CC BY
35
УДК 577.32
Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 2
Л. Р. Алоян\ Г. В. Ананян\ В. И. Варданян">, Е. Б. Далян )
ВЛИЯНИЕ ИОННОЙ СИЛЫ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОРФИРИНОВ С ДНК
Введение. Биологически активные препараты, в том числе и порфирины, проникая в ядро клетки, взаимодействуют непосредственно с ДНК [1] и в последние несколько десятков лет являются объектом интенсивных исследований. Водорастворимые катион-ные порфирины как биологически активные соединения, используемые в фотодинамической терапии злокачественных опухолей, и их нековалентное связывание с ДНК остаются в центре внимания многих ученых во всем мире [2-4]. Препараты, нековалентно взаимодействующие с ДНК, в основном связываются одним из двух механизмов: ин-теркаляцией и минорно-желобковым. Известно, например, что хорошо исследованный л*езо-тетра-(К-метилпиридил)порфирин [ТМРуР], не имеющий аксиального ли-ганда, предпочтительнее взаимодействует с СС-богатыми участками ДНК посредством интеркаляции, а его 2п(П)-содержащая производная, 1пТМРуР, с аксиальным лиган-дом у центрального металла, связывается с ДНК только внешне. Этот тип связывания происходит преимущественно в АТ-богатых участках ДНК. Вообще говоря, механизм связывания порфиринов с ДНК зависит от условий эксперимента: ионной силы (ц) и рН раствора, структуры самого порфирина и молярного отношения порфирин/пар оснований ДНК и т. д. [5-7].
В данной работе иследовано влияние ионной силы раствора на взаимодействие с ДНК новых 2п(Н)-содержащих жезо-тетра(ЗК-пиридил)порфиринов.
Материалы и методы. Был использован сверхчистый препарат высокомолекулярной ДНК тимуса теленка, выделенный в лаборатории Д. Ю. Ландо в Институте биоорганической химии АН Республики Беларусь. гп-л<езо-тетра-(ЗЫ-бутилпиридил)порфирин [7пВ1И;РуР(3)], Ъп-мезо-те'тра-(ЗЫ-оксиэтилпиридил)порфирин [2пТОЕРуР(3)], 2п-.л<езо-тетра-(31\Г-аллилпиридил)пор-фирин [7пТА1РуР(3)] и гп-л<езо-тетра-(ЗЫ-металлил-пиридил)порфирин [2пМе1А1РуР(3)] были синтезированы на кафедре фармакологической химии Ереванского государственного медицинского университета согласно методике, описанной в работе [8]:
Кафедра молекулярной физики физического факультета Ереванского государственного университета, г. Ереван (Армения).
© Л. Р. Алоян, Г. В. Ананян, В. И. Варданян, Е. Б. Далян, 2006
У
Исследования проводились в буферных растворах 1 BPSE (бифосфатный буферный раствор с наличием NaCl и EDTA: 6 мМ Na2HP04 + 2 мМ NaH2P04 + 185 мМ NaCl + 1 мМ EDTA), ионная сила ц = 0,2 и 0,1 BPSE (ц - 0,02), рН - 7,2.
Спектры поглощения снимались на спектрофотометре Perkin-Elmer модели Lambda 800. Спектры титрования порфирина были получены при добавлении ДНК тимуса теленка (из маточного раствора 0,12-Ю-3 M пар оснований) к раствору порфирина неизменной концентрации (10 6 или 210-6 М) при 25 "С. Величину гипохромизма определяли по формуле Ah - (Af - Ab)/Aj-100, где А,и Аь - поглощение соответственно свободного и связанного порфиринов на максимуме полосы Соре. Область концентраций порфиринов в пересчете на пару оснований ДНК составляет 0,002 < V < 1, где V = С ./С
' ' " порф' пар. основ.ДНК
Спектры кругового дихроизма (КД) снимали на дихрографе Roussel Jouan-II. На неизменную концентрацию ДНК добавляли порфирин из маточного раствора 10~3 М. Область относительных концентраций 0 < v < 1.
Калориметрические исследования проводили на адиабатическом микрокалориметре DASM-4 при относительной концентрации v = 0,01.
Результаты и их обсуждение. КД спектры ДНК/порфирин комплексов. КД спектры ДНК/порфирин комплексов характеризуются двумя полосами: одна, в ультрафиолетовой области спектра (220-310 нм), совпадает с полосой естественного КД ДНК, а вторая, в видимой области (400-470 нм), -полоса индуцированного порфиринами КД (ИКД). Исследуемые порфирины не обладают естественной КД полосой во всей области своих электронных переходов. Поскольку выше 310 нм ДНК прозрачна, предполагается, что полоса ИКД комплекса в видимой области обусловлена упаковкой порфиринов на ДНК.
