CC BY
54
УДК 577.112; 577.181
Мини-бактенецины ChBac7.5N а и ChBac7.5N ß - антимикробные пептиды из лейкоцитов козы Capra hircus
О. В. Шамова1,3, Д. С. Орлов1,3, М. С. Жаркова1, С. В. Баландин2, Е. В. Ямщикова1, Д. Кнаппе4, Р. Хоффманн4, В. Н. Кокряков1,3, Т. В. Овчинникова2*
1Институт экспериментальной медицины, 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
3Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9
4Leipzig University, Deutscher Platz 5, D-04103 Leipzig, Germany
*E-mail: ovch@ibch.ru
Поступила в редакцию 10.11.2015
Принята к печати 10.03.2016
РЕФЕРАТ Антимикробные пептиды (АМП) нейтрофилов играют важную роль в осуществлении защитных функций организма человека и животных. Из лейкоцитов домашней козы Capra hircus нами выделены два пептида (средние молекулярные массы 2895.5 и 2739.3 Да), обладающие высокой антимикробной активностью и представляющие собой N-концевые фрагменты (1-22 и 1-21) пролин-богатого пептида бак-тенецина 7.5 козы, структура гена которого представлена в базах данных, но соответствующий белковый продукт до настоящего времени не был выделен. Полученные АМП названы мини-бактенецинами (mini-ChBac7.5Na и mini-ChBac7.5Nß) по аналогии с описанным ранее С-концевым фрагментом бактенецина 7.5, выделенным из лейкоцитов овцы [Anderson, Yu, 2003]. Мини-бактенецины козы в концентрации 0.5-4 мкМ проявляют высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных бактерий, включая устойчивые к ряду применяемых в медицине антибиотиков штаммы Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii, а также некоторых штаммов грамположительных бактерий (Listeria monocytogenes EGD, Micrococcus luteus). Исследуемые пептиды, как и большинство пролин-богатых АМП, оказывают антимикробное действие без существенного повреждения бактериальных мембран, обладают липополисахарид-связывающей активностью. Мини-бактенецины не токсичны по отношению к культивируемым клеткам человека, что дает основание рассматривать их как перспективные прототипы новых антибактериальных терапевтических препаратов. Обнаружение высокоактивных фрагментов антимикробного пептида в нейтрофилах козы свидетельствует в пользу гипотезы о том, что фрагментация АМП кателицидинового семейства важна для образования функционально активных молекул, в ряде случаев более активных, чем полноразмерные пептиды, и может играть значимую роль в антиинфекционной защите. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА антимикробные пептиды, кателицидины, мини-бактенецины.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АМП - антимикробные пептиды; МИК - минимальная ингибирующая концентрация; ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ПААГ - поли-акриламидный гель; ПБ-АМП - пролин-богатые антимикробные пептиды; ЭФ - электрофорез; MALDI-TOF-MS - времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбционной ионизацией; MRSA - устойчивый к метициллину золотистый стафилококк, PG-1 - протегрин 1.
ВВЕДЕНИЕ
В защите человека и животных от возбудителей инфекционных заболеваний участвуют антимикробные пептиды (АМП) - катионные молекулы, содержащиеся в лейкоцитах, клетках барьерного эпителия и некоторых других типах клеток. Кроме антимикроб-
ной активности АМП обладают и иными свойствами, в том числе иммуномодулирующими, что позволяет рассматривать эти соединения как прототипы новых антибиотических лекарственных средств комплексного действия. С этой точки зрения особый интерес представляют АМП семейства кателицидинов - об-
ширной группы пептидов, широко распространенных у позвоночных. Пептиды данного семейства образуются из белков-предшественников путем протеолитического отщепления ^концевой части (кателиноподобного домена) от С-концевого участка, представляющего собой зрелый АМП. Протеолиз происходит при активации нейтрофильных грануло-цитов и клеток барьерного эпителия при инфекционных процессах. У некоторых кателицидинов, например, кателицидина человека LL-37, процессингу подвергается и молекула зрелого АМП [1], что приводит к появлению фрагментов, каждый из которых имеет свой спектр биологических свойств, включая антибактериальную, противоопухолевую и другие виды активности. Подобное протеолитическое расщепление пептидов описано и для бактенецинов овцы [2]. Предполагается, что фрагментация зрелых АМП имеет биологический смысл, и именно эти фрагменты могут играть ключевую роль в осуществлении множественных защитных реакций [1, 2].
Из известных к настоящему времени АМП ка-телицидины животных отряда парнокопытных привлекают особое внимание благодаря высокой антимикробной активности и сочетанию свойств, делающих эти пептиды перспективными для практического применения. В число пептидов, полученных из лейкоцитов парнокопытных, входят такие АМП, как протегрины, PR-39 свиньи [3, 4]; бактенецины, ВМАР-27, -28, додекапептид, индолицидин быка [5-8]; SMAP-29 овцы [9] и др. Некоторые из этих пептидов стали объектами детальных исследований, направленных на разработку лекарственных препаратов. Интересно, что в нейтрофилах ряда парнокопытных, в том числе коз, отсутствуют АМП семейства дефенсинов [10], что свидетельствует о важной роли кателицидинов в защите этих животных от инфекций. Таким образом, изучение АМП нейтрофилов парнокопытных актуально как для возможного обнаружения новых биологически активных молекул, которые могут служить прототипами лекарственных средств, так и для развития фундаментальных представлений о роли кателицидинов в иммунитете. Целью представленной работы стал поиск и характеристика новых АМП лейкоцитов домашней козы Сарта ЫтсРанее из лейкоцитов козы нами уже были получены два пептида - бактенецины ^Вас5 и ^Вас3.4 [11, 12]. В данной работе изучены и другие АМП.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты
Использовали хлорид натрия ^9625), трис-(гидроксиметил)аминометан (Т1503), агаро-
зу (Type I, low EEO, A6013), трифторуксусную (302031) и гептафтормасляную (52411) кислоты, о-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид (N1127), МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетра-золийбромид; M5655), бромистый цетилтриметил-аммоний (H6269) фирмы Sigma, США; нитроце-фин (484400) фирмы Calbiochem, США; уксусную кислоту, хлористый аммоний, ацетат натрия фирмы «Вектон», Россия; эмбриональную телячью сыворотку (1.1.8.3.), питательные среды RPMI-1640 (1.3.4) и DMEM (1.3.5.1.) фирмы «Биолот», Россия для культивирования клеток; питательную среду Сабуро (бульон) сухой ЗАО НИФЦ, Россия; питательный бульон Мюллера-Хинтона (M391) фирмы HiMеdia, Индия. В качестве пептидов сравнения использовали химически синтезированные пептиды - протегрин 1, любезно предоставленный Р. Лерером (Калифорнийский университет г. Лос-Анджелеса, США) и бактенецины ChBac5, ChBac5 20-43 и ChBac3.4, любезно предоставленные Н.И. Колодкиным («Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА).
Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитов домашней козы
Лейкоцитарную массу, обогащенную нейтрофилами, получали из крови взрослых здоровых коз (С. hircus). Гемолиз эритроцитов осуществляли раствором хлористого аммония. Из 1 л цельной крови получали 2.5 г лейкоцитарной массы (на сырой вес). Использовали два варианта экстракции белков. В первом случае клетки разрушали гомогенизацией в 10% растворе уксусной кислоты, гомогенат суспендировали на магнитной мешалке при 4оС в течение 18-24 ч, затем центрифугировали при 15000 g в течение 1 ч. Супернатант высушивали, перерастворяли в 0.1 М трис-НС1-буфере рН 7.5 и инкубировали при 37оС в течение 4 ч для расщепления предшественников кателицидинов. Во втором случае для экстракции использовали 0.3% раствор бромистого цетилтриме-тиламмония в 0.02 М натрий-ацетатном буфере рН 4.5. При использовании данного метода экстракции создавались условия для осуществления ферментативных реакций уже в ходе процесса экстракции. Полученный после экстракции материал подвергали ультрафильтрации через мембрану YM-10 (НОММ 10 кДа) фирмы Amicon (США) для отделения низкомолекулярной белковой фракции, далее концентрировали и обессоливали при ультрафильтрации через мембрану YM-1 (НОММ 1 кДа). Материал, содержащий кислоторастворимые полипептиды с молекулярной массой менее 10-15000 Да, наносили на электрофоретическую колонку для разделения с помощью препаративного электрофореза (ЭФ) в 12.5% полиакриламидном геле в кислой буферной
системе в присутствии мочевины [13] в аппарате фирмы Bio-Rad (США) при непрерывной элюции белков из геля. Фракции, в которых была выявлена антимикробная активность, отбирали и разделяли содержащиеся в них пептиды с помощью нескольких последовательных циклов обращенно-фазо-вой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на установке Gold System фирмы Beckman (США) с использованием колонок Vydac C-18 (4.6 х 250 мм; диаметр частиц сорбента 5 мкм). Чистоту полученных после ОФ ВЭЖХ фракций оценивали с помощью аналитического ЭФ [14], масс-спектрометрии, а также аналитической ОФ ВЭЖХ. Концентрацию белка в очищенных препаратах определяли по методу Брэдфорд, а также по методу Вольфа [15]. Концентрацию растворов химически синтезированных пептидов рассчитывали по сухому весу порошка пептида.
Оценка антимикробной активности пептидов
Для характеристики антимикробной активности мини-бактенецинов использовали два метода - метод радиальной диффузии в агарозном геле и метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Штаммы микроорганизмов любезно предоставлены Р. Лерером (Калифорнийский университет г. Лос-Анджелеса, США), А. Тосси (университет г. Триеста, Италия), Е.И. Ермоленко («ИЭМ»); сотрудниками Военно-медицинской академии; Г.Е. Афиногеновым (РНИИТО им. Вредена Минздрава России). Использован клинический изолят Pseudomonas aeruginosa, устойчивый к азтреонаму, цефтазидиму, цефотаксиму, клинический изолят Klebsiella spp., устойчивый к тетрациклину (оба штамма получены из мочи больного циститом), клинический изолят Acinetobacter baumannii, устойчивый к меропене-му (из инфицированной раны); клинический изолят Staphylococcus intermedius (из инфицированной раны, полученной после укуса собакой), устойчивый к ципрофлоксациму, цефуроксиму, клиндами-цину, эритромицину, рифампицину, гентамицину, бензпенициллину, оксациллину; клинический изо-лят дрожжеподобного грибка Candida parapsilosis, устойчивый к амфотерицину и клотримазолу (соскоб с ногтевой пластины).
Метод радиальной диффузии в агарозных гелях. Применяли методику, предложенную Лерером и др. [16] и подробно описанную [12]. Для количественной оценки антибиотического действия АМП измеряли диаметр зоны ингибирования роста микробов вокруг лунок в агарозном геле, в которые были внесены пептиды. За 1 условную единицу принимали размер 0.1 мм. Из измеренного значения вычитали 20 единиц,
соответствующих диаметру лунки. Минимальную ингибирующую рост микробов концентрацию (МИК) АМП определяли, строя графики зависимости антимикробной активности пептидов от их концентрации в программе Sigma Plot 11 (Systat Software Inc., США) и рассчитывая значение для точки пересечения графика линейной регрессии с осью абсцисс (концентрация пептидов в мкМ), которое и принимали за МИК. В каждом опыте использовали по две параллельных пробы. Опыты повторяли 3 раза, рассчитывали среднее значение МИК ± среднеквадратичное отклонение.
Метод серийных разведений препаратов в жидкой питательной среде. Использовали стандартную методику, применяемую в микробиологии для тестирования антибиотиков, но с небольшими модификациями, разработанными с учетом специфики АМП [17] согласно [12]. За МИК принимали наименьшую концентрацию пептида, при которой полностью инги-бировался видимый рост микроорганизмов в лунках 96-луночных планшетов. В каждом опыте использовали по три параллельных пробы. Результаты представлены как медианы, полученные по трем-пяти независимым экспериментам.
