CC BY
27
УДК 544.02:66.061.3:577.112 Табл. 1. Ил. 1. Библ. 7.
ВЛИЯНИЕ ИЗОТОПНОГО СОСТАВА ВОДЫ НА ЭКСТРАКЦИЮ БИОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Василевская Е.Р., Федулова Л.В., канд. техн. наук, Котенкова Е.А., канд. техн. наук, Даньшина А.П.
ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
INFLUENCE OF WATER ISOTOPE COMPOSITION ON BIOACTIVE COMPOUNDS EXTRACTION
Vasilevskaya E.R., Fedulova L.V., Kotenkova E.A., Danshina A.P.
The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
вторичное сырье, ВМИС, аминокислота, тканеспеии-фичные пептиды, ВЭЖХ, иммунитет
Реферат
В экстрактах иммунокомпетентных органов свиньи (тимус, селезенка, мезентеральные лимфатические узлы) было обнаружено значительное количество ней-ромедиаторных аминокислот, таких как аспаргиновая и глутаминовая кислоты, глицин (тимус — 10,5 %; 13,7 %; 7,6 %; селезенка — 12,2 %; 10,7 %; 7,8 %; лимфатические узлы — 11,0 %; 13,3 %; 11,1 %, соответственно), обладающих иммунологической и адаптогенной активностью. Использование солюбилизирующего агента на основе воды с модифицированным изотопным составом (D/H = 40 ppm] при выделении биологически активных соединений и им-мунокомпетентных органов свиньи приводит к увеличению содержания аминокислот, в том числе гидрофильных, в экстракте тимуса — до 22 %, селезенки — до 15 %, лимфатических узлов — до 8 %, в сравнении с дистилиро-ванной водой (D/H = 150 ppm). Показано, что экстракция физиологическим раствором на основе ВМИС увеличивает вероятность выделения тканеспецифических соединений (в случае экстракта тимуса — до 65 %) и узкоспецифических пептидов (экстракт селезенки — на 14,3 %, мезентеральные лимфатические узлы — в 2 раза). Были определены в экстракте тимуса (ВМИС) 5 органоспецифических пептидов (предположительно, TTSAPTTS и LRRASLG); для экстракта селезенки (ДВ) — 3 пептида (предположительно, EHFFAL, GGHFFAL, LSPFPFDL); для экстрактов мезентеральных лимфатических узлов (ВМИС и ДВ) — 2 пептида (предположительно, LVVYPW). Снижение содержания дейтерия в солюбилизирующем агенте увеличивает количественное содержание аминокислот, то есть экстракция в водно-солевом растворе на основе ВМИС из тканей с большим содержанием аминокислот с гидрофильными радикалами происходит более полно.
Keywords:
secondary raw material, WMIC, amino acids, tissue specific peptides, HPLC, immunity
Summary
It was found a significant amount of neurotransmitter amino acids, such as aspartic and glutamic acids, glycine (thymus - 10,5 %; 13,7 %; 7,6 %; spleen - 12,2 %; 10,7 %; 7,8 %; lymph nodes - 11,0 %; 13,3 %; 11,1 %, respectively] having the immunological and adaptogenic activity, in extracts of Sus scrofa immunocompetent organs (thymus, spleen, mesenteric lymph nodes]. Application of water with modified isotopic composition as solubilizing agent (D / H = 40 ppm] for extraction of immunocompetent organs' biologically active compounds led to increased amino acid content, including hydrophilic amino acids, in thymus extracts — up to 22 %, in spleen extracts — up to 15 % , in lymph nodes exctracts — up to 8 %, in comparison to distilled water (D / H = 150 ppm]. It is shown that extraction with saline based on WMIC increases the likelihood of tissue-specific compounds (in the case of thymic extract — up to 65 %] and narrowly-specific peptides isolation (spleen extract — up to 14.3 %, mesenteric lymph nodes — twice]. There were identified 5 peptides organ (presumably, TTSAPTTS and LRRASLG] in the extract of the thymus (WMIC]; in spleen extract (DW] — 3 peptide (presumably, EHFFAL, GGHFFAL, LSPFPFDL]; in mesenteric lymph nodes extracts (WMIC and DW] — 2 peptide (presumably, LVVYPW]. Reducing of deuterium content in the solubilizing agent enhances quantitative amino acid content, i.e. extraction in an aqueous- salt solution based on WMIC of animal tissues with a high content of amino acids with hydrophilic radicals proceeded more completely.
настоящее время большая часть исследований в области биотехнологии направлена на получение и изучение биологически активных веществ из продуктов животноводства. При этом, переработка вторичного сырья в пищевой промышленности на данный момент едва превышает 20 % от образующейся массы, несмотря на то, что основная часть этих «отходов» законодательно запрещена к захоронению [3]. Помимо экологического аспекта, в частности, снижения антропогенного воздействия на окружающую среду благодаря рециклингу отходов, практическое значение имеет использование вторичных продуктов убоя для создания пищевых продуктов и добавок, высокоценных кормов для домашних животных, медицинских и косметических средств и препаратов [4].
