Научная статья на тему 'Структурные особенности опухолевой ДНК в присутствии AgT40EPyP'

Структурные особенности опухолевой ДНК в присутствии AgT40EPyP Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
92
25
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Карапетян Н. Г., Ананян Г. В., Торосян Л. В., Далян Е. Б.

Исследованы некоторые характеристики ДНК, выделенных из тканей здоровых, опухолевых и леченых Ag-мезо-тетра(4-N-гидроксиэтилпиридил)порфирином (AgT4OEPyP) мышей, для выявления в них структурных отличий. Судя по термодинамическим параметрам плавления ДНК (температура плавления, интервал плавления, энтальпия), а также по электрофоретической подвижности этих фракций, можно сделать вывод, что опухолевая ДНК в присутствии AgT40EPyP стабилизируется, возможно в результате образования сшивок. Полученные результаты обсуждаются в аспекте использования AgT40EPyP в качестве потенциального противоопухолевого препарата.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Карапетян Н. Г., Ананян Г. В., Торосян Л. В., Далян Е. Б.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Structural features of the Tumor''s DNA on the presence of AgT40EPyP

Some characteristics of DNA, isolated from healthy, tumors diseased and treated by Ag-mesotetra(4-N-hydroxyethylpyridyl)porphyrins (AgT40EPyP) mouse's tissues are investigated for eliciting the differences of their structure. Based on the thermodynamic parameters of DNA melting (the melting temperature, the melting interval, the enthalpy) as well as the electrophoretic mobility of this fractions, it may be concluded, that the tumour's DNA, treated by AgT40EPyP stabilizes. There is possibility, that it is the result of the crosslinks formation in the structure of DNA. The results are discussed in the aspect of using the AgT40EPyP as a potential antitumor drag.

Текст научной работы на тему «Структурные особенности опухолевой ДНК в присутствии AgT40EPyP»

УДК 577.3 Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 2

Н. Г. Карапетян\ Г. В. Ананян\ Л. В. Торосян\ Е. Б. Далян )

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОПУХОЛЕВОЙ ДНК В ПРИСУТСТВИИ А^40ЕРуР

Введение. Порфирины, как природные, так и синтетические, широко используются в медицине как противовирусные, противогрибковые, противоопухолевые соединения. Особое направление в лечении онкологических заболеваний занимает фотодинамическая терапия опухолей с применением порфиринов в качестве сенсибилизаторов. Этот метод позволяет проводить раннюю диагностику и лечение опухоли [1,2]. Наряду с используемыми в настоящее время препаратами, активно синтезируются и исследуются все новые и новые соединения на основе порфиринов, которые должны удовлетворять определенным требованиям: иметь высокую селективность к раковым клеткам и слабо задерживаться в нормальных тканях, обладать флуоресценцией, низкой токсичностью и легко выводиться из организма, быть устойчивыми при хранении и введении в организм. Фотосенсибилизация порфиринов может приводить как к некрозу, так и к апоптозу опухолевых клеток [3,4].

В данной работе была предпринята попытка выявить возможность использования нового синтетического водорастворимого Ag-л<eзo-тeтpa-(4-N-гидpoэкcиэтилпиpидил)пop-фирина [^Т40ЕРуР] в качестве потенциального противоопухолевого препарата.

Саркому Крокера прививали белым беспородным мышам. Часть животных в течение пяти дней внутрибрюшинно получала AgT40EPyP из расчета 13 мкг/г. Суммарная доза пяти инъекций составила 1,5 мг на мышь. На седьмой день животных забивали. При этом наблюдалось уменьшение опухоли на 57%. Эта часть работы проводилась в Институте тонкой органической химии в Ереване. Ткани животных были любезно предоставлены Ф. Г. Арсенян.

С целью выявления структурных отличий в исследуемых ДНК проводили спек-трофотометрические, калориметрические и электрофоретические измерения.

Материалы и методы. Порфирин AgT40EPyP (рис. 1) был синтезирован на кафедре фармакологической химии Ереванского государственного медицинского университета по методике, описанной в [5].

Рис. 1. Схема порфирина ^Т40ЕРуР (М = Ag, И = СН2-СН2-ОН).

"> Кафедра молекулярной физики физического факультета Ереванского государственного университета, г. Ереван (Армения).