Оценка влияния пептидов на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E. coli ML35p для хромогенных маркеров
Действие пептидов на барьерную функцию мембран грамотрицательной бактерии изучали с использованием метода [18] в модификации [19]. Штамм E. coli ML35p характеризуется отсутствием пермеазы лактозы, конститутивным синтезом ß-галактозидазы в цитоплазме, а также содержит ß-лактамазу в пе-риплазматическом пространстве. О состоянии наружной и цитоплазматической мембран клеток E. coli ML35p судили по их проницаемости для хромогенных маркеров - нитроцефина и о-нитрофенил-ß-D-галактопиранозида (ONPG), субстратов ß-лактамазы и ß-галактозидазы соответственно. Пробы вносили в лунки 96-луночного планшета согласно [12] и измеряли оптическую плотность (OD) раствора, обусловленную появлением продукта гидролиза нитроцефина или ONPG при X = 486 и 420 нм соответственно с помощью спектрофотометра SpectraMax 250 (Molecular Devices, США) при 37°С и периодическом встряхивании планшетов в течение 2 ч. Данные обрабатывали в программе Sigma Plot 11.
Оценка липополисахаридсвязывающей активности пептидов
Липополисахаридсвязывающую (липополисахарид-нейтрализующую) активность пептидов изучали
с помощью количественного хромогенного Лимулюс-теста (Quantitative Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate; Lonza Walkersvile, США). При проведении экспериментов и обработке результатов использовали подходы, описанные Zhao и соавт. [20]. Приготавливали серийные двукратные разведения пептидов в воде с 0.01% уксусной кислоты и инкубировали АМП с липополисахаридом (ЛПС) E. coli O111:B4 в конечной концентрации 0.5 Ед/мл в течение 30 мин при 37оС в планшетах Costar 3596 (Corning, США). Проводили количественное определение свободного ЛПС в соответствии с рекомендациями производителя набора. Планшет помещали в термостатируемую камеру спектрофотометра SpectraMax 250 (Molecular Devices, США), инкубировали при 37оС, измеряя OD раствора при 405 нм; вычисляли разницу величин OD в начале инкубации и через 10 мин - AOD405.
Долю связанного ЛПС (%) определяли по формуле:
% связанного ЛПС = а(ЛПС без пептида) -
- а(ЛПС с пептидом) / а(ЛПС без пептида),
где а = A OD405(пептид (или вода) с ЛПС) -AOD405(пептид (или вода) без ЛПС). Строили кривые зависимости доли связанного ЛПС от концентрации АМП в инкубационной среде (программа Sigma Plot 11, Systat Software Inc., США) и определяли ЭК50 (эффективная концентрация 50% или концентрация пептидов, при которой 50% ЛПС находится в связанном состоянии).
Анализ гемолитической активности пептидов
Эритроциты получали из крови здоровых доноров по стандартной методике. Из осадка эритроцитов (считали, что осадок содержит 100% суспензию клеток) получали 2.8% суспензию эритроцитов в забуференном физиологическом растворе (ЗФР). В анализируемые пробы вносили 27 мкл суспензии эритроцитов и 3 мкл исследуемого пептида (в разных концентрациях) в ЗФР или 3 мкл ЗФР (контроль). Пробы (по три повторности) инкубировали при 37°С в течение 30 мин, добавляли по 75 мкл охлажденного ЗФР и центрифугировали при 5000 g в течение 4 мин. Оптическую плотность супернатантов измеряли при X = 540 нм.
Оценка влияния пептидов на жизнеспособность культивируемых клеток
Жизнеспособность культивируемых клеток человека после их 20-часовой инкубации с пептидами оценивали с помощью стандартного МТТ-теста [21] согласно [12]. Культивирование клеток, выделение нейтро-филов и мононуклеарных клеток периферической
крови здоровых доноров проводили по стандартным методикам.
Масс-спектрометрия
Молекулярные массы выделенных пептидов определяли на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Reflect III (Bruker, Германия), оснащенном УФ-лазером с длиной волны 336 нм. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (Sigma, Германия) в 20% ацетонитриле, 0.1% ТФУ в концентрации 10 мг/мл. Указаны средние молекулярные массы.
Определение аминокислотной последовательности
Аминокислотную последовательность определяли, используя систему для секвенирования белков Procise cLC 491 (Applied Biosystems, США). Фенилтиогидантоиновые производные аминокислотных остатков идентифицировали на анализаторе 120A PTH (Applied Biosystems, США).
Синтез мини-бактенецинов
Mini-ChBac7.5Na и mini-ChBac7.5Nß синтезировали с помощью твердофазного синтеза и Fmoc/ tBu-стратегии на пептидном синтезаторе Syro2000 (MultiSynTech GmbH, Германия) [22]. После завершения синтеза пептиды снимали смесью 5% воды, 4% м-крезола, 5% тиоанизола и 2% этандити-ола в ТФУ при комнатной температуре в течение 4 ч и осаждали охлажденным диэтиловым эфиром. Синтезированные пептиды очищали с использованием ВЭЖХ Äkta (Amersham Bioscience GmbH, Германия) на колонке Jupiter C18 (20 мм х 250 мм, Phenomenex Inc., США) в линейном градиенте ацето-нитрила с 0.1% ТФУ. Молекулярные массы пептидов подтверждали с помощью MALDI-TOF-MS, чистоту - ОФ ВЭЖХ.
