CC BY
11© Е.А.КРЕМЛЕВА, О.В.БУХАРИН, 2013 Е.А.Кремлева, О.В.Бухарин
ВЛИЯНИЕ IL-10 НА РОСТОВЫЕ СВОЙСТВА ВАГИНАЛЬНЫХ МИКРОСИМБИОНТОВ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург
Цель. Изучение влияние IL-ф в концентрациях, характерных для нормо- и патоцено-зов влагалища, на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов. Материалы и методы. Определена концентрация IL-ф в вагинальном содержимом женщин при бактериальном вагинозе и нормоценозе методом ИФА. Фотометрически изучено изменение ростовых характеристик и способности к биопленкообразоваию Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Lactobacilus spp., Corynebacterium spp. под воздействием разных концентраций IL-ф по методике O'Toole G.A. (1999). Результаты. Показано, что IL-1P в концентрациях, характерных для нормоценоза, способен оказывать стимулирующее влияние на ростовые свойства лактобацилл и коринебактерий и подавлять рост S.aureus и E.coli как в планктонной, так и биопленочной культуре. Концентрации IL-ф, свойственные вагинальному дисбиозу, напротив, приводят к подавлению прироста биомассы лактобацилл на фоне стимуляции ростовых свойств и способности к биопленкообразованию S.aureus и E.coli. Заключение. Дифференцированное дозозависимое влияние IL-ф на прирост биомассы и способность к биопленкообразованию вагинальных микросимбионтов является механизмом регуляции вагинального микробиоценоза.
Журн. микробиол., 2013, № 4, С. 65—69
Ключевые слова: бактерии, биопленки, вагинальный микробиоценоз, лактобациллы, рост, цитокины, IL-1P
E.A.Kremleva, O.V.Bukharin
EFFECT OF IL-1P ON GROWTH PROPERTIES OF VAGINAL MICROSYMBIONTS
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Study the effect of IL-1 в in concentrations that are characteristic for vaginal normo- and pathocenosis on growth properties ofvaginal microsymbionts. Materials and methods. Concentration ofIL-1 в in vaginal contents ofwomen during bacterial vaginosis and normocenosis was determined by using enzume immunoassay. Changes of growth characteristics and biofilm formation ability of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Lactobacilus spp., Corynebacterium spp. under the effect of various IL-1 в concentrations by method of O'Toole G.A. (1999) were studied. Results. IL-1 в in concentrations characteristic for normocenosis was shown to be able to cause stimulating effect on growth properties of lactobacilli and corynebacteria and suppress growth of S. aureus and E. coli in both plankton and biofilm cultures. IL-1 в concentrations characteristic for vaginal dysbio-sis on the contrary result in suppression of growth of lactobacilli biomass against the background ofstimulation ofgrowth properties and biofilm formation ability ofS. aureus and E. coli. Conclusion. Differential dose-dependent effect of IL-1 в on biomass growth and biofilm formation ability of vaginal microsymbionts is a mechanism of regulation of vaginal microbiocenosis.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 4, P. 65—69
Key words: bacteria, biofilms, vaginal microbiocenosis, lactobacilli, growth, cytokines, IL-1P ВВЕДЕНИЕ
Цитокины — группа гормоноподобных белков и пептидов, регулирующих межклеточные и межсистемные взаимодействия и обеспечивающих согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия.
5. ЖМЭИ 4 № 5185
65
Повышение уровня провоспалительных цитокинов в тканях и физиологических жидкостях репродуктивного тракта женщин наблюдается при воспалительных заболеваниях женских половых органов, вызванных как специфическими [5], так и неспецифическими возбудителями [6]. Не менее высокий уровень про-воспалительных цитокинов сопровождает дисбиотические состояния, характеризующиеся снижением обсемененности нижних отделов репродуктивного тракта лактобациллами [9]. Ранее нами были получены данные о корреляции дефицита вагинальной лактофлоры с концентрацией ИЛ-ф [1].Это и определило выбор цитокина для настоящего исследования.
