Антимикробный пептид из лейкоцитов собаки: структурно-функциональные свойства Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 612.398.1:547.964.4

Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2007, вып. 3

Е. С. Кораблева, М. Н, Берлов, Ю. В. Андреева, В. Н. Кокряков

АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ СОБАКИ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

Введение. Система врожденного иммунитета играет важную роль в формировании резистентности организма к инфекции, У млекопитающих данную систему образуют клеточная составляющая (фагоциты, такие, как нейтрофильные гранулоциты, моноциты/макрофаги и т. д.) и различные гуморальные медиаторы (компоненты системы комплемента, цитокины, антимикробные белки и пептиды и т. д.), выделяемые клетками барьерных эпителиев и иммунной системы. В настоящее время уже не вызывает сомнения то, что антимикробные пептиды (АП) являются важными компонентами защитной системы организма, так как они были обнаружены у всех исследованных групп животных [3].

Данная работа является продолжением исследования врожденного иммунитета собаки, которое проводится в Лаборатории химии белка СПбГУ. К настоящему времени выделены и охарактеризованы некоторые антимикробные белки нейтрофильных грануло-цитов собаки [1,2]. Однако сведения об АП в лейкоцитах собаки отсутствуют. Цель данной работы заключалась в поиске и исследовании структурно-функциональных свойств АП в лейкоцитах собаки.

Работа интересна как фундаментальное исследование системы врожденного иммунитета, ранее не изученного в этом аспекте вида позвоночных животных. В ветеринарии результаты данного исследования могут быть использованы на практике при создании лекарственных препаратов нового поколения. Появление штаммов микроорганизмов, устойчивых к традиционным антибиотикам, стимулирует исследования естественных антимикробных агентов, которые впоследствии можно использовать в терапевтических целях. Антимикробные пептиды собаки могут рассматриваться в качестве матрицы для создания таких лекарственных средств. Поэтому поиск и изучение структурно-функциональных свойств антимикробных пептидов в лейкоцитах собаки, которые участвуют в формировании врожденного иммунитета, являются перспективными.

Методы. Выделение лейкоцитов из крови собаки. Получение биологического материала проводилось на базе НИИ физиологии им, И. П. Павлова. Лизис эритроцитов крови собак стабилизированной 0.15%-ный этилендиаминтетрауксусной кислотой (конечная концентрация), осуществляли, добавляя четырехкратный объем 0.85%-ного хлористого аммония. Далее пробы центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. Образовавшийся осадок представлял собой лейкоциты крови собаки.

Экстракция катионных белков и пептидов из лейкоцитов крови собаки. Катионные белки и пептиды из 10 г лейкоцитов собаки экстрагировали в 40 мл 10%-ной уксусной кислоты с помощью гомогенизатора Поттера. Далее экстракт был центрифугирован при 25 000 § в течение 40 мин. Для дальнейших исследований использовали супернатант.

Препаративный электрофорез в кислой буферной системе. Препаративный электрофорез проводили в кислой буферной системе в присутствии мочевины [6]. Конечные концентрации акриламида и КЫ-метил-бис-акриламида в геле - 14.5 и 0.325% соответственно. Полимеризацию проводили в течение 12 ч при +4 °С. Электрофорез проходил в трубке (10см2х11 см) в приборе Вю11ас1, модель - А0501-Х8, Электродным буфером послужила 5%-ная уксусная кислота. Преэлектрофорез и электрофорез проводили при силе тока 30 мА в течение 12 ч. Пробу наносили в растворе, содержащем 3 М мочевину и 5%-ную уксусную кислоту, при силе тока 20 мА в течение 1.5 ч.

© Е. С. Кораблева, М. Н. Берлов, Ю. В. Андреева, В. Н. Кокряков, 2007

Аналитический электрофорез в кислой буферной системе. Спектр белков в различных фракциях оценивали методом электрофореза в кислой буферной системе [10]. Конечные концентрации акриламида и мочевины в геле - 12.5% и 6.25 М соответственно. Гели полимеризовались в течение 1.5 ч. Электрофорез проходил в пластинах толщиной 0.75 мм и высотой 80 мм в приборе «Hoefer» (США). Электродным буфером служила 5%-ная уксусная кислота. Преэлектрофорез и электрофорез осуществляли при напряжении 150-170 В в течение 1-1.5 ч. Раствор для проб содержал 3 М мочевину и 5%-ную уксусную кислоту. Для визуального наблюдения за ходом электрофореза в раствор для проб добавляли метиловый зеленый. Гели окрашивали в растворе 0.1%-ного Кумасси бриллиантового синего G-250 в 27%-ном метаноле и 5.5%-ном формалине в течение 20 мин.

