CC BY
88
Ревин В.В. *, Атыкян Н.А. *, Костина Е.Г. *, Гоготов И.Н. **
*Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева, Саранск **Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино
ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЯ НА ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА ЛИПИДОВ КЛЕТОК ЙНОйОСОССиБ ЕЙУТНЙОРОИБ АС-858 Т В ПРОЦЕССЕ ПЕРИОДИЧЕСКОГО И ПОЛУНЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА СРЕДАХ С РАЗЛИЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ ГЕКСАДЕКАНА
Исследовано накопление суммарных липидов и изменение фосфолипидного состава в клетках ЙЬобососсив ег^ЬгороПв ВКМ Ас-858 Т в зависимости от концентрации ионов Ca2+ и гексаде-кана в питательной среде. Показано, что для роста и накопления липидов этой бактерии на модифицированной среде Таусона оптимальное содержание Ca2+ составляет 4 мг/л, а гексадекана 1%. В процессе культивирования качественный состав фосфолипидов не меняется, однако наблюдается изменение их количественного соотношения. Оптимизированная среда была использована для полунепрерывного культивирования бактерий отъемно-доливным методом с целью получения максимального выхода биомассы и липидов, что было достигнуто при 60% насыщении кислородом среды.
Ключевые слова: ЙЬобососсив ег^ЬгороПв, фосфолипиды, общие липиды, гексадекан.
Введение
В настоящее время бактерии рода Rhodococcus привлекают все большее внимание, вследствие их широкого практического использования. Они играют важную роль в процессах почвообразования, в обогащении биоценозов витаминами и другими физиологически активными соединениями [5], а созданные на их основе препараты используются в биоремедиации окружающей среды от ксенобиотиков, повышении нефтеотдачи почвенных пластов, очистке сточных вод от нефтепродуктов и т.д. [12,17]. Способность этих бактерий эмульгировать и деградировать углеводороды в значительной степени обусловлена особенностями строения их клеточной оболочки, содержащей липи-ды [16], от состава и метаболизма которых зависит также и адаптация этих микроорганизмов к неблагоприятным факторам [4]. Известно, что состав липидов клеточных мембран родококков и их суммарное содержание существенно изменяются в ходе развития клеток [2]. Также выявлено, что содержание липидов в клетках родококков изменяется в зависимости от используемых источников углерода [14, 15]. Однако, в отношении других факторов, влияющих на синтез липидов бактериями рода Rhodococcus известно недостаточно. Важную роль в синтезе липидов играют ионы металлов, в частности ионы кальция. Показано, что лимитирование по кальцию приводит к увеличению
синтеза липидов у Pseudomonas aeruginosa и P. fluorescens [10].
Целью настоящей работы являлось выяснение влияния концентрации ионов кальция и гексадекана в среде культивирования на ли-пидный состав клеток Rhodococcus erythropolis Ас-858 Т и его изменение в процессе роста, а также отработка условий полунепрерывного культивирования этих бактерий на оптимизированной среде с целью получения прототипа биопрепаратов.