© Н. Г. Карапетян, Г. В. Ананян, Л. В. Торосян, Е. Б. Далян, 2006

ДНК выделяли из печени здоровых мышей, опухолевой и леченой порфирином опухолевой тканей мышей, используя метод Т. Е. Сулимовой [6] с некоторыми модификациями. Ткани гомогенизировали в буфере, содержащем 0,15 М NaCI, 0,01М ЭДТА, 0,015 М цитрат Na, 0,1 М mpwc-аминометан, 0,1% тритон Х-100, pH 8,2-8,4. К гомогенату добавляли SDS до концентрации 2,5%, затем смесь инкубировали 40 мин при 55 °С. О степени лизиса судили по возрастанию вязкости раствора. Затем лизат осторожно охлаждали под проточной водой, добавляли NaCI до конечной концентрации 1 Ми оставляли 20-30 мин на холоде. Далее к лизату прибавляли равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении 24:1, встряхивали на качалке Туре 358 S при 4 °С и центрифугировали при 4000 об./мин 30 мин при 0-4 °С. Из водной фазы ДНК осаждали двойным объемом холодного этанола. Полученные ДНК очищали от примесей РНК и белков. Для этого ДНК растворяли в минимальном объеме 0,1 SSC (1 SSC -0,15 М NaCI, 0,015 М цитрат натрия), pH 7,8-8,2. После чего добавляли РНК-азу до концентрации 50 мкг/мл, и инкубировали смесь при 37 °С в течение 1 ч. Затем к раствору добавляли проназу 50 мкг/мл и инкубировали 2 ч при тех же условиях. После инкубации смесь охлаждали и добавляли 5% SDS до конечной концентрации 0,5% и 4 М NaCI до конечной концентрации 1 М. Далее 2-3 раза проводили депротеинизацию смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали равным объемом 96%-ного этанола. После очистки определяли оптические характеристики ДНК по соотношению Ат /Аш = 1,8, ^260/^2зо = которые соответствовали значениям оптических характеристик по Мармуру [7].

Спектры поглощения и спектрофотометрические кривые плавления ДНК снимали на спектрофотометре Perkin-Elmer модели Lambda 800. Использовали 10-миллиметровые термостати-руемые кварцевые кюветы с плотно притертыми тефлоновыми пробками. Нагрев осуществляли с линейной скоростью 0,5 град./мин. Измерения проводили в 0,1 SSC в интервале температур 35-95 °С.

Микрокалориметрические кривые плавления ДНК снимали на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (Россия). Концентрация ДНК в растворе составляла 0,3-0,4 мг/мл, скорость нагрева - 1 град./мин. Энтальпию плавления рассчитывали по площади под кривой теплопоглощения по формуле АН - \ CpdT, где Ср - удельная теплоемкость при постоянном давлении.

Электрофорез ДНК проводили в 0,7%-ном агарозном геле, позволяющем разделить линейные молекулы ДНК, содержащие 10-0,8 kbp. В качестве электродного буфера использовали 0,089 М трмс-боратный буфер с 0,002 М ЭДТА. Разделение проводили при напряженности, не превышающей 5 В/см. После завершения разделения для обнаружения ДНК гели выдерживали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл). Фотографии гелей сделаны в проходящем УФ-свете цифровым фотоаппаратом марки hp photosmart 735 [8, с. 157-170].

Результаты и их обсуждение. Было установлено, что параметры плавления ДНК, выделенных из здоровых животных, отличаются от соответствующих параметров опухолевой ДНК и ДНК опухоли при введении AgT40EPyP. Как видно из рис. 2, дифференциальные кривые плавления (ДКП) опухолевых ДНК смещены относительно ДКП здоровых ДНК в сторону низких температур, т. е. в опухолевых ДНК наблюдалось уменьшение температуры плавления Тт и увеличение интервала плавления AT.

Известно, что в опухолевой ДНК содержатся дефектные участки с нарушенной первичной структурой - в них наблюдаются изменение содержания 5-метилцитозина [9] и, как следствие, мутации (замена Г-Ц пар на А-Т), что приводит к уменьшению величины Тт. Это вызывает смещение ДКП опухолевых ДНК относительно ДКП здоровых ДНК в сторону низких температур. Дефекты во вторичной структуре - образование открытых участков или участки ДНК с прочно связанными белками - увеличивают гетерогенность опухолевой ДНК, что ведет к росту AT, энтальпии перехода спираль-клубок АН (рис. 3) и, возможно, уменьшению гипохромности Ah.

Рис. 2. Дифференциальные кривые плавления ДНК из печени здоровых животных (1), ДНК из опухолевой ткани (2) и ДНК опухоли после введения животным А§Т40ЕРу (3).

Стрелки указывают сателлитные участки ДНК у леченых мышей.

77 С

Рис. 3. Микрокалориметрические кривые плавления ДНК из печени здоровых животных, ДНК из опухолевой ткани и ДНК опухоли после введения животным А§Т40ЕРуР.

Обозначения см. на рис. 2.

Параметры плавления ДНК в норме при опухоли и при лечении ее AgT40EPyP суммированы в таблице.