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия. Молекулярную массу белков определяли электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия [14]. Разделяющий гель содержал 16% акриламида и 0.53% НМ-метилен-бис-акриламида, а также 0.1% додецилсульфата натрия. Концентрирующий гель содержал 3% акриламида, 0.1% М,М-метилен-бис-акриламида и 0.1% додецилсульфата натрия. Полимеризацию проводили в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор для проб содержал 2%-ный додецилсульфат натрия, 40 мМ дитиотреитол, 7%-ный глицерин в 55 мМ трис-HCl буфере, рН 8.83 и бромфеноло-вый синий (для визуального наблюдения за ходом электрофореза). Перед электрофорезом пробы инкубировали в растворе для проб при +100 °С на водяной бане в течение 5 мин. Катодный буфер содержал 0.1%-ный додецилсульфат натрия, 0.1 М трис, 0.1 М трицин, рН 8.25. Анодный буфер содержал 0.2 М трис-HCl, рН 8.9. Электрофорез проводили в пластинах толщиной 0.75 мм и высотой 60 мм (разделяющий гель), 20 мм (концентрирующий гель) в приборе «Hoefer» (США); сила тока - 30 мА на гель, длительность - 1.5-2 ч. Гели окрашивали в растворе 0.1%-ного Кумасси бриллиантового синего G-250 в 27%-ном метаноле и 5.5%-ном формалине в течение 20 мин. Для определения молекулярной массы использовали калибровочный набор белков с известной молекулярной массой («Sigma», США).

Определение дисульфидных связей. Наличие дисульфидных связей в катионных белках определяли, окисляя их надмуравьиной кислотой [4]. Надмуравьиную кислоту получали, инкубируя в течение часа 50 мкл 30%-ного раствора перекиси водорода с 450 мкл муравьиной кислоты при комнатной температуре. Высушенные пробы, содержащие 3 мкг исследуемого пептида, инкубировали в течение двух часов на ледяной бане с 20 мкл надмуравьиной кислоты. Затем пробу высушивали под вакуумом, растворяли в 200 мкл охлажденной (+4 °С) дистиллированной воды и снова высушивали. О возможном наличии дисульфидных связей свидетельствовало изменение элекгрофоретической подвижности пептидов, обработанных надмуравьиной кислотой, по сравнению с контрольными пробами при проведении аналитического электрофореза в кислой буферной системе.

Обращение-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ).

ОФ ВЭЖХ проходила на установке Gold System фирмы Beckman, США. Для разделения использовали колонку Supelco С-18 (4.6 х 250 мм; диаметр частиц сорбента 5 мкм) с применением линейного градиента: 0.1% трифторуксусной кислоты в воде - 60% ацетонитрила (1% ацетонит-рила в минуту). Последующие циклы рехроматографии полученных белковых фракций проводили в более пологих градиентах концентрации ацетонитрила (0.1-0.5% в мин).

Гель-фильтрация. Разделение белковых фракций по молекулярной массе осуществляли методом гель-фильтрации на колонке (1.25x24 см) с биогелем Р-10, уравновешенной 5%-ной уксусной кислотой [7]. Элюцию 5%-ной уксусной кислотой осуществляли со скоростью 8 мл/ч, фракции собирали по 4 мл,

Определение концентрации белка. Концентрацию пептидов определяли по методу Вольфа [16]:

Концентрация (мкг/мл) = (Поглощение2!5 - Поглощение225) 144.

Определение антимикробной активности пептидов методом радиальной диффузии в геле. В качестве объектов для определения антимикробного действия белков и пептидов использовали культуры следующих микроорганизмов: грамположительные бактерии - Listeria monocytogenes EGD; грамотрицательные бактерии - Escherichia coli ML35p; низший гриб - Candida albicans 820.