Методы исследования
Объектом исследования служили бактерии Rhodococcus erythropolis штамм ВКМ Ас - 858 Т, полученная из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Культуру поддерживали на агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 5,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 3; К2НРО4 - 0,2; агар -20, рН 7,0. В опытах по исследованию влияния концентрации ионов кальция и гексаде-кана в среде культивирования на рост и образование липидов бактерией R. erythropolis использовали модифицированную среду Таусо-на, следующего состава (г/л): К2НРО4 - 0,5;
MgSO4 - 1,0; (NH4)2SO4 - 4,0; NaCI - 30, рН 7,0.4 4 2 4
На первом этапе бактерии R. erythropolis выращивали при различных концентрациях Ca2+ в среде с 1% гексадекана (V/V), а затем на фоне оптимального варианта по кальцию исследовали влияние концентра-
ции гексадекана как единственного источника углерода на рост и образование липи-дов. Посевным материалом служила двухсуточная культура, выращенная на мясопеп-тонном бульоне. Инокулят с ОП600, равной 0,05, в количестве 5 мл добавляли в опытные колбы объемом 250 мл, содержащие по 100 мл минеральной среды. Культивирование проводили в течение 8 суток при 280С на термостатируемой качалке (235 об/мин). Из культуральной жидкости каждые два дня отбирали пробы, в которых определяли биомассу гравиметрическим методом и содержание общих экстрагируемых липидов (ОЭЛ) в клетках по методу Блайя-Дайэра [1]. Разделение липидов проводили методом двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах Брокхьюза: 1) хлороформ - метанол-28%-ный аммиак-вода (90:54:5:8), 2) хлороформ- метанол-ледяная уксусная кислота - вода (90:40:10:4) [9]. На пластинку наносили 600 мкг липидов. Хроматограммы опрыскивали 5%-ной серной кислотой в метаноле с последующим нагреванием при 1800С до проявления пятен. Идентификацию отдельных фосфолипидов проводили с помощью специфических реагентов [19]. Количественное определение фосфолипидов проводили по методу, описанному в работе [18]. Полунепрерывное культивирование осуществляли по отъемно-доливному методу с использованием модульного биотехнологического оборудования серии ОКА-М1 МФ-05К на оптимизированной среде в 2-х реакторах объемом 1л (объем среды 0,5л), в условиях различной степени насыщения среды кислородом (20-60%). Отбор проб производили через 5, 9ч и далее каждые 24ч. В пробах определяли биомассу гравиметрическим методом, внеклеточный белок по методу Бредфорда [8], в конечных сливах определяли ОЭЛ. Время культивирования составило 4 суток, после чего производили слив культуральной жидкости, оставив в качестве инокулята 5-10% от первоначального объема. Долю эмульгированного и растворенного гексадекана в пробах определяли ИК-фотометрическим методом с помощью концентратомера «КН-2м» (Россия) (ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000). Все результаты, полу-
ченные не менее чем в пяти параллельных опытах, подвергали статистической обработке.
Результаты и обсуждение
На первом этапе при изучении влияния Са2+ на рост Я. втуЬНтороЫ варьировали его содержание в среде от 2 до 120 мг/л. В качестве контроля служила среда без СаС12. Исследование влияния ионов Са2+ на рост и образование липидов клетками Я. втуЬктороИз ВКМ Ас - 858Т показало, что как в контрольном, так и во всех опытных вариантах наиболее быстрый прирост биомассы наблюдался до четвертых суток культивирования (рисунок 1). Начиная с 6 суток происходило снижение уровня биомассы, что совпадало с началом литических процессов. Наибольшее содержание липидов было в 6-суточных клетках. Сопоставление опытных и контрольного варианта показало, что при отсутствии Са2+ в питательной среде
5S О
а
S о я W
2 4 6 8 10
Время культивирования, сутки (а)
л ч и
и
и л е и
3
ю О
20 15 10 5 0
10
Время культивирования, сутки (б)
Рисунок 1. Влияние концентраций Са2+ и гексадекана в ростовой среде на накопление биомассы (а) и образование общих липидов (б) клетками Я. втуЬктороИз Ас-858 Т (1 - контроль (0 мг/л Са 2+); 2 -4 мг/л Са 2+, 1% гексадекана; 3 - 5% гексадекана; 4 - 10% гексадекана)
выход биомассы был незначительным, а добавление ионов кальция стимулировало рост бактерий. Максимальный выход биомассы и накопление клеточных липидов были почти в 1,5 раза больше в среде с 4 мг/л ионов Са2+, по сравнению с контролем (рисунок 1). Дальнейшее увеличение содержания ионов Са2+ в среде культивирования вызвало снижение выхода биомассы и содержания общих липидов.
Таким образом, низкое содержание в среде ионов Са2+ (2-4 мг/л) стимулирует рост и накопление общих липидов культурой R. erythropolis, тогда как высокое несколько ин-гибирует. Наблюдаемый эффект вполне согласуется с полученными другими авторами данными для других микроорганизмов. Так, показано, что низкие концентрации солей магния и кальция стимулируют более высокое накопление липидов у P. aeruginosa DSM 2659 [11].
