CC BY
14© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Е.А.Кремлева1,2, А.В.Сгибнев1, С.В.Черкасов1
ВЛИЯНИЕ МИКРОСИМБИОНТОВ НА СПОСОБНОСТЬ ВАГИНАЛЬНЫХ ЭПИТЕ-ЛИОЦИТОВ МОДИФИЦИРОВАТЬ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2 Оренбургский государственный медицинский университет
Цель. Изучение закономерности влияния разных типов вагинальных микросимбионтов на способность мукозальных эпителиоцитов влагалища модифицировать биологические свойства бактерий. Материалы и методы. С использованием многокомпонентной модельной системы изучали влияние термоинактивированных клеток Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Н2О2-продуцирующих и Н2О2-непродуцирующих лактобацилл на способность первичных вагинальных эпителиоцитов изменять рост и антагонистическую активность S. aureus, E. coli, Н2О2-продуцирующих и Н2О2-непродуцирующих лактобацилл. Результаты. Установлено, что изменение состава экзометаболитов вагинальных эпителиоцитов под влиянием S. aureus и E. coli влечет за собой выраженную стимуляцию антагонистической активности Н2О2-продуцирующих и увеличение численности Н2О2-непродуцирующих лактобацилл. Термоинактивированные клетки лактобацилл стимулировали продукцию эпителиоцитами метаболитов, подавляющих рост и антагонистическую активность аллохтонной микрофлоры и стимулирующих аналогичные показатели лактобацилл. Наиболее сильное влияние на способность вагинальных эпите-лиоцитов изменять биологические свойства бактерий оказывали Н2О2-продуцирующие лактобациллы. Заключение. Выявленные закономерности позволяют рассматривать эпи-телиоциты и нормофлору влагалища как симбиотическую систему, согласованное взаимодействие компонентов которой направлено на поддержание микроэкологического постоянства женского репродуктивного тракта.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 75—79
Ключевые слова: взаимодействия хозяин—паразит, влагалище, врожденный иммунитет, клеточная стенка бактерий, лактобациллы, микробный антагонизм, мутуализм, пероксид водорода, симбиоз, эпителиальные клетки
E.A.Kremleva1,2, A.V.Sgibnev1, S.V.Cherkasov1
EFFECT OF MICROSYMBIONTS ON THE ABILITY OF VAGINAL EPITHELIOCYTES TO MODIFY BIOLOGICAL PROPERTIES OF BACTERIA
1Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg; 2Orenburg State Medical University, Russia
Aim. Study regularities of effects of various types of vaginal microsymbionts on the ability of mucosal epitheliocytes of the vagina to modify biological properties of bacteria. Materials and methods. Effect of thermo-inactivated cells of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, H2O2-producing and H2O2-non-producing lactobacilli on the ability of primary vaginal epitheliocytes to alter growth and antagonistic activity of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, H2O2-producing and H2O2-nonproducing lactobacilli was studied using a multi-component module system. Results. Alterations of composition of vaginal epitheliocyte exometabolites under the effect of S. aureus and E. coli was established to result in a pronounced stimulation of antagonistic activity of H2O2-producing and an increase of the number of H2O2-nonproducing lactobacilli. Thermo-inactivated cells oflactobacilli stimulated production of metabolites by epitheliocytes, that suppress the growth and antagonistic activity of allochthonous microflora and stimulate similar parameters of lacto-bacilli. The strongest effects on the ability of vaginal epitheliocytes to alter biological properties of bacteria were rendered by H2O2-producing lactobacilli. Conclusion. The regularities identified allow to examine epitheliocytes and normoflora of vagina as a symbiotic system, the coordinated interaction of its components is directed on maintaining microecological stability of female reproductive tract.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 75-79
Key words: host-parasite interactions, vagina, innate immunity, bacterial cell wall, lactobacilli,
microbial antagonism, mutualism, hydrogen peroxide, symbiosis, epithelial cells
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время представление об ограничительно-покровной роли эпителиальных клеток утратило актуальность. Оказалось, что эпителиоциты способны, реагируя на внешние стимулы, участвовать в развитии защитных реакций врожденного и адаптивного иммунитета, в формировании толерантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов[10, 11].
На примере вагинальных эпителиоцитов была показана способность эпителиальных клеток дифференцированно влиять на биологические свойства различных микросимбионтов, обитающих в вагинальном биотопе [5]. Предварительный контакт эпителиоцита с микросимбионтом, на свойства которого впоследствии оказывалось влияние, усиливает интенсивность воздействия, не меняя его направленности.
Окружающая микрофлора, в свою очередь, также способна влиять на состояние эпителиальных клеток. Эпителиоциты, сформировавшиеся в условиях нормального и патологического микроокружения, проявляют разный характер взаимодействия с микрофлорой [1]. Реагируя на взаимодействие с различными бактериальными клетками или их экзометаболитами, эпителиоциты направленно изменяют профиль экспрессии цитокинов [6], что подтверждает их активное участие в реакциях иммунитета.