Определение антимикробной активности пептидов проводили методом радиальной диффузии в геле по методу Лерера [8]. Из ночных культур бактерий, выращенных в 50 мл 3%-ной TSB (трип-тического гидролизата сои) при +37 °С, отбирали аликвоты и пересеивали в 50 мл стерильного раствора 3%-ной TSB. Через 2.5 ч инкубации при +37 °С, необходимой для получения микроорганизмов, находящихся в логарифмической фазе роста, питательную среду с микроорганизмами центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин (в случае с Candida albicans использовали ночную культуру, выращенную в 50 мл 3%-ной SBA (среде Сабуро) при +37 °С). Образовавшийся осадок ресуспендировали в 50 мл 0.01 М натрий фосфатного буфера, рН 7.4, и процедуру центрифугирования повторяли. Далее полученный осадок ресуспендировали в 3 мл вышеуказанного фосфатного буфера, и измеряли поглощение суспензии бактерий при 620 нм, исходя из того, что одной единице оптической плотности соответствует 2.5-108 КОЕ/мл, а поглощение суспензии Candida albicans измеряли при 450 нм, принимая во внимание, что одной оптической единице соответствует 2.86-107 КОЕ/мл. Стерильные чашки Петри диаметром 90 мм заливали стерильным раствором 1%-ной агарозы на 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.4, (9 мл) при температуре +42 °С. в который добавляли аликвоту суспензии микроорганизмов, содержащую 4-106 КОЕ. В застывшем геле агарозы делали лунки (диаметром 2 мм), в которые вносили исследуемые (1 мкг) и стандартный (0.25 мкг) образцы (по 2 мкл), разведенные в 0.01%-ной уксусной кислоте. В качестве стандартного образца использовали а-дефенсин-1 кролика (NP-1). Образцы инкубировали в течение 3 ч при +37 °С, и слой агарозного геля с образцами равномерно покрывали раствором 1%-ной агарозы с 6%-ным TSB (в случае Candida albicans 6% SBA) в Н20 при температуре +42 °С. Чашки инкубировали в течение ночи при +37 °С. После этого рост микроба останавливали 5%-ной уксусной кислотой. С целью количественной оценки антимикробного действия пептидов измеряли диаметр так называемой зоны лизиса вокруг лунок, принимая за одну единицу 0.1 мм и вычитая из измеренного значения 20 единиц, соответствующих диаметру лунки.

Определение антимикробной активности белков и пептидов методом наложения гелей. Определение антимикробной активности фракций белков пептидов проводили методом наложения гелей [8]. По выше указанным методам, были приготовлены агарозные гели, содержащие микроорганизмы, и проведен электрофорез исследуемых и стандартного образцов в полиакриламидном геле в кислой буферной системе. В качестве стандартного образца использовали а-дефенсин-1 кролика. После проведения электрофореза полиакриламидный гель трижды по 15 мин промывали в 200 мл 0.01 М натрий-фосфатного буфера (рН 7.4) на шейкере и помещали на поверхность агарозного геля. После инкубации в течение 3 ч при температуре +37 °С полиакриламидный гель удаляли. В процессе инкубации пептиды диффундировали из акриламидно-го в агарозный гель. Агарозный гель равномерно покрывали раствором 1%-ной агарозы в Н20, содержащим 6% TSB, при температуре +42 °С. Чашки инкубировали в течение ночи при +37 °С. После этого рост микроба останавливали 5%-ной уксусной кислотой. Об активности микроба судили по образованию так называемых зон лизиса.

Результаты исследования. В полученном из лейкоцитов собаки кислотном экстракте был проанализирован спектр антимикробных белков и пептидов. На рис. 1 представлены результаты антимикробного теста. На дорожках №1 (Б, В) можно увидеть так называемую зону лизиса, зону с замедленным ростом микроорганизмов, которая образуется под действием антимикробных веществ, содержащихся в экстракте. На дорожках № 2 нанесен а-дефенсин-1 кролика (NP-1) - положительный контроль антимикробного теста (пептид, обладающий антимикробной активностью по отношению к исследуемым микроорганизмам). Таким образом, методом наложения гелей было установлено наличие в анализируемом экстракте фракций катионных белков и пептидов, обладающих антимикробной активностью в отношении грамположительной (Listeria monocytogenes) и грамотрицатель-ной (Escherichia coli) бактерий.

На следующем этапе выделения и очистки антимикробных пептидов экстракт для дальнейшего фракционирования был подвергнут препаративному электрофорезу в кислой буферной системе в присутствии мочевины.

