаратов является одним из наиболее значимых для терапии и профилактики различных заболеваний, затрагивающих пищеварительную, нервную эндокринную и сердечнососудистую системы. Однако до сих пор остается малоизученной иммунотоксичность рассматриваемых препаратов.
Целью исследования являлось определение летальной дозы и иммунотоксического действия различных доз препарата М, включающего смесь пробиотических штаммов Enterococcus faecium L3, Lactobacillus rhamnosus K32, Bifidobacterium longum GT15 в реакциях гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), антителоо-бразования в селезенке (АОК) и оценки активности перитониальных макрофагов. В работе использовали мышей-самцов линии BALB/c (n = 90) и беспородных белых мышей (п = 120). Исследование разрабатываемой лекарственной формы M на острую токсичность показало, что LD50 составляет 2 х 109 КОЕ/мышь, а терапевтическая доза (1/100 LD50) — 2 х 107 КОЕ/мышь. В связи с данными результатами при исследовании иммунотоксичности были взяты дозы — 2 х 107 и 2 х 108 КОЕ/мышь. Препарат М вводили внутрижелудочно в соответствии с предполагаемым способом его применения в клинике (per os). Контрольные животные получали по 0,3 мл плацебо (0,9%-ный раствор NaCl). В качестве препарата сравнения использовали Линекс (Lek®, Словения), содержащий L. acidophilus, B. infantis, E. faecium в дозе 5 х 107 КОЕ/мышь. Изучение влияния М на иммунитет было проведено в соответствии с ранее предложенными рекомендациями (Миронов А.Н. и соавт., 2013). Было показано, что пробиотик М в высокой дозе (2 х 108 КОЕ/мышь), но не в терапевтической, увеличивал (через 3, 6 и 24 ч) интенсивность ГЗТ, по сравнению с контролем (введением эритроцитов барана, р < 0,001, n = 10). Применение терапевтической дозы М стимулировало образование АОК в селезенке мышей (p < 0,05, n = 10), а использование высокой дозы существенно супрессировало его (р < 0,001, n = 10). Оценка модуляции ответа АОК при введении М и Линекса с оче-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
видностью демонстрировало, что индекс модуляции при применении M в дозе 108 КОЕ/ мышь и Линекса 5 х 107 КОЕ/мышь определялся со знаком «—», свидетельствуя о токсическом действии этих препаратов и необходимости ограничения их дозы. В отношении действия на фагоцитоз макрофагов, подтверждалось, что M в дозе 2 х 107 КОЕ/мышь, эффективно увеличивает концентрацию макрофагов в перитонеальном экссудате и их поглотительную активность (p < 0,001). Показано, что M в дозе 107 M существенно превосходил влияние Линекса на фагоцитарную активность макрофагов (p < 0,001). Однако высокая доза (2 х 108 КОЕ/мышь) М приводило к снижению фагоцитарного индекса.
Таким образом, разрабатываемый препарат М, в состав которого входят штаммы E. faecium L3, L. rhamnosus K32, B. longum GT15, в дозе 107 КОЕ/мышь, не нарушает функционирование иммунной системы, а по стимуляции фагоцитарной активности превосходит Линекс. При включении пробиотиков в схемы таргетной терапии различных заболеваний нужно учитывать, что дозы препаратов могут существенно влиять на реализации важных функции иммунной системы.
ВОЗДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТА ФОСПРЕНИЛ НА ПОЛЯРИЗАЦИЮ ИММУННОГО ОТВЕТА, ОБУСЛОВЛЕННУЮ CagA+ ФРАГМЕНТОМ ХРОМОСОМЫ HELICOBACTER PYLORI
Николаева Т.Н., Козлов В.В., Григорьева Е.А., Белый Ю.Ф., Пронин А.В.
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Иммунные механизмы являются ключевыми в формировании Helicobacter pylori (Н.р), ассоциированной га-стродуоденальной патологии.