Статистическая обработка результатов
Статистическую значимость различий между опытными и контрольными группами при определении цитотоксической активности АМП для клеток человека оценивали с применением t-критерия Стьюдента (p < 0.05), n = 6 в программе Prism 5 (GraphPad Software Inc., США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выделение и очистка новых антимикробных пептидов из лейкоцитов козы
При выделении пептидов обеспечивали условия, при которых возможен процессинг предшественников кателицидинов с высвобождением зрелых АМП. Для разделения катионных пептидов, полученных
л
0.18 -0.16 -0.14 -0.12 -
О
<А 0.10 -0.08 0.06 0.04 0.02
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
Номер фракции
Рис. 1. Выделение и очистка мини-бактенецинов из экстракта лейкоцитов домашней козы. А - профиль элюции белков с электрофоретической колонки при проведении препаративного электрофореза (ПЭФ) белков из экстракта лейкоцитов козы после ультрафильтрации материала через мембрану YM-10. Пик 1 - пептиды с молекулярными массами 2.8-6 кДа, в состав которых входили мини-бактенецины; пик 2 - ChBac3.4; пик 3 -ChBac5. Антимикробная активность белков во фракциях против E. coli ML35p и Listeria monocytogenes EGD (ось ординат - справа). Б, В - профиль элюции пептидов с колонки Vydac C-18 при проведении ОФ ВЭЖХ с использованием градиента концентраций ацетонитрила от 0 до 60% за 60 мин (с 0.1% трифторуксусной кислоты) для разделения объединенных фракций 19-24 после ПЭФ (Б) или 0-20% за 20 мин, 20-50% за 60 мин, 50-60% за 10 мин (с 0.13% гептафтормасляной кислоты) для разделения мини-бактенецинов (В). Стрелками отмечены пики, в которых выходили пептиды со средними молекулярными массами 2895.5 и 2739.3 Да - мини-бактенецины mini-ChBac7.5Na и -ß
после ультрафильтрации экстрактов лейкоцитов козы через мембрану YM-10, использовали препаративный электрофорез. Фракции анализировали, измеряя оптическую плотность растворов при длине волны 280 нм, а также оценивая антимикробную активность методом радиальной диффузии (рис. 1А). Фракции 17-24 содержали компоненты с наиболь-
шей электрофоретической подвижностью по направлению к катоду - пептиды с молекулярными массами от 2.8 до 6 кДа, обладающие антимикробной активностью (пик 1), в пиках 2 и 3 - бактенецины ^Вас3.4 и ^Вас5 (рис. 1А).
Для получения индивидуальных пептидов, выходящих во фракциях, соответствующих пику 1, при-
mini-ChBac7.5Na
mini-ChBac7.5NP
ChBac7.5
BtBac7
OaBac7.5
OaBac7.5mini
ChBac5
ChBac3.4
RRLRPRRPRLPRPRPRPRPRPR RRLRPRRPRLPRPRPRPRPRP
RRLRPRRPRLPRPRPRPRPRPRSLPLPRPQPRRIPRPILLPWRPPRPIPRPQPQPIPRWL RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPGPRPIPRPLPFPRPGPRPIPRPLPFPRPGPRPIPRP RRLRPRRPRLPRPRPRPRPRPRSLPLPRPQPRRIPRPILLPWRPPRPIPRPQPQPIPRWL
RRIPRPILLPWRPPRPIPRPQPQPIPRWL RFRPPIRRPPIRPPFNPPFRPPVRPPFRPPFRPPFRPPIGPFP* RFRLPFRRPPIRIHPPPFYPPFRRFL*
Рис. 2. Первичная структура выделенных из лейкоцитов козы антимикробных пептидов - мини-бактенецинов mini-ChBac7.5Na и -в в сравнении со структурами ряда бактенецинов: Вас7 быка (В+Вас7 - отличающиеся аминокислотные остатки подчеркнуты) [5], ОаВас7.5 [9] и ОаВас7.5тЫ [2] овцы, и ^Вас5 [11] и ^Вас3.4 [12] козы. Приведена также структура полноразмерного ^Вас7.5. * - амидированный С-конец молекулы
меняли последовательные циклы ОФ ВЭЖХ с использованием различных противоионов. На рис. 1Б представлены результаты, полученные при проведении первого этапа хроматографического разделения пептидов, содержащихся в объединенных фракциях 19-24. Антимикробная активность выявлена во фракциях, отмеченных стрелкой (24-26-я минута) и содержащих два пептида со средними молекулярными массами 2895.5 и 2739.3 Да. Для разделения пептидов проводили рехроматографию с применением в качестве противоиона гептаф-тормасляной кислоты (рис. 1В). Получили индивидуальные пептиды (названные нами мини-бак-тенецинами), выходящие с колонки во фракциях, соответствующих пикам, отмеченным стрелками на хроматограмме, - пептид со средней молекулярной массой 2895.5 Да - тЫ-^Вас7.5^ и 2739.3 Да - тть^Вас7.5^.
Анализ первичной структуры выделенных АМП показал, что оба пептида представляют собой ^концевые фрагменты бактенецина 7.5 козы, информация о структуре которого, полученная путем клонирования гена, представлена в базе данных (Q9XSQ9, (Q9XSQ9_CAPHI) UшProtKB/TrEMBL) [23], но соответствующий белковый продукт не был выделен ранее из лейкоцитов (рис. 2). Описано выделение фрагмента бактенецина 7.5 овцы (пептида, структурно сходного с бактенецином 7.5 козы), однако эта молекула представляла собой С-концевой участок бактенецина 7.5 [2]. Учитывая, что этот пептид был назван ОаВас7.5тШ, мы по аналогии назвали наши пептиды mini-ChBаc7.5Na и -в, добавив букву N указывающую на то, что это ^концевые фрагменты (^ - аббревиатура C. Ытсш, домашняя коза).
Процедуру выделения и очистки повторяли в нескольких сериях экспериментов, получая при этом одни и те же фракции ми-
ни-бактенецинов. Приведенные выше данные получены при использовании материала, в котором белки экстрагировали с помощью 10% уксусной кислоты. Мини-бактенецины выявлены также при экстракции белков детергентом - бромистым цетилтри-метиламмонием. Ингибиторы протеаз не применяли, так как в этом случае не удается получить зрелые формы АМП семейства кателицидинов.
Таким образом, из лейкоцитов козы впервые выделены пептиды - N-концевые фрагменты бактенецина 7.5. Полноразмерный бактенецин 7.5 выявить не удалось, вероятно, большая его часть подверглась протеолитическому расщеплению.
Антимикробная активность мини-бактенецинов
Антимикробную активность мини-бактенецинов, полученных с помощью химического синтеза, анализировали с применением двух методов - радиальной диффузии в агарозном геле (РД) и метода серийных разведений в жидкой питательной среде (таблица). При оценке активности бактенецинов методом РД пептиды инкубировали с микроорганизмами в разных условиях: в среде с низкой ионной силой (0.01 М натрий-фосфатный буфер рН 7.4 без добавления солей) и в той же среде, но с добавлением 100 мМ хлорида натрия.