2 1

1 2

flitl

ВВЦ

ИИ

|щ||||

ни

щ

III

в

Рис. 1. Результаты антимикробного теста катионных белков и пептидов экстракта лейкоцитов собаки.

1 - анализируемый кислотный экстракт; 2 - NP-1 (а-дефенсин-1 кролика) - АП, положительный контроль. А - электрофореграм-ма белков кислотного экстракта лейкоцитов собаки; БиВ- результаты определения антимикробной активности белков исследуемого экстракта методом наложения полиакриламидных гелей после электрофореза в кислой буферной системе на агарозные гели, содержащие грамотрицательную бактерию Escherichia coli и грампо-ложительную бактерию Listeria monocytogenes.

Фракции, содержащие белковый материал (наличие белков и пептидов определяли спектрофотометрически: по поглощению при длине волны =280 нм), были протестированы на наличие антимикробной активности по отношению к Listeria monocytogenes (грам-положительной бактерии), Escherichia coli (грамотрицательной бактерии) и Candida albicans (низшего гриба) методом радиальной диффузии в луночном антимикробном тесте (рис. 2). В вышеуказанных фракциях с помощью электрофореза в присутствии доде-цилсульфата натрия были определены также молекулярные массы белковых компонентов, которые варьировали от 3 до 14 кДа.

Рис. 2. Профиль элюции препаративного электрофореза в полиакриламидном геле в кислой буферной системе кислотного экстракта лейкоцитов собаки белков. Сила тока 30 мА, скорость элюции 32 мл/ч, объем фракций 4.5 мл.

Для дальнейшей очистки антимикробных пептидов из фракций 30-45, которые обладали максимальной антимикробной активностью, использовались хроматографические методы: обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография и последующая гель-фильтрация. После каждого этапа фракции тестировались на наличие антимикробной активности и гомогенность. Объединенные фракции 30-36 разделяли методом ОФ ВЖХ (рис. 3, А). Затем из полученных фракций 32 и 35 с помощью нескольких повторных циклов хроматографии в более пологих градиентах ацетонитрила и метода гель-фильтрации удалось выделить пептиды 1 и 2 соответственно (рис. 3, Б, В).

А

2.00 п

¡а я о

н

«

£ S

а о н

1)

Рис. 3. Результаты ОФ ВЖХ на колонке Supelco С18 (4.6x250 мм; диаметр частиц сорбента 5 мкм).

А - профиль элюции объединенных после препаративного электрофореза фракций 32-36; стрелками отмечены фракции (32 и 35), которые были подвергнуты дальнейшей рехроматогра-фии. Б - профиль элюции рехроматографии фракции 35; стрелкой показан пик, который соответствует Пептиду 2. В - профиль элюции рехроматографии фракции 32; стрелкой показан пик, который соответствует Пептиду 1.

в

0.50 0.40

g 0.30 я

V

а

2 0.20 5

о С

0.10 0.00 -0.10 J

15

20

г 35

-■30

Си н

о

+ 25 S

--20

?i5 -•15

25 30 35" Время, мин Продолжение рис. 3.

Антимикробная активность исследуемых пептидов из лейкоцитов собаки

Антимикробная активность, усл. ед.

Микроорганизмы Пептиды из лейкоцитов собаки Стандартный пептид

Пептид 1 Пептид 2 NP-1

Грамположителъная бактерия (.Listeria monocytogenes EGD) 41 55 40

Грамотрицательная бактерия (.Escherichia coli ML35p) 62 55 52

Низший гриб (<Candida albicans 820) 36 30 35

Таким образом, нам удалось выделить два АП, обладающих атимикробной активностью по отношению грамположительной и грамотрицательной бактериям, а также в отношении низшего гриба Candida albicans (таблица).

Исследуемые пептиды были подвергнуты окислению надмуравьиной кислотой, которая разрывает дисульфидные связи, окисляет образовавшиеся сульфгидрильные (SH-группы) до сернистокислых групп (S03H) и как следствие изменяет суммарный заряд пептида и его конформацию, следовательно, и его электрофоретическую подвижность, что можно установить с помощью электрофореза в кислой буферной системе. Однако обработанные надмуравьиной кислотой исследуемые пептиды не изменили свою электрофоретическую подвижность к катоду по сравнению с необработанными образцами, что свидетельствует об отсутствии дисульфидных связей в молекулах пептидов.