На основании многочисленных экспериментов, проведенных с комплексами ТМРуР с ДНК, установлено, что знак ИКД может служить тестом для определения типа связывания порфиринов с ДНК: отрицательное значение - признак интеркаляционного связывания, а положительное - внешнего упорядоченного [9]. КД спектры были получены для всех исследуемых комплексов. На рис. 1 приведены ИКД спектры ZnTOEPyP(3)/ ДНК комплекса при разных значениях ионной силы раствора. Величина ИКД для всех комплексов положительная, что указывает на внешнее связывание. Этому есть простое объяснение: в состав Zn-содержа-щих порфиринов входит аксиальный ли-ганд (см. схему), поэтому интеркаляция для них стерически задрудняется.
Спектры поглощения ДНК/порфирин комплексов. При низкой ионной силе характер изменения максимума полосы
-1
-1
Рис. 1. Спектры ИКД ZnTOEPyP(3)/ ДНК комплекса. а - ц - 0,2, v = 0,07 (1), 0,14 (2), 0,3 (3), 0,43 (4); б-il- 0,02, v - 0,06 (1), 0,13 (2), 0,63 (3), 1 (4).
Соре спектров поглощения изучаемых порфиринов при титровании ДНК одинаков (спектры не приведены): с увеличением концентрации ДНК происходит уменьшение максимума полосы Соре (гипохромный эффект) со смещением в длинноволновую область (батохромный сдвиг) ДЛ = 5-6 нм.
При высокой ионной силе наблюдается понижение гипохромизма у всех рассматриваемых порфиринов: например, для 2пТВг^РуР(3) порфирина гипохромизм уменьшается с 55,2 до 25,7%, для 2пТА1РуР(3) порфирина - с 58 до 32,4% и т. д. На рис. 2 приведены спектры титрования исследуемых порфиринов при ц. = 0,2. Видно, что при высокой ионной силе раствора величина как гипохромного эффекта, так и сдвига полосы зависит от типа бокового радикала порфирина. Как уже было отмечено, анализируемые порфирины не могут интеркалировать в ДНК, они укладываются в стопку на ее поверхности. А стэкинг взаимодействия между уложенными таким способом порфи-ринами приводят к гипохромизму полосы Соре. Что касается батохромного сдвига этой полосы, то он, по всей видимости, свидетельствует о том, что связанный с ДНК порфи-рин поглощает свет при более высоких длинах волн, чем свободный. Снижение гипохромного эффекта при высокой ионной силе указывает на уменьшение стэкинга между порфиринами. Это и понятно, поскольку рост ионной силы вызывает конформацион-ный переход ДНК в сторону С-формы, которая характеризуется увеличением расстояния между фосфатными группами вдоль оси спирали. Вследствие этого порфирины, стэкинг-упакованные вдоль оси ДНК, удаляются друг от друга и на единицу длины ДНК приходится меньше порфиринов, чем при низкой ионной силе.
X, нм
Рис. 2. Спектры титрования порфиринов при ц = 0,2.
Параметры связывания. Из спектров титрования были получены изотермы связывания и, используя формулу предложенную Корреа с соавторами [10], вычислены соответствующие параметры комплексообразования (константа связывания, Кь, и число мест посадки на пару оснований, п)
С, =--
' кь
пг - 1 пг — г — 1
(nr-r-l),
где г - отношение концентрации связанного лиганда к концентрации центров связывания ДНК (г= С6/Сднк); концентрация свободных лигандов в растворе.
На рис. 3 приведены теоретическая и экспериментальная изотермы связывания ZnTButPyP(3) с ДНК. Константа связывания и число мест посадки определялись подгонкой теоретической кривой к экспериментальным данным по методу наименьших квадратов с использованием компьютерной программы Graphpad Prism. Полученные результаты приведены в табл. 1. Как из них видно, увеличение ионной силы существенно влияет на параметры связывания этих порфиринов с ДНК: Кь уменьшается примерно на два порядка, а п увеличивается приблизительно в 2 раза.
