CC BY
16МИКРОЭКОЛОГИЯ И ТЕРАПИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
О.В.Бухарин, Е.А.Кремлева, А.В.Сгибнев, С.В.Черкасов
РОЛЬ ДОМИНАНТНОЙ МИКРОФЛОРЫ В МЕХАНИЗМАХ ЗАЩИТЫ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Выявление свойств доминантного микросимбионта, возникающих в ходе взаимодействия компонентов ассоциативного симбиоза и обеспечивающих защиту слизистых влагалища от заселения патогенами. Материалы и методы. Были использованы Н2О2-продуцирующие Lactobacillus spp., Corynebacterium spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli и первичные эпителиоциты из нижнего отдела репродуктивного тракта женщин. Оценивали способность Lactobacillus spp. влиять на изменения синтеза коринебактериями ингибиторов каталазы, бактерицидную активность лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов, антимикробную активность первичных вагинальных эпителиоцитов. Также изучали изменение антагонистических и ростовых свойств лактобацилл при взаимодействии с секреторными продуктами Corynebacterium spp., S.aureus, E.coli и вагинальных эпителиоцитов. Результаты. Обнаружено, что экзометаболиты и эпителиоцитов, и коринебактерий в большинстве случаев стимулировали прирост биомассы лактобацилл и увеличивали их антагонистическую активность в отношении S.aureus и E.coli. Метаболиты Н2О2-продуцирующих лактобацилл усиливали синтез антимикробных веществ эпителиоцитами и потенцировали бактерицидность факторов естественной резистентности. Под воздействием метаболитов лактобацилл выявлено увеличение продукции коринебактериями ингибиторов каталазы. Заключение. Симбиотические взаимоотношения доминантных микроорганизмов с организмом хозяина и ассоциантами в условиях ассоциативного симбиоза, приводящие к стимуляции выработки и потенцированию действия факторов антибактериальной защиты, являются основой колонизационной резистентности вагинального биотопа.
Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 100—104
Ключевые слова: ассоциативный симбиоз, антимикробный белок тромбоцитов, вагинальный биотоп, коринебактерии, лактобациллы, лактоферрин, лизоцим, пероксид водорода, эпи-телиоциты
O.V.Bukharin, E.A.Kremleva, A.V.Sgibnev, S.V.Cherkasov
ROLE OF DOMINANT MICROFLORA IN MECHANISMS OF WOMAN VAGINAL BIOTOPE PROTECTION
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Detection of properties of the dominant microsymbiont emerging in the course of interaction of associative symbiosis components and ensuring protection of vaginal mucosa from seeding by pathogens. Materials and methods. H2O2-producing Lactobacillus spp., Corynebacterium spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli and primary epitheliocytes from lower reproductive tract of women were used. The ability of Lactobacillus spp. to influence changes of synthesis of catalase inhibitors by corynebacteria, bactericidal activity of lysozyme, lactoferrin and thrombocyte antimicrobial protein, antimicrobial activity of primary vaginal epitheliocytes was evaluated. Changes of antagonistic and growth properties of lactobacilli during interaction with secretory products of Corynebacterium spp., S. aureus, E. coli and vaginal epitheliocytes were also studied. Results. Exometabolites of both epithe-liocytes and corynebacteria were revealed to stimulate in most cases lactobacilli biomass growth and increased their antagonistic activity against S. aureus и E. coli. Metabolites of H2O2-producing lacto-
bacilli increased synthesis of antimicrobial substances by epitheliocytes and potentiated bactericidity of natural resistance factors. Under the influence of lactobacilli metabolites an increase of production of catalase inhibitors by corynebacteria was revealed. Conclusion. Symbiotic interrelations of dominant microorganisms with host organism and associants under the condition of associative symbiosis leading to stimulation of production and potentiating of the effect of antibacterial protection factors are the basis for colonization resistance of vaginal biotope.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 6, P. 100—104
Key words: associative symbiosis, thrombocyte antimicrobial protein, vaginal biotope, corynebacteria,
lactobacilli, lactoferrin, lysozyme, hydrogen peroxide, epitheliocytes
ВВЕДЕНИЕ
Важное значение в защите слизистых оболочек вагинального биотопа от заселения патогенными микроорганизмами придается преобладающим в нем бактериям рода Lactobacillus [1]. Принято считать, что основой для этого служит способность лактобацилл регулировать численность популяций других видов микроорганизмов за счет продукции молочной кислоты и пероксида водорода. Одновременно с этим in vitro показана крайне низкая бактерицидная и бактериостатическая эффективность этих веществ в тех концентрациях, которые создают лактобациллы [14].