Известно, что цитокины способны влиять на ростовые свойства некоторых бактерий [7]. В основном это показано на патогенных бактериях, рост которых зачастую стимулируется цитокинами провоспалительной направленности [7]. В отношении же влияния цитокинов на нормофлору женского репродуктивного тракта сведения крайне скудны. Хотя постоянное присутствие в вагинальном биотопе цитокинов, способных динамично изменять свою концентрацию, заставляет рассматривать их в качестве возможного регулятора состояния микробиоценоза влагалища. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение влияния IL-1ß в концентрациях, характерных для нормо- и патоценозов влагалища, на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для определения концентраций IL-1ß в вагинальном содержимом, характерных для нормо- и патоценозов влагалища, были обследованы 32 женщины, страдающие бактериальным вагинозом, и 24 практически здоровых женщины. Бактериальный вагиноз диагностировали согласно критериям [4]. Для исключения инфекций, передаваемых половым путем, использовали метод полимеразной цепной реакции, прямой иммунофлюоресценции (уреаплазмоз и хламидиоз) и культуральный метод (трихомоноз). Вагинальное содержимое получали в первой фазе менструального цикла с помощью стерильного катетера, омывая стенки влагалища 2 мл стерильного физиологического раствора. Для ингибирования активности протеаз к полученной пробе добавляли фенилметилсульфонилфлюо-рид до концентрации 5 мкМ/мл. Определение концентрации IL-1ß проводили иммуноферментным методом, используя наборы производства ООО «Цитокин» по протоколам, указанным в инструкции.
В работе использовали культуры S.aureus, E.coli, Corynebacterium spp., Lactobacillus spp. из коллекции ИКВС УрО РАН. Бактерии были выделены из репродуктивного тракта женщин и идентифицированы по совокупности культу-ральных, тинкториальных и биохимических свойств. Лактобациллы культивировали в бульоне MRS (Sifin, Германия), S. aureus, E. coli и коринебактерии — в 2% мясопептонном бульоне (МПБ, НПО «Питательные среды», Махачкала) в микро-аэрофильных условиях при 37°С.
Для оценки влияния IL-1ß на свойства бактерий к взвеси исследуемых микроорганизмов (ПМО=105 КОЕ/мл) в соответствующей культуральной среде добавляли, соблюдая объемное соотношение 10/1, раствор IL-1ß, создавая конечные концентрации от 15 до 1000 пг/мл. Влияние IL-1ß на микроорганизмы оценивали по изменению их ростовых свойств и способности к биопленкообразованию. Ростовые свойства бактерий определяли по приросту биомассы фотометрически (при ^=540 нм). Способность бактерий к биопленкообразованию изучали по методике [8].
Влияние IL-1ß на свойства микроорганизмов выражали в процентах изменения прироста биомассы бактерий или их способности к биопленкообразованию по отношению к контролю Полученные данные обрабатывали статистически:
сравнение средних значений показателей проводили по парному критерию Стьюдента в случае зависимых выборок и по t-критерию Стьюдента для независимых выборок. Различия считали значимыми, если вероятность ошибки р<0,05
[3].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенные исследования показали, что концентрация IL-1ß в вагинальном содержимом женщин, страдающих дисбиозом влагалища (бактериальным ваги-нозом), составляет в среднем 519,9±197,4 пг/мл, что значительно превышает концентрацию IL-1ß, наблюдаемую при нормоценозе влагалища (31,2±9,1 пг/мл) р<0,05.
Влияние исследуемого цитокина на прирост биомассы и способность к биопленкообразованию вагинальных микросимбионтов было дифференцированным и дозозависимым. Умеренные концентрации IL-1ß, характерные для нормоцено-за, усиливали прирост биомассы лактобацилл на 24,3±3,9 % и коринебактерий на 18,9±3,8% (рис.), при этом наблюдалось угнетение прироста биомассы S.aureus и E.coli на 15,3±2,8% и 11,1±3,3%, соответственно. Параллельно с этим было зафиксировано снижение способности к биопленкообразованию S.aureus на 12,3±3,8% и E.coli на 15,1±2,3%.