Установлено, что известные к настоящему времени пролин-богатые АМП (ПБ-АМП) обладают высокой антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий и сниженной в отношении большинства грамположительных, особенно стафилококков [24]. Нами показано, что в среде с низкой ионной силой мини-бактенецины проявляют широкий спектр антимикробного действия и высокую активность в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, включая стафилококков, а также С. albicans (таблица). Однако
Антимикробная активность мини-бактенецинов козы: минимальные ингибирующие концентрации пептидов (мкМ), установленные методом радиальной диффузии в агарозном геле (РД) и методом серийных разведений в жидкой питательной среде (СР)
Микроорганизм mini-ChBac7.5Na mini-ChBac7.5Nß
Метод РД* Метод СР** Метод РД* Метод СР**
без NaCl 100 мМ NaCl питательный бульон*** без NaCl 100 мМ NaCl питательный бульон***
E. coli ML35p 0.3 ± 0,1 1.5 ± 0.2 1 0.3 ± 0.1 1.4 ± 0.2 1
E. coli ATCC 25922 0.6 ± 0.1 0.9 ± 0.2 2 0.5 ± 0.2 0.8 ± 0.2 2
E. coli M17 0.5 ± 0.1 0.8 ± 0.1 2 0.5 ± 0.1 0.9 ± 0.2 1
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1.1 ± 0.4 3.7 ± 1.2 2 1.0 ± 0.3 3.2 ± 0.8 2
Pseudomonas aeruginosa клинический изолят - - 2 - - 2
Klebsiella spp. клинический изолят - - 4 - - 4
Acinetobacter baumannii клинический изолят - - 2 - - 4
Listeria monocytogenes EGD 0.2 ± 0.1 1.0 ± 0.2 2 0.2 ± 0.1 0.9 ± 0.2 2
Micrococcus luteus CIP A270 - - 1 - - 1
Staphylococcus aureus 710A 0.7 ± 0.2 >50 > 64 0.6 ± 0.1 >50 > 64
Staphylococcus aureus АТСС 25923 - - > 64 - - > 64
MRSA ATCC 33591 0.7 ± 0.2 >50 > 64 0.5 ± 0.1 >50 > 64
Staphylococcus intermedius клин. изолят - - > 64 - - > 64
Candida albicans 820 0.3 ± 0.1 >50 64 0.3 ± 0.1 >50 > 64
Candida paraps^sis клинический изолят - - > 64 - - > 64
*Данные представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение (п = 6); пептиды инкубировали с микроорганизмами - в одном случае в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.4, в другом случае в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 100 мМ №С1.
**Данные представлены как медианы, полученные в результате трех-пяти серий экспериментов (каждый выполняли в трех повторностях).
***Бульон Мюллера-Хинтона для бактерий, среда Сабуро для грибов. «-» - Тест не проводили.
при повышении ионной силы среды активность АМП снижается в отношении как стафилококков, так и С. albicans. В случае грамотрицательных бактерий зависимость активности мини-бактенецинов от ионной силы среды менее выражена.
При изучении антимикробной активности пептидов методом серийных разведений в жидкой питательной среде (таблица) показана высокая антимикробная активность мини-бактенецинов против грамотрицательных бактерий, включая штаммы, устойчивые к ряду применяемых в клинике антибиотиков: P. aeruginosa (устойчивость к азтреонаму, цефтазидиму, цефотаксиму), Klebsiella spp. (устойчивость к тетрациклину), A. baumannii (устойчивость к меропенему) - МИК 2-4 мкМ. Пептиды проявляют выраженную активность в отношении грамположительных бактерий Listeria monocytogenes и Micrococcus luteus, однако их антибактериальное действие в отношении стафилококков, а также представителей рода Candida практически не выявляется в диапазоне концентраций от 1 до 64 мкМ.
Влияние АМП на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E. coli ML35p для хромогенных маркеров
Одна из важнейших задач изучения функциональных свойств АМП - обнаружение основной мишени их антимикробного действия. У большинства АМП это бактериальные мембраны - пептиды вызывают их быструю и необратимую дезинтеграцию. Однако некоторые АМП, в том числе ПБ-АМП, преимущественно нарушают внутриклеточные процессы в бактериальных клетках и повреждают их мембраны лишь в концентрациях, значительно превышающих МИК [25]. Нами изучено влияние мини-бактенецинов на проницаемость наружной и цитоплазматической мембраны E. coli ML35p. На рис. 3 представлена кинетика действия mini-ChBac7.5Na в концентрации 0.6-20 мкМ на мембраны E. coli ML35p. В качестве пептида сравнения использовали бактенецин козы ChBac3.4 (5 мкМ, что в 2 раза выше МИК), а положительным контролем служил мембраноактивный пептид протегрин 1 (PG-1) свиньи. Проницаемость наружной мембраны бактерии для хромогенного
А486
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
Наружная мембрана
А
420 1 о
Цитоплазматическая мембрана
6 5 4 3
21
Время, мин
Рис. 3. Кинетика изменения проницаемости наружной (левая панель) и цитоплазматической (правая панель) мембран E. coli ML35p для хромогенных маркеров при действии мини-бактенецина mini-ChBac7.5Na в различных концентрациях (мкМ): 1 - 0.6; 2 - 1.2; 3 - 2.5; 4 - 5; 5 - 10; 6 - 20. По оси ординат - время инкубации пептидов с бактерией; по оси абсцисс - оптическая плотность раствора, содержащего продукты гидролиза хромогенных субстратов. В качестве пептида сравнения использовали бактенецин козы ChBac3.4 (5 мкМ), а положительного контроля -протегрин 1 (PG-1 - 2.5 мкМ)
маркера повышается при действии мини-бактене-цина практически во всем исследуемом диапазоне концентраций, хотя в случае PG-1 (2.5 мкМ, что в 2 раза выше МИК) эффект более выражен. Однако пептид лейкоцитов козы не оказывает существенного воздействия на проницаемость цитоплазматической мембраны E. coli для маркерной молекулы. Лишь при высоких концентрациях пептида (10 и 20 мкМ), значительно превышающих МИК (1-2 мкМ), данные несколько отличаются от значений в контроле, где отсутствовали АМП. Эффект ChBac3.4, в отличие от мини-бактенецина, проявляется уже в концентрации, в 2 раза превышающей МИК. Для второго мини-бактенецина и mini-ChBac7.5Na результаты практически не отличались (данные не приведены). Полученные данные позволяют заключить, что бактериальные мембраны не являются основной мишенью изучаемых нами мини-бактенецинов, как и других известных ПБ-АМП. Вероятно, подобно фрагментам Bac7 быка и OaBac7.5 овцы они могут связываться с шапероном DnaK и модулировать его ATP-азную активность, нарушая процесс белкового фолдинга в клетке [25, 26], или взаимодействовать с 70S рибосомами, нарушая процесс трансляции, как показано для апидецинов, онкоцинов, фрагмента 1-35 Вас7 быка [27, 28]. Как и фрагменты 1-35 Вас7 быка, которые воздействовали на цитоплазма-тическую мембрану E. coli ML35p в концентрациях, в несколько раз превышающих МИК [24], мини-бак-тенецины влияют на проницаемость внутренней мембраны этой бактерии лишь в концентрациях, в 10-20 раз превышающих МИК.