Объяснить стабильность вагинального симбиоза с ее относительным постоянством численности и видового состава микроорганизмов, вероятно, можно с позиций концепции ассоциативного симбиоза, предполагающей наличие механизмов защиты биотопа, обусловленных сложными взаимодействиями хозяина, доминантов и ассоциантов [3].
Высокая частота встречаемости и удельный вес в микробиоценозе влагалища лактоба-цилл позволяют отнести их с точки зрения концепции ассоциативного симбиоза к доминантным микросимбионтам [3]. Однако вопрос о свойствах лактобацилл, определяющих их способность выполнять роль стабильных доминантных микросимбионтов влагалища, обеспечивая эффективную защиту слизистых от заселения патогенами, остается открытым.
В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение механизмов защиты слизистой влагалища от заселения патогенными микроорганизмами, возникающих в условиях взаимодействия хозяина, доминантов и ассоциантов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для оценки биологических свойств доминантных микросимбионтов влагалища изучали изменение антагонистических и ростовых характеристик лактобацилл при взаимодействии с секреторными продуктами ассоциативных бактерий и вагинальных эпителиоци-тов.
Способность лактобацилл влиять на свойства компонентов ассоциативного симбиоза в ходе взаимодействия с ними оценивали по изменению продукции ингибиторов катала-зы ассоциантами, выработке антимикробных веществ клетками хозяина и модификации их бактерицидной активности.
В работе были использованы Corynebacterium spp., S.aureus, E.coli и Н2О2-продуцирую-щие Lactobacillus spp., выделенные из нижнего отдела репродуктивного тракта женщин. Клинические изоляты идентифицировали по совокупности морфологических, тинкто-риальных и биохимических характеристик [11]. Способность лактобацилл продуцировать Н2О2 определяли ранее описанным способом [2].
Лактобациллы культивировали в бульоне MRS («Sifin», Германия), S. aureus, E. coli и коринебактерии — в 2% мясо-пептонном бульоне (МПБ, НПО «Питательные среды», Махачкала) в микроаэрофильных условиях при 37°С. Бактериальные супернатанты получали фильтрованием суточной культуральной жидкости (0,22 мм, Millipore). Термоинактивированные бактерии получали нагреванием взвеси отмытой центрифугированием (3000 g, 5 мин) в 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2) суточной культуры бактерий до 75°C в течение 20 минут с последующим контрольным высевом на плотные питательные среды, после чего готовили взвесь 107 кл/мл в 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2).
В работе использованы первичные вагинальные эпителиоциты, полученные с боковых
стенок влагалища 62 практически здоровых женщин в первой фазе менструального цикла. Для элиминации сопутствующей микрофлоры эпителиоциты помещали на 1 час в раствор Хенкса, содержащий 50 мкг/мл цефуроксима и 10 мкг/мл лизоцима, после чего трехкратно отмывали десятикратным объемом 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2). Оценку общего количества и определение процента живых эпителиоцитов проводили путем подсчета в камере Горяева после окрашивания флюорохромом диацетатом при люминесцентной микроскопии [9], после чего готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл. Экзометаболиты вагинальных эпителиоцитов получали по методике, описанной ранее [10].