Влияние IL-1ß в концентрациях, фиксируемых при распространенном варианте дисбиоза женского репродуктивного тракта — бактериальном вагинозе, было диаметрально противоположным. С возрастанием концентрации цитокина (рис.) стимуляция прироста биомассы доминантного вагинального симбионта — лактобацилл становилась менее выраженной, а затем и вовсе сменилась дозо-
LJU.U
Влияние IL-1P на прирост биомассы вагинальных микросимбионтов (в % по отношению к контролю).
По оси ординат — изменение прироста биомассы по отношению к контролю (%), по оси абсцисс — конечная концентрация IL-ip, пг/мл; столбцы белые — Lactobacillus spp.; серые — Corynebacterium spp.; косая штриховка — S.aureus ; штриховка-сетка — E.coli; * р<0,05 — достоверные различия при сравнении с влиянием концентраций IL-ip, характерных для нормоценоза; фигурными скобками обозначены средние концентрации IL-ip при нормоценозе и дисбиозе.
зависимым угнетением, составившим при концентрации IL-ф 500 пг/мл 17,8±4,8% и 22,5±6,8% — при концентрации 1000 пг/мл. В отношении S.aureus и E.coli, напротив, с возрастанием концентрации цитокина подавление ростовых свойств сменялось стимуляцией. При этом увеличение способности к биоплен-кообразованию S.aureus и E.coli опережало усиление прироста их биомассы в планктонной культуре. Так, при концентрации IL-1P 500 пг/мл стимуляция прироста S.aureus в планктонной культуре составила 18,7±1,3%, в биопленке — 29,5±2,8%, р<0,05, для E.coli —10,1±1,9% и 19,3±1,6%, соответственно, р<0,05. Коринебактерии оказались более устойчивыми, чем лактобациллы, к возрастанию концентрации IL-1p. Подавление прироста коринебактерий было отмечено только при концентрации 1000 пг/мл и не превышало 6,7±2,0% (рис.).
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные результаты свидетельствуют о том, что IL-ф способен оказывать дифференцированное дозозависимое влияние на прирост биомассы и способность к биопленкообразованию разных вагинальных микросимбионтов. В концентрациях, характерных для нормоценоза, действие цитокина приводило к стимуляции ростовых свойств лактобацилл и коринебактерий и подавлению роста S.aureus и E.coli как в планктонной, так и в биопленочной культуре. Концентрации IL-1P, свойственные вагинальному дисбиозу, напротив, приводили к подавлению прироста биомассы лактобацилл на фоне стимуляции ростовых свойств и биоплен-кообразования S.aureus и E.coli.
Полученные данные позволяют объяснить механизм формирования дисбио-тических состояний нижних отделов женского репродуктивного тракта на фоне инфекций, передаваемых половым путем. Высокий уровень IL-ф, экспрес-сируемого клетками макроорганизма в ответ на взаимодействие с патогеном, призван активировать защитные реакции организма хозяина, но вместе с тем, оказывает повреждающее действие на нормальную микрофлору женского репродуктивного тракта. Происходит угнетение ростовых свойств лактофлоры на фоне стимуляции прироста биомассы и биопленкообразования ассоциативных микросимбионтов. Вследствие этого происходит замещение лактофлоры, вызывающей умеренную экспрессию провоспалительных цитокинов клетками макроорганизма [1], на патогенную и условно патогенную флору, инициирующую бурную ци-токиновую реакцию. Теперь уже возникший дисбиотический процесс сам по себе является фактором, поддерживающим высокий уровень IL-ф. Таким образом, формируется опосредованный интерлейкином IL-1P патологический круг, поддерживающий существование патоценоза нижних отделов женского репродуктивного тракта.