Наблюдаемый эффект по влиянию CaCl2 на липидсинтезирующую активность R. erythropolis может иметь следующий механизм. Как известно поступление ионов Са2+ в клетку происходит по кальциевым каналам. Внутри клетки Са2+ является универсальным вторичным мессенджером и участвует в ряде важных метаболических процессов, в том числе и синтезе АТФ, в активации протеинкиназы С, фосфолипаз А2 и С [3,7]. Таким образом Са2+ необходим для жизнедеятельности клеток, однако стимулирующий эффект кальция наблюдается до определенных концентраций. Это связано с тем, что для нормального функционирования клетки необходима низкая концентрация ионов кальция, в то время как накопление кальция в цитозоле приводит к гибели клетки [3], что мы и наблюдали в наших опытах с высокими концентрациями Са2+.
Изучение фракционного состава общих липидов показало, что в зависимости от фазы роста R. erythropolis доля нейтральных липидов составляла 88-98%, а фосфолипидов - 212%. В процессе роста доля нейтральных липидов увеличивается, а содержание фосфоли-пидов снижается, что согласуется с данными других авторов [13, 20]. Сопоставление данных по общим липидам и фосфолипидам выявило, что их доля практически не зависит от концентрации Са2+ в среде и лишь при кон-
центрации 4 мг/л Са2+ их доля немного выше (на 10-15%), что в принципе может быть отнесено к ошибке опыта. Известно, что фосфо-липиды, входящие в состав клеток, выполняют функциональную роль, регулируют мембранный транспорт, процессы окислительного фосфорилирования, отдельные стороны метаболизма клеток и т.д. Проведенные нами исследования качественного и количественного состава фосфолипидов клеток выявили наличие дифосфатидилглицерина (ДФГ), фосфатидилглицерина (ФГ), фосфатидилэта-ноламина (ФЭА), фосфатидилсерина + фос-фатидилинозита (ФС + ФИ). Рост бактерии во всех вариантах опыта сопровождался изменениями в соотношении фосфолипидов, но не их качественного состава. Показано (рисунок 2), что доля фракции ДФГ увеличивается - количество значительно возрастало в стареющих клетках (на 55% в контрольном и на 32-33% в вариантах с 4 и 6 мг/л Са2+). Сопоставление динамики изменения содержания ФС + ФИ в контроле и опытных вариантах выявило также почти двукратное увеличение их доли, так например, в опыте с добавлением 4 мг/л Са2+ от 26 до 43%. Как известно, ФИ выполняют в клетке регуляторную функцию, участвуют в фосфоинозитидном пути передачи сигнала. Активация фосфолипазы С в данном процессе происходит под влиянием Са2+. Под действием этого фермента фосфатидили-нозитол-4,5-дифосфат расщепляется на ино-зитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерин. Последний участвует в активации протеин-киназы С. Этот фермент фосфорилирует целую серию белков по сериновым и треонино-вым остаткам и играет первостепенную роль в процессе передачи сигнала. Для проявления активности протеинкиназы С нужны Са2+ и ФС. При этом, вероятно, чем выше содержание ФС в клетке, тем больше связывается Са2+, что согласуется с нашими данными, поскольку клетки, выращенные на среде с высокими концентрациями Са2+, характеризуются более высокой долей фракции ФС+ФИ. Содержание ФЭА наоборот снижалось в зависимости от возраста культуры. Согласно имеющихся данных, наличие в клетках значительных количеств ФЭА свидетельствует о фазе активного роста, когда активно протекает образование мембран, и происходит ак-
тивация процессов клеточного метаболизма [6]. Из полученных нами данных видно, что в контрольном варианте доля ФЭА постепенно снижалась с 44 до 19%, в варианте с 4 мг/л Са2+ - с 56 до 34%. Следовательно последний вариант характеризуется более активными ростовыми и метаболическими процессами, что коррелирует и с другими данными.