Таким образом, вагинальные эпителиоциты представляются клетками, активно взаимодействующими с микрофлорой своего биотопа и участвующими как в формировании типа микробиоценоза, так и в поддержании колонизационной резистентности.
Однако закономерности эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном биотопе изучены недостаточно. Проведенные ранее исследования моделировали двух-компонентную биологическую систему: эпителиоцит — микросимбионт. Это не позволяло учесть влияние других компонентов микробиоценоза на результат взаимодействия, отдаляя полученные результаты от реальности. Остается не ясным, как в результате взаимодействия эпителиальных клеток с одним типом микросимбионтов изменяется влияние эпителиоцитов на свойства микросимбионтов других типов. Это и определило цель настоящего исследования: изучить закономерности влияния разных типов вагинальных микросимбионтов на способность мукозальных эпителиоцитов влагалища модифицировать биологические свойства бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Влияние на функциональное состояние вагинальных эпителиоцитов оценивали по модификации антагонистических и ростовых свойств вагинальных микросимбионтов под воздействием экзометаболитов вагинальных эпителиоцитов, имевших предварительный контакт с термоинактивированными представителями индигенной и аллохтонной вагинальной микрофлоры.
В качестве представителей индигенной микрофлоры в работе были использованы штаммы Lactobacillus spp., различающиеся по уровню продукции пероксида водорода, выделенные из влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста, в качестве представителей аллохтонной вагинальной микрофлоры — штаммы S.aureus и E.coli, выделенные при воспалительных заболеваниях нижних отделов женского репродуктивного тракта. Бактерии идентифицировали на основании совокупности морфологических, тинкториальных и биохимических свойств [8]. Способность лактобацилл продуцировать Н2О2 определяли ранее описанным способом [3].
Лактобациллы культивировали в бульоне MRS (Sifin, Германия), S. aureus, E. coli — в 2% мясопептонном бульоне (МПБ, НПО Питательные среды, Махачкала) в микроаэро-фильных условиях при 37°С. Термоинактивированные бактерии получали нагреванием взвеси отмытой центрифугированием (3000 g, 5 мин) в 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2) суточной культуры бактерий до 75°C в течение 20 минут с последующим контрольным высевом на плотные питательные среды, и готовили взвесь ~107 кл/мл в 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2).
В работе использованы первичные вагинальные эпителиоциты, полученные с боковых стенок влагалища 48 практически здоровых женщин в первой фазе менструального цикла. Для элиминации сопутствующей микрофлоры эпителиоциты помещали на 1 час в раствор Хенкса, содержащий 50 мкг/мл цефуроксима и 10 мкг/мл лизоцима, после чего трехкратно отмывали десятикратным объемом 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2). Оценку общего количества и процента живых эпителиоцитов проводили путем подсчета в камере Горяева после окрашивания флюорохрома диацетатом при люминесцентной микроскопии [7], после чего готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл в среде Хенкса.
Для изучения влияния микросимбионтов на функциональное состояние вагинальных эпителиоцитов к взвеси эпителиоцитов добавляли термоинактивированные бактерии, соблюдая соотношение эпителиоцит:микроорганизм — 1:10 и инкубировали 4 часа при 37°С. Контролем служили эпителиоциты, подвергнутые воздействию 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2). Затем изучали воздействие фильтратов (мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, фирма Millipore, USA) культуральной жидкости эпителиоцитов на ростовые и антагонистические свойства микросимбионтов, используя ранее описанную методику [9]. Изменение свойств выражали в процентах по отношению к контролю.
При статистической обработке полученных результатов проверка нормальности распределения данных проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовался критерий Манна-Уитни [4]. Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости p принимался равным 0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Предварительный контакт эпителиоцитов с термоинактивированными представителями индигенной вагинальной микрофлоры — лактобациллами приводил к усилению подавляющего влияния на рост S. аигеи и E. coli и в меньшей степени на их антагонистическую активность (табл. 1). При этом интенсивность воздействия на эпителио-циты различалась в зависимости от способности лактобацилл продуцировать пероксид водорода. Клеточные стенки пероксидпродуцирующих лактобацилл влияли на способность эпителиальных клеток подавлять свойства аллохтонной микрофлоры более вы-раженно.
Различные по продукции перекиси водорода эковары лактобацилл усиливали способность эпителиоцитов стимулировать свойства лактобацилл преимущественно своего эковара, одновременно с этим стимуляция свойств лактобацилл иных эковаров была меньше (табл. 1).