При изучении влияния экзометаболитов эпителиоцитов и ассоциативных микросимбионтов на прирост биомассы и антагонистическую активность лактобацилл использовали описанную ранее методику [12]. Изменение антагонизма выражали в процентах угнетения прироста биомассы индикаторной культуры по сравнению с контролем.
Для определения влияния доминантных микросимбионтов на антимикробную активность вагинальных эпителиоцитов к их взвеси добавляли термоинактивированные лакто-бациллы или их супернатанты, соблюдая соотношение эпителиоцит/микроорганизм — 1/10, или микробный супернатант при объемном соотношении микробный супернатант/ взвесь эпителиоцитов — 1/7. Контролем служили эпителиоциты, подвергнутые воздействию среды культивирования лактобацилл и/или 0,1 М ФСБ (рН 7,0 — 7,2). Антимикробную активность эпителиоцитов определяли по задержке прироста биомассы тест-штамма под влиянием эпителиального супернатанта.
В качестве факторов естественной резистентности (ФЕР) использовали яичный лизо-цим («Sigma-Aldrich»), лактоферрин человека («Sigma-Aldrich») и антимикробный белок тромбоцитов человека, полученный ранее описанным способом [7]. Для оценки влияния доминантных микросимбионтов на бактерицидную активность ФЕР предварительно обрабатывали как сами ФЕР, так и взвесь клеток E.coli и S.aureus (~105 КОЕ/мл) метаболитами лактобацилл при объемном соотношении 1/1. В контроле использовали метаболиты лактобацилл, обработанные каталазой (8 U/мл) для удаления из них Н2О2. Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) ФЕР к взвеси тест-штаммов в 0,1 М ФСБ (рН=6,2), содержащей ~105 КОЕ/мл, добавляли равный объем раствора ФЕР в различных концентрациях, инкубируя его в течение часа при 37°С, после чего высевали E.coli на среду Эндо, S.aureus — на МПА, учитывая результаты высева через сутки. Концентрацию белка в препаратах ФЕР до и после контакта с метаболитами лактобацилл определяли по Лоури [13].
Влияние метаболитов доминантов (лактобацилл) на продукцию ингибиторов каталазы ассоциантов (коринебактерий) определяли по их способности ингибировать каталазу [6] после предварительной обработки метаболитами лактобацилл.
Статистическая обработка полученных результатов, проверка нормальности распределения данных проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, а для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовали критерий Манна-Уитни [8]. Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости (p) принимался равным или менее 0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Экзометаболиты первичных вагинальных эпителиоцитов и ассоциативных микросимбионтов оказывали разнонаправленное действие на ростовые свойства лактобацилл. Так, в результате исследований было выявлено, что экзометаболиты эпителиоцитов и корине-бактерий соответственно в 79 и 65% случаев стимулировали прирост биомассы лактобацилл. Напротив, метаболиты S.aureus и E.coli в 64 и 50% случаев соответственно угнетали рост лактобацилл. Следует отметить, что в небольшом количестве случаев (5%) и вагинальные эпителиоциты угнетали прирост биомассы лактобацилл. Исследуемые ассоциативные микроорганизмы практически не отличались по частоте индифферентного влияния на ростовые свойства лактобацилл (Corynebacterium spp. в 35% случаев, S.aureus — 27%, E.coli — 36%).
Воздействие экзометаболитов эпителиоцитов и коринебактерий на лактобациллы приводило к усилению их антагонистической активности к тест-штаммам S.aureus и E.coli. Так, антагонизм лактобацилл в отношении S.aureus в контроле составил 13,5% подавления прироста тест-штамма, тогда как под воздействием экзометаболитов эпителиоцитов и коринебактерий — 41,4 и 51,7%, соответственно. В отношении E.coli антагонизм лакто-
бацилл составил в контроле 25,3% угнетения прироста биомассы, после контакта с метаболитами эпителиоцитов — 38,0%, коринебактерий — 86,3%. Антагонистическая активность лактобацилл под влиянием метаболитов S.aureus и E.coli значимо не изменялась.