Полученные результаты свидетельствуют, что IL-ф, оказывая дифференцированное дозозависимое влияние на прирост биомассы и способность к биоплен-кообразованию вагинальных микросимбионтов, принимает участие в формировании и поддержании как пато-, так и нормоценоза влагалища.
Работа выполнена при поддержке грантов программы Президиума РАН №5 «Фундаментальные науки — медицине», проект № 12-П-4-1015 и программы инициативных фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-У-4-1023.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кремлева Е.А., Черкасов С.В.,Константинова О.Д. Характеристика уровня цитокинов и состояния микробиоценоза репродуктивного тракта женщин с бесплодием. Российский вестник акушера-гинеколога. 2012, 12 (3): 11-15.
2. Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Продукция цитокинов вагинальными эпителиоцитами в процессе взаимодействия с доминантными и ассоциативными микросимбионтами. Журн. микробиол. 2012, 4: 114-118.
3. Лакин Р.Ф. Биометрия. М., Высшая школа, 1990.
4. Amsel R., Totten P.A., Spiegel C.A. et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am. J. Med. 1983, 74 (1): 14-22.
5. Cauci S., Culhane J.F. Modulation of vaginal immune response among pregnant women with bacterial vaginosis by Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, and yeast. Am. J. Obstet. Gynecol. 2007, 196 (2): 133-137.
6. Donders G. G., Vereecken A., Bosmans E. et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. BJOG. 2002, 109 (1): 34-43.
7. Meduri G.U., Kanangat S., Stefan J. et. al.Cytokines IL-1beta, IL-6, and TNF-alpha enhance in vitro growth of bacteria. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1999, 160: 961-967.
8. O'Toole G.A., Pratt L.A., Watnick P.I. et al. Genetic approaches to study of biofilms. Enzymol.1999, 310: 91-109.
9. Wasiela M., Krzeminski Z., Kalinka J., Brzezinska-Blaszczyk E. Correlation between levels of selected cytokines in cervico-vaginal fluid of women with abnormal vaginal bacterial flora. Med. Dosw. Mikrobiol. 2005, 57 (3):327-333.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Кремлева Елена Александровна,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 М.Д.Кузьмин1, О.Л.Карташова2, А.Р.Хайрулин3
ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ, ВЫДЕЛЕННОЙ ПРИ ИСКУССТВЕННОЙ ВЕНТИЛЯЦИИ ЛЕГКИХ
Оренбургская государственная медицинская академия; 2Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург, 3Оренбургская областная клиническая больница № 1
Цель. Изучение видового состава и биологических свойств микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела дыхательных путей 34 больных хирургических отделений при искусственной вентиляции легких. Материалы и методы. Выделено и идентифицировано общепринятыми методами 59 штаммов микроорганизмов из трахеобронхиального секрета больных при интубации и экстубации. У изолятов определена гемолитическая и анти-лизоцимная активность по описанным ранее методам (Бухарин О.В., 1999). Результаты. При экстубации установлено повышение обсемененности микроорганизмами трахео-бронхиального секрета больных, увеличение видового разнообразия микроорганизмов и частоты встречаемости высоковирулентных штаммов, характеризующихся способностью гемолизировать эритроциты и высокими значениями антилизоцимной активности. Заключение. Полученные данные могут быть использованы для прогнозирования риска развития заболеваний дыхательной системы.
Журн. микробиол., 2013, № 4, С. 69—72
Ключевые слова: искусственная вентиляция легких, микрофлора, биологические свойства M.D.Kuzmin1, O.L.Kartashova2, A.R.Khairulin3
CHARACTERISTIC OF MICROFLORA ISOLATED DURING MECHANICAL LUNG VENTILATION
1Orenbrug State Medical Academy; 2Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, 3Orenburg Regional Clinical Hospital No. 1, Russia
Aim. Study species composition and biological properties of microorganisms isolated from lower respiratory tract of 34 patients of surgical departments during mechanical lung ventilation. Materials and methods. 59 strains of microorganisms were isolated and identified by established