Липополисахаридсвязывающая активность мини-бактенецинов козы
Связывание с липополисахаридом (ЛПС) - компонентом наружной мембраны грамотрицатель-ных бактерий - одно из важных свойств АМП, так как от характера этого связывания во многом зависит и последующая эффективность антимикробного действия пептидов. При разработке лекарственных препаратов на основе АМП большое внимание наряду с антимикробными свойствами уделяют и ЛПС-связывающей (нейтрализующей) активности, учитывая важность получения соединения, которое может способствовать не только инактивации патогенных микроорганизмов, но и предотвращать или устранять последствия септического шока, вызываемого грамотрицательными бактериями, - серьезного осложнения инфекционных заболеваний, часто приводящего к смертельному исходу. В последнее время опубликовано большое количество работ, в которых комплексно анализируется зависимость особенностей структуры пептидов - прототипов лекарственных средств от их антимикробного действия, селективности по отношению к прокариоти-ческим клеткам и ЛПС-нейтрализующим свойствам. Показано, что ЛПС-нейтрализующая активность пептида зависит от соотношения гидрофобности/ величины суммарного положительного заряда его молекулы [29]. Путем определения эффективной концентрации, при которой 50% ЛПС (ЛПС E. coli O111:B4) находится в связанном с пептидом состоянии [20], нами оценена ЛПС-связывающая активность мини-бактенецинов. Для сравнения приведены
110 100 90 80 70 60
40 30 20 10 0
V mini-ChBac7.5Na
ф
О ^Вас5
А 0)Вас3.4
• РтхВ
ChBаc5 20-43
.*1 ц
1 а
50 \-------У--------— .
А
Пептид ЭК50, мкМ
mini-ChBac 33.0
mini-ChBac 24.1
ChBac5 5.4
ChBac3.4 7.7
РтхВ 0.18
0)Вас5 20-43 > 100
0.01
0.1 1 Концентрация пептидов, мкМ
10
100
Рис. 4. Связывание липо-полисахарида мини-бактенеци-нами в сравнении с бактенецинами козы ^Вас3.4 и ^Вас5 и фрагментом ChBac5 20-43, обладающим низкой антимикробной активностью. Положительный контроль - поли-миксин В (РтхВ). Приведены средние значения ± среднеквадратичное отклонение, п = 6. В таблице указаны ЭК50 пептидов
данные, полученные для других АМП лейкоцитов козы - бактенецинов ^Вас3.4, ^Вас5 и пептида с низкой антимикробной активностью - химически синтезированного С-концевого участка (аминокислотные остатки 20-43) бактенецина ^Вас5 (^Вас5 20-43). Положительным контролем служил полимик-син В, известный как соединение, обладающее высокой аффинностью к ЛПС (рис. 4). Мини-бактенецины характеризуются значительно более высокими показателями рассматриваемого вида активности по сравнению с ChBac5 20-43, хотя и несколько уступают бактенецинам ^Вас3.4 и ^Вас5, что может объясняться большим суммарным положительным зарядом молекул мини-бактенецинов и меньшей их гидрофобностью по сравнению с ^Вас3.4 и ChBac5 (рис. 4). Mini-ChBac7.5Na содержит 12 остатков аргинина и лишь два остатка лейцина (тш-ChBаc7.5NP - 11 остатков аргинина и два лейцина). Кроме того, мини-бактенецины не содержат остатков ароматических аминокислот, присутствие которых (в особенности остатка триптофана), как полагают, обусловливает повышенную ЛПС-нейтрализующую активность [30]. ОДВас3.4 и ОДВас5, напротив, содержат относительно большое количество остатков ароматических аминокислот, главным образом, фенилалани-на. Полученные данные предоставляют информацию для анализа закономерностей проявления различных видов биологической активности АМП, а также указывают на возможность разработки антибиотических препаратов на основе мини-бактенецинов путем
создания их аналогов, содержащих большее количество остатков гидрофобных аминокислот, в частности триптофана.
Действие мини-бактенецинов на клетки млекопитающих
Как известно, большинство ПБ-АМП не обладает выраженной токсичностью для клеток млекопитающих [25]. Оценка гемолитической активности мини-бак-тенецинов в отношении эритроцитов человека показала, что в концентрации 1-100 мкМ оба пептида не оказывают выраженного действия на эритроциты. Показатели проб, содержащих пептиды в этих концентрациях, не отличались статистически значимо от показателей в контрольных пробах, не содержащих АМП (р > 0.05, {-критерий Стьюдента, п = 9).