Таким образом, основной эффект метаболитов эпителиоцитов и коринебактерий заключался в стимуляции ростовых и антагонистических свойств лактобацилл, а S.aureus и E.coli — в угнетении роста.
При изучении влияния лактобацилл на макропартнера было отмечено усиление бактерицидного эффекта экзометаболитов эпителиоцитов и факторов естественной резистентности. Способность вагинальных эпителиоцитов подавлять прирост биомассы условно патогенных микроорганизмов возрастала при предварительном воздействии термоинак-тивированных лактобацилл и их супернатантов с 5% в отношении S.aureus до 30 и 11%, соответственно. Сходный эффект был обнаружен в отношении E.coli — угнетение прироста биомассы секреторными продуктами эпителиоцитов в контроле составляло 5 %, а после контакта эпителиоцитов с метаболитами лактобацилл — 9%, термоинактивирован-ными бактериями — 15%. Таким образом, лактобациллы стимулировали антимикробную активность вагинальных эпителиоцитов.
Кроме того оказалось, что доминантные микроорганизмы способны были усиливать антимикробный эффект факторов естественной резистентности. Бактерицидность ФЕР после их предварительного контакта с метаболитами вагинальных лактобацилл возрастала, что было продемонстрировано в отношении лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов. Так, МБК лактоферрина в контроле составила для E.coli 47,2±3,6 мкг/мл, после обработки экзометаболитами лактобацилл — 28,6±1,8 мкг/мл, для S.aureus, соответственно, 63,9±5,1 и 49,1±2,3 мкг/мл (р<0.05). Предварительная обработка S.aureus и E.coli секреторными продуктами лактобацилл повышала их чувствительность к действию факторов естественной резистентности. Например, МБК лизоцима в отношении E.coli в контроле составила 107±9,8 мкг/мл, в опыте 88±5,3 мкг/мл, и, соответственно, 93±6,5 и 73±5,9 мкг/мл в отношении S.aureus (р<0,05).
Таким образом, исследуемые лактобациллы обладали способностью стимулировать выработку антимикробных веществ клетками хозяина и потенцировали их эффекты.
В ходе исследований было отмечено усиление способности коринебактерий синтезировать под воздействием метаболитов вагинальных лактобацилл ингибиторы каталазы, потенциально усиливающие бактерицидное действие Н2О2-продуцирующих лактобацилл. Ингибирование активности каталазы тест-штамма S.aureus коринебактериями усиливалось с 37% в контроле до 94% (р<0,05) при предварительном сокультивировании корине-бактерий с супернатантами лактобацилл.
Таким образом, оказалось, что доминанты были способны стимулировать выработку коринебактериями веществ, потенцирующих собственную антагонистическую активность Н2О2-продуцирующих лактобацилл.
ОБСУЖДЕНИЕ
При рассмотрении вагинальных лактобацилл как доминантного вагинального микросимбионта были получены новые данные о механизмах защиты слизистой влагалища от заселения патогенными микроорганизмами, возникающих при взаимодействии хозяина, доминантов и ассоциантов.
Наиболее важным, на наш взгляд, является выявленный в отношении защиты биотопа синергизм взаимодействий доминантов, макропартнера и определенных представителей ассоциативной микрофлоры.
Особый интерес представляют различия в реакции лактобацилл на метаболиты ассоциативных микроорганизмов. Ранее нами было показано [2], что коринебактерии — группа ассоциативных микроорганизмов, присутствие которых в вагинальном биотопе повышает его колонизационную резистентность. Причиной этому, по-видимому, является выявленное в настоящей работе стимулирующее действие коринебактерий на рост и антагонистическую активность лактобацилл. Вместе с тем, разная реакция лактобацилл на Corynebacterium spp., с одной стороны, и S.aureus и E.coli, с другой, может являться отражением феномена микробного распознавания «свой-чужой» [4].