Функциональные белки CagA M.M.120-145-kDa, кодируемые островком патогенности сagA(cagPAI) в 40kb, интегрированным в хромосому Н.р., воздействуют на множественные сигнальные пути, которые регулируют естественный клеточный иммунитет, в том числе Th-клетки. С CagA ассоциировано смещение поляризации иммунного ответа с Th1 на Th2 с параллельным возрастанием активности регуляторных T-клеток и прогрессией тяжелых форм поражения желудка вплоть до аде-номокарциномы. При инфекции, вызванной CagA- Н.р., такого смещения не наблюдается.
В связи с этим актуален поиск путей иммунокор-рекции естественного и адаптивного иммунитета при хеликобактериозе. Фоспренил (ФП) относится к фос-фориллированным полиизоприноидам, которые являются интегральными компонентами мембран всех живых клеток, где выполняют функции промежуточных акцепторов сахаров (в частности маннозы) при биосинтезе гликопротеинов. Ранее было показано, что препарат способен подавлять взаимодействие IL-2 с CD25 и, таким образом, препятствовать активации ре-гуляторных Т-клеток. В связи с этим цель настоящего исследования состояла в изучении действие препарата ФП на иммунный ответ экспериментальных животных, инфицированных живыми бактериями генетически родственных штаммов E. coli BL21, отличающихся наличием островка cagA H.pylori.
Материалы и методы. бактерии генетически родственных штаммов живых бактерий E. coli BL21p119(CagA+) и E. coli BL21рЕТ-28с (CagA-). Мышам интрагастрально через металлический зонд вводили живые бактерии изученных штаммов в количестве 5 х 109 КОЕ/0,5 мл. Клеточные иммунные реакции оценивали по уровню пролиферации спленоцитов в реакции бласттрансформации (РБТЛ), цитотоксической активности ЕК-клеток селезенки, синтезу цитокинов методом ELISA. Анализ экспрессии поверхностных антигенов на мононуклеарных лимфоцитах селезенки проводили методом проточной цитофлуорометрии с использованием моноклональных антител анти-CDi-FITC, CD4-PE-Cy7, CD8-APC (BD Biosciences, USA). Образцы анализировали на проточном цитофлуориме-тре BD FACS CantoII (BD Biosciences, USA).
Результаты. Введение животным E. coli CagA+ уже через сутки сопровождается резким усилением про-лиферативной активности спленоцитов, чего не наблюдается после заражения изогенным CagA- штаммом E. coli BL21. Предварительное введение животным ФП за 3 часа до заражения нивелирует различия между штаммами. При этом ФП усиливал активацию естественных киллеров у мышей, зараженных штаммом E. coli BL21p119 (CagA+), значительно сильнее, чем у животных зараженных штаммом, не продуцирующим CagA белки (Р < 0,05).
Методом проточной цитофлуориметрии показано, что ФП сильнее снижает число CD3+CD4+T клеток у мышей, инфицированных CagA+ по сравнению с мышами, инфицированными CagA- мутантом и подавляет продукцию IL-2 Т-клетками, оставляя неизменным соотношение IFNy, IL-4 и IL-10, что свидетельствует об ингибиру-ющем воздействии ФП на регуляторные T-клетки.
Таким образом, ФП, подавляя активность регуляторных Т-клеток, может препятствовать поляризации иммунного ответа с Th1 на Th2, связанной с активностью CagA.
ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ НА ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ IN VITRO
Пазина Т.Ю.1, Артамонов А.Ю.1, Орлов Д.СЛ 2, Филатенкова Т.А., Шамова О.В.1, 2
1ФГБНУ«Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Нейтрофилы, циркулирующие в периферической крови и мигрирующие в очаги развития патологических процессов, способны посредством биологических активных молекул модулировать иммунный ответ, а именно влиять на функцию цитотоксических Т- и ЕК-клеток. Роль нейтрофильных гранулоцитов в опухолеобразова-нии неоднозначна, так как секретируемые этими клетками факторы могут, как стимулировать опухолевый рост, так и способствовать его ограничению. Известно, что катионные пептиды (АМП) нейтрофилов, проявляющие антимикробные свойства, обладают также и противоопухолевой активностью.