С применением МТТ-теста определено действие мини-бактенецинов в концентрации 1-30 мкМ на клетки человека. Установлено, что пептиды обладают низкой цитотоксической активностью в отношении различных типов культивируемых клеток человека, а именно, клеток эритромиелоидного лейкоза К-562, гистиоцитарной лимфомы и-937, промиело-цитарного лейкоза HL-60, эпителиоидной карциномы легкого А-549, эпидермоидной карциномы А-431, остеосаркомы человека MG-63, а также нормальных фибробластов кожи человека, фибробластов легкого эмбриона человека MRC-5, нейтрофилов и моно-нуклеарных клеток периферической крови человека. Показатели цитотоксичности, полученные после
24 ч инкубации с пептидами, не отличались значимо от величин, рассчитанных для контрольных проб, не содержащих пептиды, во всем диапазоне концентраций - 1-30 мкМ (p > 0.05, t-критерий Стьюдента, n = 9). Эти данные свидетельствуют об избирательности действия мини-бактенецинов козы в отношении микробных клеток, что согласуется с наблюдениями, в которых установлена низкая токсичность N-концевых фрагментов 1-16, 1-23, 1-35 Вас7 быка для клеток млекопитающих [24].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Из лейкоцитов домашней козы C. hircus нами выделены два антимикробных пептида, названных мини-бактенецинами mini-ChBac7.5Na и mini-ChBac7.5Nß, которые являются N-концевыми фрагментами пептида ChBac7.5, впервые полученными из клеток крови. Из лейкоцитов овцы ранее были выделены несколько фрагментов бактенецинов -OaBac11, OaBac5, OaBac7.5 [2]. С-Концевой фрагмент (32-60), выделенный Андерсон и соавт. [2] и названный OaBac7.5mini, имел относительно низкую антимикробную активность [31] по сравнению с активностью N-концевых фрагментов бактенецина 7.5 козы. Мини-бактенецины козы имеют структурное сходство и с N-концевой частью Bac7 быка [5] (рис. 2). Для проявления антимикробной активности Вас7 быка необходим именно N-концевой участок молекулы (не менее 16 аминокислотных остатков) [24], по длине примерно соответствующий выделенным нами пептидам. С-Концевые фрагменты Вас7 быка имели низкую антимикробную активность [24]. В молекулах бактенецинов 7.5 козы и овцы, а также бактенецина 7 быка N-концевые участки имеют высокое структурное сходство, в то время как С-концевые области значительно различаются. Обнаружение фрагментов бактенецинов 7.5 овцы [2] и мини-бакте-нецинов козы позволяет предположить, что именно после фрагментации образовавшиеся пептиды и выполняют основные защитные функции: N-концевые производные - антимикробную, а С-концевые, возможно, играют другую роль, которая еще до конца не выяснена.
Предположение о важности фрагментации зрелых форм АМП, в том числе и для регуляции их биологических эффектов в ходе развития инфекционного процесса, было выдвинуто при изучении про-теолитического расщепления кателицидина LL-37 человека. В результате расщепления этого пептида образуются фрагменты, часть из которых обладает более выраженной антимикробной активностью, чем полноразмерный LL-37 [1, 32]. Однако установлено, что при высокой антимикробной активности иммуномодулирующая активность этих пептидов
снижена по сравнению с полноразмерным кателици-дином [32]. Характер фрагментации кателицидина зависит от многих факторов, но в наибольшей степени - от активности протеаз, осуществляющих его процессинг, и от активности их ингибиторов [1]. Эти факторы, в свою очередь, зависят от параметров, определяемых микроокружением, которое может изменяться в ходе инфекционного или других патологических процессов. Поэтому фрагментация кате-лицидина человека может рассматриваться как один из механизмов тонкой и многогранной регуляции функциональной активности АМП. С другой стороны, на основании изучения биологической активности фрагментов этого пептида разрабатываются разнообразные антибактериальные, а также и противоопухолевые пептидные препараты - производные LL-37, которые рассматриваются как перспективные прототипы новых лекарственных средств.
Фрагментации подвергаются и другие антимикробные полипептиды, при расщеплении которых образуются их укороченные варианты с выраженной бактерицидной активностью. Например, при про-цессинге лактоферрина, компонента специфических гранул нейтрофилов, образуется антимикробный пептид лактоферрицин, который рассматривается как соединение, играющее самостоятельную биологическую роль в осуществлении защитных функций нейтрофилов [33]. Из лейкоцитов и кожных покровов ряда рыб и амфибий получены фрагменты ги-стонов, обладающие антимикробной активностью и, как предполагается, выполняющие защитные функции [34, 35].
Представляют интерес ферменты, которые могут осуществлять подобный процессинг ПБ-АМП, в частности бактенецина 7.5 козы. Можно предположить, что в этом процессе принимают участие несколько различных протеаз, а расщепление, возможно, включает несколько стадий. В случае mini-ChBac7.5Nß одним из таких ферментов может быть пролилэндопептидаза (PREP [КФ 3.4.21.26]) или про-лилкарбоксипептидаза (PRCP [КФ 3.4.16.2]), расщепляющие пептидную связь между остатками пролина и аргинина (в молекуле ChBac7.5 - между остатками пролина 21 и аргинина 22). Эти протеазы присутствуют в нейтрофильных гранулоцитах и, как показано, играют немаловажную роль в реакциях воспалительного процесса [36]. Дальнейшее исследование с использованием ингибиторов протеаз различного типа позволит пролить свет на этот вопрос.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Получение из лейкоцитов домашней козы высокоактивных антимикробных пептидов, названных нами мини-бактенецинами mini-ChBac7.5Na и mini-
ChBac7.5Nß и представляющих собой N-концевые фрагменты бактенецина 7.5, свидетельствует в пользу представления о важности фрагментации антимикробных пептидов врожденного иммунитета - одного из факторов, необходимых для реализации и регуляции защитных реакций при развитии инфекционного или воспалительного процессов. Показано, что мини-бактенецины проявляют высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных бактерий, включая антибиотикоустойчивые штаммы, обладают липополисахаридсвязывающей активностью, не проявляют токсичности по отношению к культивируемым клеткам человека. Все это свидетельству-
ет о перспективности дальнейшего исследования антимикробной активности этих соединений на большем числе микроорганизмов и изучения возможности разработки на их основе новых антибактериальных терапевтических препаратов. •
Работа поддержана грантом ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса
России на 2014-2020 годы» (соглашение № 14.604.21.0104). Уникальный идентификатор RFMEFI60414X0104.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yamasaki K., Schauber J., Coda A., Lin H., Dorschner R., Schechter N., Bonnart C., Descargues P., Hovnanian A., Gallo R.L. // FASEB J. 2006. V. 20. № 12. P. 2068-2080.