Экстраполируя полученные данные на вагинальный микробиоценоз, получаем следующую картину. В норме постоянный контакт с лактобациллами способствует максимальному проявлению вагинальными эпителиоцитами присущей им способности пода-
Таблица 1. Влияние лактобацилл на способность вагинальных эпителиоцитов модифицировать биологические свойства бактерий
Изменение свойств бактерий (% по отношению к контролю) Под влиянием секреторных продуктов эпителиоцитов
интактных после предварительного контакта с термоинактивированными
Lactobacillus spp. Н2О2- Lactobacillus spp. Н2О2 +
S.aureus ростовые свойства -(18,3+1,3) -(25,9+5,2)* -(37,5+8,6)*
антагонизм к Е.соЦ -(28,5+5,7) -(29,5+6,8) -(36,4+8,3)
E.coli ростовые свойства -(14,5+0,7) -(19,1+3,5) -(23,2+2,3)*
антагонизм к З.аигеш -(11,2+2,6) -(12,5+3,3) -(10,9+4,6)
Lactobacillus spp. Н2О2- ростовые свойства +(22,2+3,6) +(52,9+3,9) * +(31,6+12,3)
антагонизм к S.auгeus +(42,3+2,6) +(58,9+4,9)* +(37,5+5,8)
антагонизм к Е.соЦ +(31,9+ 5,5) +(47,3+5,1)* +(23,8+9,3)
Lactobacillus spp. Н2О2+ ростовые свойства +(29,2+6,3) +(30,9+6,1) +(56,8+8,3)*
антагонизм к S.auгeus +(50,3+2,6) +(43,9+3,8) +(72,5+6,3)*
антагонизм к Е.соЦ +(35,7+ 4,1) +(30,3+5,1) +(55,8+6,3)*
Примечание. - Подавление, + стимуляция; * р<0,05 — достоверные различия при сравнении с влиянием секреторных продуктов интактных эпителиоцитов.
Таблица 2. Влияние аллохтонной микрофлоры на способность вагинальных эпителиоцитов модифицировать биологические свойства бактерий
Изменение свойств бактерий (% по отношению к контролю) Под влиянием секреторных продуктов эпителиоцитов
интактных после предварительного контакта с термоинактивированными
S^ureus E.coli
S^ureus ростовые свойства -(18,3±1,3) -(28,9±3,6) * -(25,5± 2,2)*
антагонизм к E.coli -(28,5±5,7) -(36,6±2,6)* -(26,5± 7,3)
E.coli ростовые свойства -(14,5±0,7) -(20,9±3,2)* -(24,1±1,2) *
антагонизм к S.auгeus -(11,2±2,6) -(13,5±1,1) -(19,6±3,9) *
Lactobacillus spp. Н2О2- ростовые свойства +(22,2±3,6) +(43,6±4,3) * +(38,1±7,1) *
антагонизм к S.auгeus +(42,3±2,6) +(49,6±8,9) +(45,5±5,8)
антагонизм к E.coli +(31,9± 5,5) +(36,3±7,1) +(41,3±6,6) *
Lactobacillus spp. Н2О2+ ростовые свойства +(29,2±6,3) +(26,9±8,7) +(31,3±9,7)
антагонизм к S.auгeus +(50,3±2,6) +(61,3±4,7)* +(57,9±5,1) *
антагонизм к E.coli +(35,7± 4,1) +(45,8±5,3)* +(49,8±9,1) *
Примечание. - Подавление, + стимуляция; * р<0,05 —достоверные различия при сравнении с влиянием секреторных продуктов интактных эпителиоцитов.
влять свойства аллохтонной микрофлоры и стимулировать аналогичные показатели нормофлоры.
Предварительный контакт вагинальных эпителиоцитов с представителями аллохтонной вагинальной микрофлоры приводил к усилению подавляющего воздействия секреторных продуктов эпителиоцитов на рост и антагонистическую активность S. аureus и E. coli. Свойства бактерий, которые были использованы для предварительного контакта, в этом случае подавлялись более интенсивно (табл. 2). В отношении индигенной микрофлоры ситуация складывалась следующим образом. В результате предварительного контакта эпителиоцитов с термоинактивированными S. аureus и E. coli мы наблюдали усиление роста культур лактобацилл, не продуцирующих перекись водорода, при этом их антагонистическая активность достоверно не изменялась. Воздействие на пероксидпродуци-рующие лактобациллы модифицировалось противоположным образом — достоверно увеличивалась антагонистическая активность, а ростовые свойства не менялись (табл. 2).
То есть, контакт вагинальных эпителиоцитов с аллохтонной микрофлорой приводил к изменению профиля их секреторных продуктов таким образом, чтобы максимально подавлять свойства конкретного аллохтонного микроорганизма и дифференцированно стимулировать свойства различных по продукции перекиси водорода эковаров вагинальных лактобацилл — усиливая антагонистическую активность пероксидпродуцирующих и ростовые свойства не продуцирующих пероксид водорода лактобацилл. Результатом этого являлось как увеличение антибактериальной активности самих вагинальных эпите-лиоцитов, так и усиление бактериальной составляющей колонизационной резистентности вагинального биотопа.