Используя среду с 4 мг/л Са2 в качестве основы, на следующем этапе мы варьировали концентрацию гексадекана от 1 до 10% (V/V). Проведенное исследование показало (рисунок 1 а), что при добавлении 1 и 5% гексадекана
70 60 50 -40 -
Ц
в 30 -20 -10 -0
ДФГ
(а)
ГШ
ФС+ФИ
(б)
ДФГ
ФГ ФЭА ФС+ФИ
70 п 60 50 -40 30 -20 10 0
(в)
ГЪ I I
□ 1 □ 2
ДФГ
ФГ ФЭА ФС+ФИ
(г)
Рисунок 2. Изменение фосфолипидного состава клеток Я. втуЬктороИз Ас-858 Т на вторые (а), четвертые (б), шестые (в), восьмые (г) сутки (1- контроль; 2 -4 мг/л Са2+)
динамика прироста биомассы и накопления общих клеточных липидов была сходной. При этом выход биомассы был на 30% выше в варианте с добавлением 1% гексадекана. Увеличение содержания гексадекана до 10% приводило к снижению физиологической активности культуры. Возможно, это связано с дестабилизацией мембраны в ходе растворения гек-садекана в липидном бислое и нарушением, прежде всего, транспортных процессов. Максимальное содержание общих клеточных ли-пидов в клетках Я. втуЬктороИз Ас-858 Т наблюдалось на 6 сутки роста в вариантах с 1 и 5% гексадекана (рисунок 1 б). При этом в варианте с 1% гексадекана их содержание было немного выше. При добавлении в среду максимальной концентрации гексадекана синтез липидов ингибировался и их содержание в клетках было почти в 2 раза ниже, что подтверждает ранее сделанный вывод.
Анализ фосфолипидного состава показал (рисунок 3), что увеличение концентрации гексадекана в среде до 5-10% приводило к более высокому содержанию фракций ДФГ и ФГ в клетках Я. втуШтороНз, по сравнению с культурой, выращенной на среде с 1% гекса-декана. Для клеток, выросших на среде с 1% гексадекана, характерно более высокое содержание ФЭА. В варианте с 5% гексадекана доля ФЭА в процессе роста снижалась с 38,1 до 21,3%, в варианте с 10% - с 32,1 до 19,3%. Содержание ДФГ к 8 суткам возрастало более, чем в 1,5 раза. Доля суммарной фракции ФС + ФИ увеличивалась в варианте с 5% гексадекана с 37,4 до 48,4%, в варианте с 10% - с 40,3 до 47%.
Используя оптимизированный на первом этапе вариант среды, дальнейшую оптимизацию условий проводили на ферментационной установке ОКА-М1 МФ-05К с автоматическим контролем параметров среды при помощи ЭВМ.
Результаты проведенных исследований по полунепрерывному культивированию бактерий Я. втуЬНтороНз показывают (таблица 1), что максимальный прирост биомассы как при 20%-ном, так и при 60% насыщением среды кислородом на всех трех стадиях культивирования наблюдается через 24 часа, после чего происходит снижение скорости роста и накопления биомассы, при этом пик накопления
биомассы происходит при использовании 5% инокулята. Снижение абсолютной скорости роста в обоих вариантах к 3 суткам культивирования при использовании 10% инокулята, вероятно, связано с накоплением продуктов метаболизма и их ингибированием микроорганизмов. С этими данными коррелирует и динамика изменения содержания белка, так наиболее высокое содержание белка наблюдалось в течение первых часов культивирования, далее происходило значительное уменьшение данного показателя (таблица 1). При этом максимальное содержание внеклеточного белка наблюдалось на первые сутки второй стадии культивирования, что подтверждает сделанный ранее вывод о том, что оптимальным вариантом отъемно-доливного культивирования на среде с гексадеканом является использование 5% инокулята в условиях 60% насыщения среды кислородом.
В результате наших исследований по убыли доли растворенного и эмульгированного гексадекана в процессе отъемно-доливного культивирования, получены данные, свидетельствующие об уменьшении его на протяжении всего времени культивирования (рисунок 4). При этом убыль доли растворенного и эмульгированного гексадекана практически пропорциональна степени насыщения среды кислородом и максимальна при 60%-ном насыщении. Это связано с тем, что с увеличением концентрации кислорода, растворенного в питательной среде, увеличивается, вероятно, и активность монооксигеназы, а, соответственно, и степень окисления гексадекана.
ДФГ
ДФГ
ДФГ
60 -|
50 -
о 40 -S?
ч 30 -©
20 -10 -0
ДФГ
ФГ
ФЭА
ФС+ФИ
(а)
ФГ
ФЭА ФС+ФИ
(б)
ФГ
ФЭА ФС+ФИ
(в)
ФГ
ФЭА
ФС+ФИ
(г)
□ 1
52
53
Рисунок 3. Изменение фосфолипидного состава клеток R. erythropolis Ас-858 Т при культивировании на средах с различными концентрациями гексадекана на вторые (а), четвертые (б), шестые (в), восьмые (г) сутки роста (1 - 1% гексадекана; 2 - 5% гексадекана;
3 - 10% гексадекана).