Полученные при изучении взаимодействия хозяина, доминантов и ассоциантов данные могут во многом объяснить эффективность защиты вагинального биотопа от патогенных микроорганизмов за счет усиления антагонистической активности лактобацилл, потен-
цирования действия ФЕР макропартнера и стимуляции выработки антимикробных веществ эпителиальными клетками.
Не менее важной, на наш взгляд, является способность вагинальных лактобацилл отвечать на взаимодействие с компонентами ассоциативного симбиоза влагалища усилением ростовых характеристик. Именно это свойство относительно медленно растущих лактобацилл может повысить их конкурентоспособность в борьбе за колонизацию и/или удержание биотопа с быстро растущими патогенными и условно патогенными микроорганизмами.
Другой особенностью вагинального доминанта оказалась способность стимулировать выработку ассоциативными микросимбионтами ингибиторов каталазы, которые, предотвращая разрушение Н2О2, сохраняют ее концентрацию в бактерицидных для большинства патогенов пределах [5], тем самым способствуя защите биотопа.
По-видимому, возникновение эффективной защиты биотопа только при синергидном взаимодействии всех компонентов является характерной особенностью ассоциативного симбиоза влагалища. Учитывая это, логичным представляется возможность разработки методов оценки и коррекции микроэкологического состояния нижних отделов репродуктивного тракта, включающих не только анализ состояния компонентов, но и эффектов их взаимодействия.
Таким образом, симбиотические взаимоотношения доминантных микроорганизмов с организмом хозяина и ассоциантами в условиях ассоциативного симбиоза, приводящие к стимуляции выработки и потенцированию действия факторов антибактериальной защиты, являются основой колонизационной резистентности вагинального биотопа.
Работа выполнена при поддержке грантов программы инициативных фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-У-4-1023 и программы Президиума РАН№5«Фундаментальные науки — медицине», проект № 12-П-4-1015
Л ИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Валышев А.В., Гильмутдинова Ф.Г. и др. Экология микроорганизмов человека. Екатеринбург, УрО РАН, 2006.
2. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В. Роль ассоциативных микросимбионтов в функционировании ассоциативного симбиоза. Журн. микробиол. 2012, 6: 89-95.
3. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург, УрО РАН, 2007.
4. Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Симбиотические отношения человека и микроорганизмов. Физиология человека. 2012, 1: 128-138.
5. Бухарин О.В., Сгибнев А.В. Влияние метаболитов коринебактерий на антагонистическую активность Н2О2-продуцирующих лактобацилл. Журн. микробиол. 2012, 4: 48-51.
6. Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Иванов Ю.Б. Изменение активности каталазы Staphylococcus aureus ATCC 6538Р под влиянием метаболитов микроорганизмов, выделенных из различных экотопов. Микробиология. 2002, 71 (2): 183-186.
7. Бухарин О.В., Черешнев В.А., Сулейманов К.Г. Антимикробный белок тромбоцитов. Екатеринбург, УрО РАН, 2000.
8. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1998.
9. Клаус Д. (ред.). Лимфоциты. Методы. М., Мир, 1990.
10. Кремлева Е.А., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Влияние микробно-эпителиальных взаимодействий на биологические характеристики вагинальной микрофлоры. Журн. микробиол. 2011, 2: 53-57.
11. Определитель бактерий Берджи. М., Мир, 2001.
12. Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий. Бюлл. эксп. биол. мед. 2007, 11: 545-548.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193 (1): 265-275.
14. Strus M., Brzychczy-Wioch M., Gosiewski T. et al. The in vitro effect of hydrogen peroxide on vaginal microbial communities. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006, 48 (1): 56-63.
Поступила 12.03.13
Контактная информация: Сгибнев А.В.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