Параметры плавления ДНК в норме, при опухоли, а также при леченой А^40ЕРуР опухоли

Условия исследования Источник ДНК Температура плавления, Тш' °с Интервал плавления, АТ,°С Гипохромность, ДА, % Энтальпия, АН, ккал/моль

Здоровые животные Печень 71,3 7,7 35,7 4

Животные с опухолью Опухоль 70,1 8,4 32,7 7,1

Животные

с опухолью после введения А^40ЕРуР Опухоль 71,8 9,5 38 7,7

Что касается ДНК, выделенной из опухоли при введении А^Т40ЕРуР, то здесь отмечалось повышение всех исследуемых характеристик. Молекула AgT40EPyP является планарной, несет на себе положительный заряд. Координационное число Ag равно четырем, и вследствие этого в составе металлопорфиринов он образует четыре координационные связи с атомами азотов порфиринового ядра. Так как молекула AgT40EPyP плоская, то она способна интеркалировать в Г-Ц богатые участки молекулы опухолевой ДНК [10]. Данная избирательность связывания проявляется на дифференциальных кривых плавления (см. рис. 2), где Г-Ц богатые сателлитные фракции более выражены и плавятся при более высоких температурах. Возможно, что в присутствии AgT40EPyP в молекуле опухолевой ДНК образуются локально сшитые участки, чем можно объяснить повышенные значения термодинамических характеристик опухолевой ДНК, леченой AgT40EPyP.

Полученные результаты коррелируют с электрофоретическими данными. Из рис. 4 видно, что фракция, соответствующая опухолевой ДНК, по сравнению со здоровой более подвижна и имеет шлейф, в то время как опухолевая ДНК в присутствии AgT40EPyP менее подвижна и фракция, соответствующая ей, более компактна по сравнению с опухолевой. Известно, что порфирины могут индуцировать апоптоз (программируемая клеточная смерть) опухолевой клетки. При этом опухолевая ДНК подвергается деструкции, и при электрофорезе в агарозном геле обнаруживаются фрагменты ДНК. Однако апоптоз возможен и без фрагментации ДНК [11].

1 2

3

Рис. 4. Электрофорез ДНК. 1 - печень здоровых животных; 2 - опухоль; 3 - опухоль, леченая А5Т40ЕРуР.

Таким образом, новый синтетический водорастворимый порфирин AgT40EPyP способен избирательно накапливаться в опухолевых клетках. Являясь плоской молекулой, он интеркалирует в мажорном желобке ДНК, проявляя избирательность к Г-Ц последовательностям. Стабилизируя структуру ДНК, он может приводить к тому, что дефектные опухолевые ДНК не будут полноценно участвовать в редупликации и транскрипции, что повлечет за собой уменьшение опухоли.

Работа выполнена при финансовой поддержке МНТЦ (грант № А-301.2). Summary

Karapetyan N. Н., Ananyan G. V., Torosyan L. V., Dalyan Y. В. Structural features of the Tumor's DNA on the presence of AgT40EPyP.

Some characteristics of DNA, isolated from healthy, tumors diseased and treated by Ag-meso-tetra(4-N-hydroxyethylpyridyl)porphyrins (AgT40EPyP) mouse's tissues are investigated for eliciting the differences of their structure. Based on the thermodynamic parameters of DNA melting (the melting temperature, the melting interval, the enthalpy) as well as the electrophoretic mobility of this fractions, it may be concluded, that the tumour's DNA, treated by AgT40EPyP stabilizes. There is possibility, that it is the result of the crosslinks formation in the structure of DNA. The results are discussed in the aspect of using the AgT40EPyP as a potential antitumor drag.

Литература

1. Onizawa K., Okamura N., Saginoya H., Yoshida #.// Oral Oncology. 2003. Vol. 39. P. 150-156. 2. Alvarez M. G., Moran F., Yslas E. I. et al. 11 Biomedicine and Pharmacotherapy. 2003. Vol. 57. P, 163— 168. 3. Oleinick N. L., Evans H. E. // Radiat. Res. 1998. Vol. 150. P. 146-156. 4. Kessel D., Luo Y. // J. Porph. Phthaloc. 2001. Vol. 5. P. 181-184. 5. Мадакян В. H., Казарян Р. К., Ханатрян М. А. и др. // Химия гетероцикл. соединений. 1986. № 2. С. 212-216.6. Сулимова Т. Е., СлюсаренкоА. Г. Строение ДНК и положение организмов в системе. М., 1972. 7. Marmur J., Doty Р. // J. Mol. Biology. 1961. Vol. 3. P. 208—218. 8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрун Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии / Пер. с англ.; Под ред. М. Захарова. М., 1984. 9. Бабаян Ю. С., Асла-нян JI. Л., Ананян Г. В., Гарибян Дж. В. // Биофизика. 1985. Т. 3. С. 414-417. 10. Ghazaryan А. А., Dalyan Y. В., Haroutiunian S. G. et al. //JBSD. 2006. Vol. 24, N 1. P. 67-74. 11. Самуилов В. Д., Олек-синА. В., Лагунова Е. М. // Биохимия. 2000. Т. 65, вып. 8. С. 1029-1046.

Статья принята к печати 23 ноября 2006 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.