Таблица 1. Влияние степени аэрации на рост R. erythropolis Ас-858 Т в условиях полунепрерывного
культивирования
Время культивирования, ч Биомасса, г/л Белок, мг/мл
20% 02 60% 02 20% 02 60% 02
24 15,06±0,75 14,26±0,71 0,025±0,001 0,009±0,0005
48 19,27±0,96 12,18±0,60 0,057±0,003 0,027±0,001
72 18,51±0,93 22,96±1,15 0,135±0,006 0,115±0,005
120 6,23±0,31 6,98±0,35 0,072±0,003 0,093±0,004
Инокулят 10%
24 22,14±1,11 20,09±1,00 0,256±0,013 0,263±0,013
72 29,56±1,49 28,96±1,45 0,235±0,011 0,251±0,012
96 13,01±0,65 10,45±0,52 0,100±0,005 0,104±0,005
Инокулят 5%
24 15,82±0,79 8,82±0,44 0,277±0,013 0,101±0,005
48 19,96±1,00 14,73±0,73 0,150±0,007 0,230±0,011
72 25,02±1,25 15,78±0,79 0,099±0,005 0,191±0,009
96 14,06±0,70 7,54±0,38 0,085±0,004 0,138±0,006
Таблица 2. Содержание отдельных фракций фосфолипидов, в% от общих липидов в культуре R. erythropolis BKM Ac-858 T
Фракции фосфолипидов 20% насыщение среды кислородом 60% насыщение среды кислородом
1 этап 2 этап 3 этап 1 этап 2 этап 3 этап
ДФГ 8,0±0,4 8,5±0,4 9,0±0,5 5,8±0,3 7,8±0,3 8,0±0,3
ФС+ФИ 42,5±2,1 43,2±1,9 44,6±2,1 35,7±1,7 37,1±1,8 38,4±1,8
ФЭА 34,4±1,7 33,6±1,7 32,1±1,5 39,6±1,9 35,1±1,7 33,9±1,6
ФГ 16,1±0,8 14,7±0,7 14,3±0,6 18,9±0,9 20,0±0,9 19,7±0,9
s о
1-й
о я я
<и &
о я н
о
ш &
Таким образом, проведенные исследования показали, что в процессе полунепрерывного культивирования Я. етуЬНтороИэ в данных условиях максимальная скорость роста и убыли растворенного и эмульгированного гек-садекана наблюдается уже в первые сутки культивирования при использовании 5% инокулята и при 60% насыщении среды кислородом.
При исследовании содержания кле- | точных липидов, было обнаружено, что количество ОЭЛ при росте культуры на модифицированной среде Таусона существенно не изменялось. При изучении изменения количественного соотношения фракций фосфолипидов в процессе роста на среде с гексадеканом было обнаружено, что в целом характер изменения содержания фосфолипидов имеет сходные тенденции. Так ФС+ФИ во всех вариантах опыта повышается со временем культивирования, а содержание ФЭА падает. Доля ФЭА в клетках практически не зависела от условий аэрации биомассы (таблица 2). ДФГ И ФГ практически не изменялось в процессе культивирования.
Таким образом, оптимальной для роста и проявления липидсинтезирующей активности штаммом Я. етуШтороИз Ас - 858 Т является среда, содержащая 1% гексадекана и 4 мг/л Са2+. Установлено, что рост этой бактерии сопровождается изменениями в количественном соотношении отдельных фракций фосфолипидов без изменения их качественного состава. При этом доля фосфатидилэтано-
100 90 80 70 60 50 40 30
М 20
>
10 0
24 48 72 96 24 72 96 24 48 72 96 Время культивирования, ч
Ш 1 D2
Рисунок 4. Влияние степени насыщения кислородом
на изменение доли растворимого и эмульгированного гексадекана при росте культуры R. erythropolis (1- 20% насыщение среды кислородом; 2- 60% насыщение среды кислородом)
ламина снижается, в то время как доля дифос-фатидилглицерина и объединенной фракции фосфатидилсерина и фосфатидилинозита возрастает. В условиях полунепрерывного культивирования увеличение степени аэрации до 60% приводит к интенсификации процессов метаболизма и получению более активной клеточной массы, накапливающей до 11,3% общих липидов (от сырой биомассы). При этом изменения в фосфолипидном составе аналогичны как и на первом этапе культивировании. Данный вариант может служить прототипом для получения нефтеокисляющих препаратов.