14 12 10 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0
0,34
0,38
0,42
r=Cb/Cbp
Рис. 3. Зависимость С! от г, полученная по результатам титрования 7пТВ^РуР(3) с ДНК при 25 °С (точки) и теоретически рассчитанная по приведенной выше формуле
(сплошная кривая), а ~ ц = 0,2; 5 - ц. = 0,02.
Таблица 1. Параметры связывания порфиринов с ДНК при двух ионных силах
Порфирины ц = 0,02 ц- 0,2
Kh-W\ M"1 n ^•Ю-'.М"1 n
ZnTOEPyP(3) 2,24 1,01 - -
ZnTButPyP(3) 1,08 1,20 13,05 2,27
ZnTAlPyP(3) 1,02 1,03 2,07 2,98
ZnTMetAlPyP(3) 13,9 1,97 0,90 3,14
Термодинамика связывания порфиринов с ДНК. Для некоторых ДНК/порфирин комплексов проводились также калориметрические измерения при концентрации порфири-
на V = 0,01. Энтальпию и энтропию плавления определяли по формулам АН=^АСрс1Т и
(Н. Энтальпию связывания порфиринов (ЛНь) определяли как разность энтальпий плавления ДНК/порфирин комплексов (ДНт) и чистой ДНК (АНто): АНь = АЯ^ - ЛЯт. Аналогично находили энтропию связывания порфиринов А5"4 = Д5гао - Д^. Свободную энергию связывания определяли по известной формуле = АНь -ГД^, где 7= 298 К. В табл. 2 приведены полученные термодинамические параметры в расчете на пару оснований ДНК. Из нее видно, что при высокой ионной силе связывание носит явно выраженный энтропийный характер (положительные значения Д54). Возможно, это вызвано тем, что при высокой ионной силе число противоионов, освободившихся с
Таблица 2. Значения термодинамических параметров связывания порфиринов с ДНК при двух ионных силах
Порфирины АНь, ккал, М"1 ДSb, ккал, М-1, К"1 ДGb, ккал, М"1
),02
ZnMetAlPyP(3) ZnTButPyP(3) -0,86 -1,49 -1,98 -3,78 -0,27 -0,36
ц = 0,2
ZnMetAlPyP(3) ZnTButPyP(3) 3,6 1,05 21,3 15,3 -2,7 -3,5
поверхности ДНК при комплексообразовании с порфиринами, намного больше, чем при низкой ионной силе, что и приводит к увеличению энтропии.
Работа выполнена при финансовой поддержке МНТЦ (грант № А-301.2).
Summary
Aloyan L. Я, Ananyan G. V., Vardanyan V. /., Dalyan Y. B. The influence of ionic strenght on the binding of porphyrins with DNA.
The binding of new water soluble Zn(II)-containing /neio-tetra-(3N-pyridyI) porphyrins to calf thymus DNA with respect to the ionic strength has been determined by absorption spectrometry, circular dichroism and microcalorimetry. It is shown, that for this porphyrins external staking binding mode is realized. The changes of the maximum of Soret absorption band are used for calculations of binding parameters (Kb and n). Analyses of calorimetric curves show the entropic nature of porphyrins binding at high ionic strength.
Литература
1. Hurley L. #., BoydF. L. //Trends Pharm. Sci. 1988. Vol. 9. P. 402-407.2. MerchatM., Bertolini G., Giacomini P. et al. // J. Photochem. Photobiol. 1996. Vol. 32. P. 153-157. 3. Pastemack R. F, Gibbs E. J., Bruzewicz D. et al. // J. Amer. Chem. Soc. 2002. Vol. 124. P. 3533-3539. 4. Далян E. Б. // Биофизика. 2002. Т. 47, вып. 2. С. 253-258.5. Dalyan Y. В., Haroutiunian S, G., Ananyan G. V. et al. //J. of Biomolecular Structure & Dynamics. 2001. Vol. 18, N 5. P. 677-680. 6. Aloyan L. R. I I Vestnik IAELPS. 2005. Vol. 10, N 6. P. 245-249. 7. Pastemack R. F., Goldsmith J. I., Sztp S., Gibbs E. J. 11 Biophys. Journal. 1998. Vol. 75. P. 1024-1031 . 8. Fiel R. J., Howard J. C., Mark E. H., Datta-Gupta N. // Nucleic Acids Res. 1979. N 6. P. 3093-3118. 9. Pastemack R, F // Chitality. 2003. Vol. 15. P. 329-332. 10. Correia J. J., Chaires J. В. 11 Methods in Enzymology. 1994. Vol. 240. P. 593-614.
Статья принята к печати 23 ноября 2006 г.