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследования продемонстрировали функциональную пластичность клеток вагинального эпителия, позволяющую им оптимально приспособиться к взаимодействию с разными эковарами лактобацилл. Однако взаимодействие эпителиоцитов с пероксид-продуцирующими лактобациллами было наиболее эффективным. Это выражалось как в возрастании подавляющего эффекта эпителиоцитов на свойства аллохтонной микрофлоры, так и стимуляции свойств самих лактобацилл. Пока сложно объяснить тот факт, что наибольшую стимуляцию активности эпителиальных клеток, направленной на подавление аллохтонной микрофлоры, вызывают клеточные стенки именно пероксидпродуци-рующих лактобацилл. Выявленные ранее данные о стимуляции экзометаболитами перок-сидпродуцирующих лактобацилл факторов естественной резистентности [2, 3] и антимикробной активности эпителиоцитов [3] в совокупности с полученными в настоящем исследовании результатами позволяют рассматривать способность к продукции пероксида водорода как маркер лактобацилл, обладающих не только особым типом ме-
таболизма, но и имеющих оптимальное для взаимодействия с вагинальными эпителио-цитами строение клеточной стенки. Это заставляет задуматься о перспективе применения для коррекции микроэкологического состояния нижних отделов женского репродуктивного тракта термоинактивированных пробиотических микроорганизмов или фрагментов их клеточных стенок. Подобный подход может позволить повышать колонизационную резистентность биотопа, при этом избегая риска подавления аутоштаммов нормо-флоры.
Использование многокомпонентной модельной системы позволило оценить поведение эпителиальных клеток и нормофлоры в условиях «колонизационного» стресса, вызванного массивным добавлением аллохтонных микроорганизмов. Впервые были показаны две стратегии поведения вагинальных лактобацилл в этих условиях. Так, пероксидпроду-цирующие лактобациллы реагировали на стрессовую ситуацию усилением антагонистической активности при сохранении ростовых показателей, лактобациллы, не обладающие способностью к продукции перекиси водорода, наоборот — активно увеличивали свою численность. Сигналом к реализации этих стратегий поведения лактобацилл служили экзометаболиты эпителиоцитов, вступивших в контакт с аллохтонной микрофлорой. Это согласуется с ключевой ролью, которая отводится эпителиальным клеткам в иммунной защите женского репродуктивного тракта [10, 11].
Одновременное присутствие в биотопе лактобацилл, реализующих в стрессовых ситуациях разную стратегию поведения, повышает шанс на сохранение микроэкологического постоянства вагинального биотопа. Это имеет смысл учитывать при создании новых пробиотических комбинаций.
Таким образом, данные, полученные с использованием многокомпонентной модельной системы, позволяют рассматривать эпителиоциты и нормофлору влагалища как симбио-тическую систему, согласованное взаимодействие компонентов которой обеспечивает поддержание микроэкологического постоянства женского репродуктивного тракта.
Л ИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Особенности эпителиально-бактериальных взаимодействий при бактериальном вагинозе. Журн. микробиол. 2012, 3: 3-8.
2. Бухарин О.В., Сгибнев А.В. Влияние метаболитов Н2О2-продуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима. Журн. микробиол. 2013, 4: 60-64.
3. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В., Черкасов С.В. Участие доминантной микрофлоры в механизмах защиты вагинального биотопа женщин. Журн. микробиол. 2013, 6: 100-104.
4.Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1998.
5. Кремлева Е.А., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Влияние микробно-эпителиальных взаимодействий на биологические характеристики вагинальной микрофлоры. Журн. микробиол. 2011, 2: 53-57.
6. Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Продукция цитокинов вагинальными эпителиоцитами в процессе взаимодействия с доминантными и ассоциативными микросимбионтами. Журн. микробиол. 2012, 4: 114-118.
7. Лимфоциты: Методы. М., Мир, 1990.
8. Определитель бактерий Берджи. М., Мир, 2001.
9. Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2007 (144) 11: 545-548.
10. Wira C. R., Grant-Tschudy K.S., Crane-Godreau M.A. Epithelial cells in the female reproductive tract: a central role as sentinels of immune protection. Am. J. Reprod. Immunol. 2005, 53 (2): 65-76.
11. Wira C.R., Fahey J.V., Ghosh M. et al. Sex hormone regulation of innate immunity in the female reproductive tract: the role of epithelial cells in balancing reproductive potential with protection against sexually transmitted pathogens. Am. J. Reprod. Immunol. 2010, 63: 544-565.
Контактная информация: Черкасов С.В.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