Список использованной литературы:
1. Кейтс М. Техника липидологии.- М.: Мир, 1975. - 324с.
2. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1984.- 160 с.
3. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Курилова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации. - СПб.: Изд-во С. Петерб. Ун-та, 2003. - 208 с.
4. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Рычкова М.И., Чумаков О.Б. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков // Микробиология. - 2000. - Т.69.-№1. - С. 62-69.
5. Нестеренко О.А., Квасникова Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. - Киев: Наукова думка, 1985. - 336 с.
6. Феофилова Е.П., Бурлакова Е.Б., Кузнецова Л.С. Значение реакций свободнорадикального окисления в регуляции роста и липидобразования эукариотных и прокариотных организмов // Прикладная биохимия и микробиология. -1987. - Т.23.- №1. - С.3-13.
7. Berridge M.J., Bootman M.D., Lipp P. Calcium - a life and death signal // Nature.- 1998. - V. 395. - P.645-648.
8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-bye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248 - 254.
9. Broekhuyse R.M. Phospholipids in tissues of the eye. I. Isolation, characterization and quantitative analysis by two-dimensional thin-layer chromatography of diacyl and vinyl-ether phospholipids // Biochim. Biophys. Acta. - 1968. - V.559. - №4. - P. 307-315.
10. Chayabutra C., Wu J., Ju L.K. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa unger denitrification: effects of limiting nutrients and carbon substrates // Biotechnol. Bioeng. - 2001. - V. 72.- P. 25-33.
11. Desai J.D., Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol. and Mol. Biol. Rev. - 1997. - V.61. - №1. - P.47-64.
12. Jung I.G., Park C.H. Characteristics of Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1 for the biodegradation of benzene, toluene, m-xylene (BTX), and their mixtures // J. Biosci. Bioeng. - 2004. - V.97. - №6. - P. 429-431.
13. Packter N.M., Olukoshi E.R. Ultrastructural studies of neutral lipid localisation in Streptomyces // Arch. Microbiol. -1995. - V.164. - P.420-427.
14. Sikkema J., Bont J. A., Poolman B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons // Microbiol. Rev. - 1995. - V. 59. -№2. - P. 201-222.
15. Sokolovski I., Rozenberg R., Riez C., Rouxhet P.G., Agathos S.N., Wattiau P. Carbon source-induced modifications in the mycolic acid content and cell wall permeability of Rhodococcus erythropolis E1 // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. -
V. 69. - №12. - P. 7019-7027.
16.Tsitko I.V., Zaitsev G.M., Lobanok A.G., Salkinoja-Salonen M.S. Effect of aromatic compounds on cellular fatty acid composition of Rhodococcus opacus // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. - №2. - P. 853-855.
17. Van Hamme J.D., Ward O. P. Physical and metabolic interactions of Pseudomonas sp. strain JA5-B45 and Rhodococcus sp. strain F9-D79 during growth on crude oil and effect of a chemical surfactant on them // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. -V. 67. - №10. - P. 4874-4879.
18. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis // J. Chromatogr. - 1975. - V. 114. - P. 129-141.
19. Vaskovsky V.E., Latyshev N.A. Modified Jungnickel's reagent for detecting phospholipids and other phosphorus compounds on thin-layer chromatograms // J. Chromatogr. - 1975. - V. 115. - P. 246-249.
20. Waltermann M. A., Hinz A., Robenek H., Troyer D., Reichelt R., Malkus U., Galla H.J., Kalscheuer R., Stoveken T., Landenberg P., Steinbuchel A. Mechanism of lipid body formation in bacteria: how bacteria fatten up // Mol. Microbiol. - 2005. - V.55. -P.750-763.
Работа выполнена при поддержке программы «Развитие научного потенциала высшей школы 2006-2008» РНП.2.1.17708 «Моделирование и кинетический анализ процессов деструкции лигноцеллюлозных субстратов и ксенобиотиков с участием ферментов и липидов»