Молекулярная масса данных пептидов по результатам электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия составила приблизительно 4 кДа (рис. 4).

Обсуждение результатов исследования. Антимикробные пептиды, обнаруженные в лейкоцитах многих видов животных, - это важные компоненты врожденного иммунитета. Они являются физиологически активными веществами, участвующими в реализации защитных реакций при фагоцитозе, воспалении и стрессе. Характерной чертой АП

являются амфипатичность и суммарный положительный заряд, который способствует их взаимодействию с отрицательно заряженной клеточной поверхностью патогенных микроорганизмов [3].

■iC |

ПН

шт

мс

кДа - 20 14

■■и ¡■ill

Рис. 4. Электрофореграмма пептидов 1 (Л) и 2 (Б) из лейкоцитов собаки.

Электрофорез был проведен в присутствии додецилсульфата натрия по методу Шаггера и фон Джагова.

МС - набор маркеров с известной молекулярной массой («Sigma», США), состоящий из следующих белков: 3000 Да (инсулин (а и b цепи)), 6200 Да (ингибитор трипсина быка), 14300 Да (лизоцим). Стрелками указаны очищенные из лейкоцитов собаки пептиды 1 и 2.

Схема выделения и очистки пептидов [7], используемая в Лаборатории химии белка СПбГУ, позволила нам обнаружить кислоторастворимые пептиды в экстракте лейкоцитов собаки, которые обладают антимикробной активностью по отношению к грамположи-тельной (Listeria monocytogenes) и грамотрицательной (Escherichia coli) бактериям, а также активны в отношении низшего гриба (Candida albicans).

Молекулярная масса очищенных нами пептидов, как и у большинства АП, составляет приблизительно 4 кДа.

Несомненный интерес представляет выяснение принадлежности исследуемых пептидов к определенному семейству АП млекопитающих (семейству дефенсинов, кателицидинов или группе пептидов, которые являются продуктами ограниченного протеолиза белков) [17].

Электрофоретическая подвижность данных пептидов по отношению к катоду в кислой буферной системе сравнима с подвижностью лизоцима из нейтрофильных грануло-цитов собаки. Многие АП обладают большей электрофоретической подвижностью, чем лизоцим, но некоторые, такие, как дефенсины человека, имеют сходную электрофорети-ческую подвижность с вышеуказанным белком [3].

Дисульфидные связи в молекуле исследуемых пептидов не были обнаружены. Это дает нам основание предположить, что данные пептиды не относятся к семейству дефенсинов, которые содержат в своей молекуле шесть остатков цистеина, формирующих три внутримолекулярные дисульфидные связи [5]. Следует заметить, что в клетках красного костного мозга собаки не экспрессируются гены р-дефенсинов [12], а-дефенсины обнаружены только у грызунов и у приматов, а 9-дефенсины - только у приматов [17], Из вышесказанного можно сделать вывод, что дефексины, скорее всего, не синтезируются в лейкоцитах собаки.

Возможно, выделенные нами пептиды являются представителями другого широко распространенного у млекопитающих семейства антимикробных пептидов, семейства кателицидинов. Ряд кателицидинов, такие, как протегрины свиньи, додекапептид коровы, содержат в своей молекуле дисульфидные мостики, однако другие представители этого семейства, такие, как кателицидины мыши и человека, не формируют внутримолекулярные

дисульфидные связи [3]. Следует заметить, что ген одного из возможных кателицидинов недавно был обнаружен у собаки [ 13]. Исходя из структуры гена установлено, что молекула зрелого кателицидина не должна содержать дисульфидные мостики, так как остатки цисте-ина в данной молекуле отсутствуют. Однако значение молекулярной массы предполагаемого кателицидина немного больше, чем очищенных нами пептидов, и составляет 4.5 кДа.

Не исключено, что исследуемые пептиды собаки могут быть представителями третьей группы АП, которые являются продуктами ограниченного протеолиза различных белков. В последнее время появляется все больше информации о таких АП. Установлено, что пептиды, представляющие собой фрагменты белков системы врожденного иммунитета (лактоферрина, катепсина G и азуроцидина), могут проявлять антимикробную активность, иногда даже более сильную, чем исходный белок [9]. Однако наибольшее число производных известно для гистонов. Способность самих гистонов проявлять антимикробную активность установлена давно. Появляется все больше данных о выделенных из различных объектов антимикробных фрагментов гистонов. В частности, такие АП, как буфорин, паразин и гипнозин, являются производными гистона Н2А [11]. В активированных гранулоцитах человека обнаружен пептид, обладающий сильной антимикробной активностью и представляющий собой фрагмент гистона HI А [15]. Однако вопрос о происхождении данных фрагментов, их клеточной локализации и их роли в защитных реакциях до сих пор остается открытым.