Индустрия производства природных ветеринарных препаратов с высокой биологической активностью на основе животного сырья для сельскохозяйственных животных находится в России на стадии развития. Это весьма перспективное и динамично развивающееся направление в области углубленной переработки вторичного сырья. Причем, мясная промышленность располагает большим потенциалом для его реализации в связи с разнообразным и уникальным составом основных и вторичных продуктов убоя промышленных животных [5]. Проводимые научные исследования предполагают разработку технологии изготовления ветеринарных средств и выделения биологически активных соединений из малоценного сырья животного происхождения, что может привести к получению более качественной продукции животноводства [6].
Интерес при разработке новых ветеринарных средств оригинальных форм и качественных характеристик для лечения домашних и сельскохозяйственных животных име-
7000
ют малоценные ресурсы, формирующиеся в значительных объемах при первичной переработке скота в условиях мясокомбинатов.
На базе ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова» проводятся исследования с целью создания высокоэффективных природных иммуностимуляторов направленного действия на основе активных видо- и тканеспецифичных биомолекул. Ранее было показано, что ткани и органы сельскохозяйственных животных содержат неспецифические стимуляторы иммунитета [1]. Целью работы являлось изучение возможности использования воды с модифицированным D/H изотопным составом (ВМИС) для ускорения биохимических реакций в процессе получения биологически активных соединений из животных тканей. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00008).
Материалы и методы
Объектами исследования являлись лиофильно высушенные индивидуальные экстракты иммунокомпетентных органов свиней: тимус, селезенка, лимфатические узлы, полученные на основе дистиллированной воды (ДВ) и воды с модифицированным изотопным составом (ВМИС) [2, 7]. Сравнительное исследование специфичности пептидного профиля экстрактов на основе ВМИС и дистиллированной воды проводили на системе высокоэффективной жидкостной хроматографии с трехквадрупольным масс-спектрометром (жидкостной хроматограф AGILENT 1200 C с масс-селективным детектором AGILENT 6410, США). Аминокислотный анализ белков экстрактов проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе типа LC 3000 фирмы «Eppendorf-Biotronic» (Германия).
Asp Glu Ser Gly Thr Arg Ala Tyr Val Phe Ile Leu Lys Pro _Тимус BMИC _Тимус ДB _ Селезенка BMИC _ Селезенка ДB Лимф. узлы BMИC Лимф. узлы ДB Рисунок 1. Сравнительное содержание аминокислот в экстрактах
2016 I №6 ВСЕ О МЯСЕ
Результаты исследования
Выявлено высокое содержание аминокислот в экстракте лимфатических узлов на основе ВМИС. Во всех экстрактах обнаружено значительное количество нейромедиатор-ных аминокислот, таких как аспаргиновая и глутаминовая кислоты, глицин (тимус — 10,5 %; 13,7 %; 7,6 %; селезенка -12,2 %; 10,7 %; 7,8 %; лимфатические узлы — 11,0 %; 13,3 %; 11,1 %, соответственно), обладающих иммунологической и адаптогенной активностью. Важно отметить достаточно высокое содержание аргинина и лизина, вовлеченных в нормализацию иммунного ответа; тирозина и треонина, вовлеченных в адаптогенные механизмы нивелирования стрессовых и депрессивных реакций; серина, аланина, валина, участвующих в образовании активных центров ряда ферментов а также изолейцина, лейцина и пролина, участвующих в энергетическом обмене.
Показано выраженное увеличение количественного содержания гидрофильных аминокислот в экстрактах на основе ВМИС относительно экстрактов на основе дистиллированной воды: в экстракте тимуса — до 22 %, селезенки до 15 %, лимфатических узлов до 8 %, соответственно. Разница в содержании данных аминокислот в экстрактах с разным изотопным D/H составом свидетельствует о положительном влиянии пониженного содержания дейтерия в солюбилизаторе на процесс экстракции в водно-солевом растворе.
Сравнительный анализ белково-пептидного состава исследуемых иммунокомпетентных органов с использованием баз данных UniProt Protein Database и PepBank позволил предположить наличие характерных белков, специфических для животных тканей данного типа (тканеспецифических), содержащих в своей первичной структуре сигнальные пептиды с диапазоном молекулярных масс от 1419,8 Да до 4336,2 Да, а также ряда биомолекул пептидной природы, непосредственно вовлеченных в иммунитет или выполняющих ключевые иммуностимулирующие, сигнальные и транспортные функции. Был обнаружен ряд тканеспецифичных фрагментированных пептидов в экстрактах, приготовленных на основе ВМИС: 8 — в экстракте тимуса, 22 — в экстракте селезенки, 46 — в экстракте мезентеральных лимфатических узлов. Анализ экстрактов на основе дистиллированной воды показал наличие 23 тканеспецифичных пептидов
в экстракте тимуса, 21 — в экстракте селезенки, 31 — в экстракте мезентеральных лимфатических узлов.