2. Anderson R., Yu P.L. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 312. P. 1139-1146
3. Kokryakov V.N., Harwig S.S., Panyutich E.A., Shevchenko A.A., Aleshina G.M., Shamova O.V., Korneva H.A., Lehrer R.I. // FEBS Lett. 1993. V. 327. P. 231-236.
4. Agerbert B., Lee J.Y., Bergman T., Carlquist M., Boman H.G., Mutt V., Jörnvall H. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. P. 849-854.
5. Gennaro R., Skerlavaj B., Romeo D. // Infect. Immun. 1989. V. 57. P. 3142-3146.
6. Skerlavaj B., Gennaro R., Bagella L., Merluzzi L., Risso A., Zanetti M. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 28375-28381.
7. Romeo D., Skerlavaj B., Bolognesi M., Gennaro R. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 9573-9575.
8. Selsted M., Novotny M., Morris W., Tang Y., Smith W., Cullor J. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 7. P. 4292-4295.
9. Huttner K.M., Lambeth M., Burkin H., Burkin D., Broad T. // Gene. 1998. V. 206. P. 85-91.
10. Zhao C., Nguen T., Liu L., Shamova O., Brogden K.A., Lehrer R.I. // Infect. Immun. 1999. V. 67. № 11. P. 6221-6224.
11. Shamova O., Brogden K.A., Zhao C., Nguen T., Turner J., Kokryakov V., Lehrer R.I. // Infect. Immun. 1999. V. 67. № 8. P. 4106-4111.
12. Shamova O., Orlov D., Stegemann C., Czihal P., Hoffmann R., Brogden K., Kolodkin N., Sakuta G., Tossi A., Sahl H.-G., Kokryakov V., Lehrer R.I. // Int. J. Pept. Res. Therap. 2009. V. 15. № 1. P. 31-42.
13. Harwig S.S., Chen N.P., Park A.S.K., Lehrer R.I. // Anal. Biochem. 1993. V. 208. P. 382-386.
14. Schagger H., von Jagow G. // Anal. Biochem. 1987. V. 166. P. 368-379.
15. Wolf P. // Anal. Biochem. 1983. V. 129. Pt. 1. P. 145-155.
16. Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S.S., Jackson R., Eisenhauer P. // J. Immunol. Meth. 1991. V. 137. № 2. P. 167-173.
17. Tossi A., Scocchi M., Zanetti M., Genaro R., Storici P., Romeo D. In Antibacterial peptide protocols / Ed. Shafer W. Totowa, N.J.: Humana Press Inc., 1998. P. 133-151.
18. Lehrer R.I., Barton A., Ganz T. // J. Immunol. Meth. 1988. V. 108. P. 153-158.
19. Артамонов А.Ю., Шамова О.В., Кокряков В.Н., Орлов Д.С.
// Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер. 3: Биология. 2008. № 2. С. 139-142.
20. Zhao C., Nguyen T., Boo L., Hong T., Espiritu C., Orlov D., Wang W., Waring A., Lehrer R.I. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V. 45. № 10. P. 2695-2702.
21. Mosmann T. // J. Immunol. Meth. 1983. V. 65. P. 55-63.
22. Singer D., Lehmann J., Hanisch K., Härtig W., Hoffmann R. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 346. P. 819-828.
23. Zhao C., Nguyen T., Brogden K., Lehrer R. // EMBL/Gen-Bank/DDBJ databases. 1999.
24. Gennaro R., Zanetti M., Benincasa M., Podda E., Miani M. // Curr. Pharmaceut. Design. 2002. V. 8. P. 763-778.
25. Scocchi M., Tossi A., Gennaro R. // Cell. Mol. Life Sci. 2011. V. 68. P. 2317-2330.
26. Zahn M., Kieslich B., Berthold N., Knappe D., Hoffmann
R., Strater N. // Protein Pept Lett. 2014. V. 21. № 4. P. 407-412.
27. Krizsan A., Volke D., Weinert S., Sträter N., Knappe D., Hoffmann R. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2014. V. 53. № 45.
P. 12236-12239.
28. Mardirossian M., Grzela R., Giglione C., Meinnel T., Gennaro R., Mergaert P., Scocchi M. // Chem. Biol. 2014. V. 21. № 12.
P. 1639-1647.
29. Rosenfeld Y., Lev N., Shai Y. // Biochemistry. 2010. V. 49. P. 853-861.
30. Nan Y., Bang J., Jacob B., Park I., Shin S. // Peptides. 2012. V. 35. № 2. P. 239-247.
31. Anderson R.C., Hancock R.E.W., Yu P. // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. V. 48. № 2. P. 673-676.
32. Braff M., Hawkins M., Di Nardo A., Lopez-Garcia B., Howell M., Wong C., Lin K., Streib J., Dorschner R., Leung D., et al. // J. Immunol. 2005. V. 174. P. 4271-4278.
33. Gifford J., Hunter H., Vogel H. // Cell Mol. Life Sci. 2005. V. 62. № 22. P. 2588-2598.
34. Park I.Y., Park C.B., Kim M.S., Kim S.C. // FEBS Lett. 1998. V. 437. P. 258-262.
35. Shamova O.V., Orlov D.S., Balandin S.V., Shramova E.I., Tsvetkova E.V., Panteleev P.V., Leonova Yu.F., Tagaev A.A., Kokryakov V.N., Ovchinnikova T.V. // Acta Naturae. 2014. V. 6. № 4 (23). P. 99-109.
36. Waumans Y., Baerts L., Kehoe K., Lambeir A., De Meester I. // Front. Immunol. 2015. V. 7. № 6. 387. doi: 10.3389/ fimmu.2015.00387.