Для того чтобы точно определить, к какой группе АП относятся выделенные пептиды, необходимо установить их первичную последовательность, что нами и планируется сделать.

Summary

Korableva Е., Berlov М., Andreeva Y., Kokryakov V. Antimicrobial peptide from canine leukocytes: structural-functional properties.

Antimicrobial peptides play an important role in innate immunity of different species. The aim of this work was to find and investigate structural-functional properties of antimicrobial peptides from canine leukocytes. Using a preparative electrophoresis method and different types of chromatography we isolated two antimicrobial peptides from an acidic extract of canine leukocytes which had antimicrobial activity against gram negative, gram positive bacteria and fungus. Molecular masses of both peptides were 4 kD. These peptides don't have disulphide bridges.

E-mail: 3214014@gmail.com Литература

1. Берлов M. H., Кораблева Е. С., Андреева Ю. В., Овчинникова Т. В., Кокряков В. Н. Лактофер-рин из нейтрофилов собаки: выделение, физико-химические и антимикробные свойства // Биохимия. 2007. Т. 72. № 4. С. 551-559. 2. Берлов М. Н., Лодыгин П. А., Андреева Ю. В., Кокряков В. Н. Выделение и некоторые физико-химические свойства эластазы и катепсина G из нейтрофилов собаки // Биохимия. 2001. Т. 66. № 9. С. 1238-1244. 3. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 4. Торчинский Ю. М. Сера в белках. М.,1977. 5. Ganz Т., Selsted М. Е., Szklarek D., Harwig S. S., DaherK., Bainton D. F., Lehrer R, I. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils //J. Clin. Invest. 1985. Vol. 76. P. 1427-1435. 6. Harwig S. S., Chen N. P., Park A. S. K., LehreerR. I. Purification of bioactive cysteine-rich peptides from leukocytes by continuous acid-urea polyacrilamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol. 208. Pt. 2. P. 382-346. 7. Kokryakov V. N., Harwig S. S. L., Panyutich E. A., Shevchenko A. A., Aleshina G. M., Shamova О. V,, Komeva H. A., Lehrer R. I. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins snd fachyplesins // FEBS Lett. 1993. Vol. 327. N2. P. 231-236. 8. LehrerR. I., Rosenman M., Harwig S. S., Jackson R., EisenhauerP. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides //J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173. 9.Levy O. Antibiotic proteins of

polymorphonuclear leukocytes // Eur. J. Haematol. 1996. Vol. 56. N3. P. 263-277. 10. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Atcr. Biochem. and Biophys. 1969. Vol. 130. N 2. P. 337-346.11. Parseghian M. H., LuhrsK.A. Beyond the walls of the nucleus: the role of histones in cellular signalind and innate immunity // Biochem. Cell Biol. 2006. Vol. 84. P. 589-604.

12. Sang Y., Ortega M. T., Blecha F., Prakash O., Melgarejo T. Molecular Cloning and Characterization of Three p-Defensins from Canine Testes // Infect. Immun. 2005. Vol. 73. N5. P. 2611-2620.

13. Sang Y., Rune K., Melgarejo T., Blecha F. 2003. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list_uids=442947.14. SchaggerH., vonJagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa //Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. Pt. 2. P. 368-379.15. Wang Y., Griffiths W.J., Jornvall H., Agerbeth B., Johansson J. Antibacterial peptides in stimulated human granulocytes. Characterization of ubiqutinated histone H1A // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 512-518. 16. Wolf P. A critical reappraisal of Waddell's technique for ultraviolet spectrophotometric protein estimation // Anal. Biochem. 1983. Vol. 129. P. 145-155. 17. Yang D., Biragin A, Hoover D. M„ Lubkovski J., Oppenheim J.J. Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in host defense // Annu. Rev. Immunol. 2004. Vol. 22. P. 06.1-06.35.

Статья принята к печати 19 февраля 2007 г.