Сопоставление полученных пептидных профилей с базой данных PepBank Harvard University (таблица 1) позволило предположить наличие характерных для данного органа (органоспецифических) пептидов в экстрактах (в сравнении с пептидным профилем мышечной ткани свиньи). Для экстракта тимуса (ВМИС) было выделено 5 органоспе-цифических пептидов (предположительно, TTSAPTTS и LRRASLG); для экстракта селезенки (ДВ) — 3 пептида (предположительно, EHFFAL, GGHFFAL, LSPFPFDL); для экстрактов мезентеральных лимфатических узлов (ВМИС и ДВ) — 2 пептида (предположительно, LVVYPW).
Использование ВМИС, в качестве солюбилизирующего агента, позволило обнаружить в экстракте тимуса (ВМИС] 3 пептида, которые не были обнаружены в остальных образцах; в экстракте селезенки (ВМИС) — 7 пептидов (предположительно, FYNQKFKGKATL, MIVTLF, GPPGVTIVK); в экстракте мезентеральных лимфатических узлов (ВМИС) — 22 пептида.
Стоит отметить, что полученные пептидные спектры богаты неидентифицированными биомолекулами.
В результате анализа аминокислотного состава белков, содержащихся в экстрактах, можно предположить, что снижение содержания дейтерия в солюбилизирующем агенте увеличивает количественное содержание аминокислот, то есть экстракция в водно-солевом растворе на основе ВМИС из тканей с большим содержанием аминокислот с гидрофильными радикалами происходит более полно. Этот эффект можно связать со свойствами ВМИС — меньшей прочности и большей длины связи H — О, чем D — О, а также большей степени ионизации. Известно, что гидрофобные радикалы аминокислот имеют тенденцию к объединению за счет гидрофобных взаимодействий и межмолекулярных ван-дер-ваальсовых сил, в результате чего внутри белковой глобулы образуется плотное ядро, которое отрицательно влияет на процесс экстракции. Гидрофильные же ионизированные и неионизированные радикалы влияют на растворимость в экстрагенте, увеличивая степень выхода белковых соединений.
Масс-спектрометрические исследования подтвердили высокую тканевую специфичность исследуемых экс-
Таблица 1.
Пептиды, предположительно идентифицированные [PepBank Harvard University] в экстрактах, и их характеристики
Пептидная последовательность Молекулярная масса, Да Функциональная характеристика
TTSAPTTS 764.36 Способствует гликозилированию белков
LRRASLG 771.47 Способствует фосфорилированию белков
EHFFAL GGHFFAL 762.37 747.37 Соответствует аминокислотным последовательностям катепсинов селезенки
LSPFPFDL 934.48 Является производным альфа-кетоглутаратдегидрогеназы, активирует антигены МНС I класса
FYNQKFKGKATL 1443.79 Стимулирует пролиферацию Т-клеток
MIVTLF 722.40 Являются производными из антигенов МНС I класса
GPPGVTIVK 866.52
LVVYPW 775.43 Является производным энкефалинов, способствует снижению воспалительных реакций
трактов. Обнаружена зависимость пептидных спектров экстрактов иммунокомпетентных органов от D/H состава солюбилизаторующего агента: проведение экстракции с использованием физиологического раствора на основе ВМИС увеличивает вероятность выделения тканеспе-цифических соединений (в случае экстракта тимуса — на 65 %) и узкоспецифических пептидов (экстракт селезенки — на 14,3 %, мезентеральные лимфатические узлы — в 2 раза). Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00008). Ш
© КОНТАКТЫ:
Василевская Екатерина Романовна а Rina715@yandex.ru
Федулова Лилия Вячеславовна а fedulova@vniimp.ru
Котенкова Елена Александровна а lazovlena92@yandex.ru
Даньшина Анастасия Петровна а nastasya_danshina@mail.ru
Котенкова Е.А. Иммунокорригирующее действие тканеспец-ифических пептидов in vivo/ Е.А. Котенкова, Е.Р. Василевская, А.Г. Ахремко// Международная конференция IT+M&E~2016, Гурзуф. - 2016. - С. 221-226.
Irshad A. Abattoir by-Product Utilization for Sustainable Meat Industry: A Review/ A. Irshad, B. D. Sharma // J. Anim. Prod. Adv. - 2015. -№ 5(6). - Р. 681-696.
